專利名稱：特異性識(shí)別玉米素的核酸適體及其篩選方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種特異性識(shí)別玉米素的核酸適體及其篩選方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
玉米素(Zeatin)是第一種被分離鑒定的天然細(xì)胞分裂素，是植物中分布最普遍的細(xì)胞分裂素。在植物生命過(guò)程中，它具有促進(jìn)細(xì)胞分裂、芽的形成、腋芽生長(zhǎng)、木質(zhì)部分化、種子發(fā)芽、根與葉的成長(zhǎng)，抑制莖的伸長(zhǎng)，阻止老化，維持核酸、蛋白質(zhì)和葉綠體的含量，增強(qiáng)抵抗高低溫能力，加速養(yǎng)分和同化物質(zhì)的移動(dòng)等重要生理作用。玉米素類細(xì)胞分裂素包括順式玉米素、反式玉米素、二氫玉米素及其核苷、核苷酸 衍生物，其中以反式玉米素及其核苷的生物活性最高。目前，玉米素的檢測(cè)方法包括氣質(zhì)聯(lián)用、液質(zhì)聯(lián)用和酶聯(lián)免疫等方法。這些方法雖然具有高的靈敏度及低的檢測(cè)限，但是需要昂貴的設(shè)備及復(fù)雜的前處理過(guò)程。因此，需發(fā)展一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的與玉米素特異識(shí)別的分子用于玉米素的富集、分離及檢測(cè)。核酸適體(aptamer)是一類能特異性結(jié)合祀分子的單鏈核酸序列,包括DNA、RNA>肽核酸或化學(xué)修飾的核酸。核酸適體通過(guò)范德華力、氫鍵或靜電作用與靶分子高親和力，高特異性地相互結(jié)合作用。迄今為止，已篩選出了數(shù)百個(gè)核酸適體，它們的靶物質(zhì)范圍很廣，包括無(wú)機(jī)金屬離子、有機(jī)小分子、生物大分子、以及病毒、細(xì)菌、細(xì)胞和組織切片等。核酸適體的親和力和特異性可以與抗體相媲美，因此它又稱為核酸或者化學(xué)的“抗體”。與單克隆抗體相比，核酸適體具有以下優(yōu)點(diǎn)I)體外篩選,無(wú)需免疫動(dòng)物或細(xì)胞；2)低毒性或免疫源性，良好的水溶性，可以直接進(jìn)行大劑量的皮下靜脈注射；3)可以在生理?xiàng)l件以外的條件下進(jìn)行篩選和應(yīng)用；4)可進(jìn)行大量化學(xué)合成制備，批間差異??；5)容易進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造、修飾、標(biāo)記或固定化；6)穩(wěn)定性好，容易保存和運(yùn)輸；7)分子量小，一般在4-50KD?；谶@些優(yōu)點(diǎn)，核酸適體作為一種新型識(shí)別分子已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)、生物傳感器、疾病治療和診斷等諸多領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種特異性識(shí)別玉米素的核酸適體。本發(fā)明所提供的核酸適體，為序列表的序列I至序列8中任一所示的單鏈DNA片段。所述核酸適體具體可為序列I至序列8中任一所示的DNA片段。核酸適體 I :5' -C ATATGCTTAC^CAGCCATAACAGCTTTAT G-31 (序列 I)核酸適體2 :5, -GAGG ATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGTTTAT CCCC-3'(序列 2)
核酸適體3 :5, -AAGG ATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGTTTAT CCTT-.V (序列 3)核酸適體4:5' -ACGG ATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGTTTAT CCGT-3'(序列 4)核酸適體5:5' -CGG ATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGTTTAT CCG-.V (序列 5)核酸適體6 :5, -GG ATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGTTTAT CC-3'(序列 6)核酸適體7 5' -G ATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGTTTAT c~3'(序列 7)核酸適體8:5' -TGGAGG ATATGGTTCGGCAGGTTTAAGGTTTAT CTCTC-3'(序列 8)其中，每條核酸適體加粗下劃線標(biāo)記部分為保守序列，即所述核酸適體的共有序列。 將所述單鏈DNA片段進(jìn)行修飾或改造得到的核酸適體衍生物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述核酸適體衍生物可為如下任意一種I)將所述核酸適體刪除部分或增加部分核苷酸，得到與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體衍生物；2)將所述核酸適體進(jìn)行核苷酸取代或部分修飾，得到與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體衍生物；3)將所述核酸適體的骨架改造為硫代磷酸脂骨架，得到與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體衍生物；4)將所述核酸適體改為肽核酸，得到與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體衍生物；5)將所述核酸適體的一端或中間接上信號(hào)分子(如熒光素FITC、FAM、羅丹明B、或放射性分子)、活性分子(如生物素、氨基、羧基、酶)或其它功能基團(tuán)后，得到與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體衍生物。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種基于上述核酸適體的核酸探針。本發(fā)明所提供的核酸探針，為核酸探針甲、核酸探針乙、核酸探針丙或核酸探針丁所述核酸探針甲由單鏈DNA片段甲-I和單鏈DNA片段甲_2組成；所述單鏈DNA片段甲-I由序列表中序列I所示的核苷酸組成，且5'末端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3'末端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(核酸適體元件);所述單鏈DNA片段甲-2由9-11個(gè)核苷酸組成，且能與序列表中序列I雜交(互補(bǔ)元件)；所述核酸探針乙由單鏈DNA片段乙-I和單鏈DNA片段乙_2組成；所述單鏈DNA片段乙-I由序列表中序列I所示的核苷酸組成，且5'末端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)(核酸適體元件);所述單鏈DNA片段乙-2由9-11個(gè)核苷酸組成，能與序列表中序列I雜交，且3'末端具有熒光淬滅基團(tuán)(互補(bǔ)元件);所述核酸探針丙由單鏈DNA片段丙-I和單鏈DNA片段丙_2組成；所述單鏈DNA片段丙-I由序列表中序列5所示核苷酸組成，且第21位的T標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)(核酸適體元件)；所述單鏈DNA片段丙-2由9或10個(gè)核苷酸組成，能與序列表中序列5第21-29位或第21-30位核苷酸雜交，且3'末端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(互補(bǔ)元件)；所述核酸探針丁由DNA片段丁組成；所述DNA片段丁為如下al)或a2)al)由序列表中序列5所不核苷酸組成,且第21位的T標(biāo)記有突光報(bào)告基團(tuán)。
a2)由序列表中序列I-序列8中任一所示核苷酸組成，且5'末端標(biāo)記有熒光報(bào)
告基團(tuán)。 在本發(fā)明中，所述單鏈DNA片段甲-2與所述單鏈DNA片段甲-I上任意連續(xù)的9_11個(gè)核苷酸反向互補(bǔ)；所述單鏈DNA片段乙-2與所述單鏈DNA片段乙-I上任意連續(xù)的9_11個(gè)核苷酸反向互補(bǔ)；所述單鏈DNA片段丙-2與所述單鏈DNA片段丙-I上任意連續(xù)的9或10個(gè)核苷酸反向互補(bǔ)。更加具體的，所述單鏈DNA片段甲-2具體由序列9所示核苷酸組成；所述單鏈DNA片段乙-2具體由序列10所示核苷酸組成，且3'末端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；所述單鏈DNA片段丙-2具體由序列11所示核苷酸組成，且3'末端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。序列9:5' -CATAAACCTCT-3'序列10:5' -AACCATATG-3' 序列11:5' -AACCTCTTA-3'所述熒光報(bào)告基團(tuán)具體可為FAM (如6-FAM)、羅丹明B、FITC、TAMRA, Cy3或Cy5。所述熒光淬滅基團(tuán)具體可為BHQl、DABCYL或BHQ2。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種含有所述核酸適體、或所述核酸探針的試劑盒。所述核酸適體、或所述核酸探針，或所述試劑盒在如下任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍( I)鑒定或輔助鑒定玉米素；(2)檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中玉米素濃度； (3)分離和/或富集玉米素。其中，(I)所述的鑒定或輔助鑒定玉米素具體可為檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)是否為或候選為玉米素、檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)是否含有或候選含有玉米素等。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種篩選所述核酸適體的方法。該方法具體可包括如下步驟
(a)以如下核酸文庫(kù)為起始核酸文庫(kù)5' -AAGGAGCAGCGTGGAGGATA(N45)TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3'，其中 N 為 A、T、C 或G；(b)將所述起始核酸文庫(kù)的溶液與固定有非靶標(biāo)分子的微球孵育，分離去除與所述非靶標(biāo)分子結(jié)合的核酸分子，保留與所述非靶標(biāo)分子不結(jié)合的核酸文庫(kù)溶液；(C)將所述與非靶標(biāo)分子不結(jié)合的核酸文庫(kù)溶液與固定有靶標(biāo)分子的微球孵育，分離得到與所述靶標(biāo)分子特異結(jié)合的核酸分子；(d)得到核酸適體；所述靶標(biāo)分子為玉米素分子。所述非靶標(biāo)分子為L(zhǎng)-組氨酸分子和/或玉米素類似物；所述玉米素類似物具體可為腺嘌呤、腺嘌呤核苷、一磷酸腺苷、三磷酸腺苷、乙醇胺和2-甲基烯丙醇中的至少一種。所述微球具體可為為葡聚糖微球。上述方法中，在所述步驟(C)之后、(d)之前，包括至少I次以下操作以與所述靶標(biāo)分子特異結(jié)合的核酸分子為起始文庫(kù)，重復(fù)步驟(b)和(C)，每次操作均以前一次操作中得到的與所述靶標(biāo)分子特異結(jié)合的核酸分子為起始核酸文庫(kù)。上述方法中，可每一輪篩選逐步增加篩選壓力，以增進(jìn)所述核酸適體的富集程度。所述增加篩選壓力可為線性減少核酸文庫(kù)的物質(zhì)的量，線性減少所述固定有靶標(biāo)分子的微球的體積，減少所述核酸文庫(kù)與所述固定有靶標(biāo)分子的微球的孵育時(shí)間，以及相應(yīng)線性增加所述固定有非靶標(biāo)分子的微球的體積，增加所述核酸文庫(kù)與所述固定有非靶標(biāo)分子的微球的孵育時(shí)間。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)物質(zhì)是否含有玉米素的方法。該方法可包括如下(A)或(B)或(C)的步驟(A)將溶液M與上述核酸探針甲溶液混合孵育，作為實(shí)驗(yàn)組；將溶液N與所述核酸探針甲溶液混合孵育，作為對(duì)照組；檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)組和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)；若所述實(shí)驗(yàn)組的熒光信號(hào)顯著低于(統(tǒng)計(jì)學(xué)上在0. 05水平上顯著低于)所述對(duì)照組的熒光信號(hào)，則所述待測(cè)物質(zhì)含有或候選含有玉米素；反之，則所述待測(cè)物質(zhì)不含有或候選不含有玉米素；所述溶液M由所述待測(cè)物質(zhì)和雜交緩沖液組成，所述溶液N為所述雜交緩沖液；
(B)將溶液P與上述核酸探針乙溶液混合孵育，作為實(shí)驗(yàn)組；將溶液Q與所述核酸探針乙溶液混合孵育，作為對(duì)照組；檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)組和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)；若所述實(shí)驗(yàn)組的熒光信號(hào)顯著高于(統(tǒng)計(jì)學(xué)上在0. 05水平上顯著高于)所述對(duì)照組的熒光信號(hào)，則所述待測(cè)物質(zhì)含有或候選玉米素；反之，則所述待測(cè)物質(zhì)不含有或候選不含有玉米素；所述溶液P由所述待測(cè)物質(zhì)和雜交緩沖液組成，所述溶液Q為所述雜交緩沖液；(C)將溶液P與上述核酸探針丙溶液混合孵育，作為實(shí)驗(yàn)組；將溶液Q與所述核酸探針丙溶液混合孵育，作為對(duì)照組；檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)組和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)；若所述實(shí)驗(yàn)組的熒光信號(hào)顯著高于(統(tǒng)計(jì)學(xué)上在0. 05水平上顯著高于)所述對(duì)照組的熒光信號(hào)，則所述待測(cè)物質(zhì)含有或候選玉米素；反之，則所述待測(cè)物質(zhì)不含有或候選不含有玉米素；所述溶液P由所述待測(cè)物質(zhì)和雜交緩沖液組成，所述溶液Q為所述雜交緩沖液。所述步驟(A)- (C)中，所述孵育的條件均具體可為室溫、30分鐘。所述“檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)組和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)”的參數(shù)具體可如下激發(fā)波長(zhǎng)485nm，發(fā)射波長(zhǎng)530nm。具體可米用酶標(biāo)儀SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation, USA)進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)。所述雜交緩沖液的PH可為4. 5-8. 6 (如7. 4)，離子強(qiáng)度為0. 01-2摩爾/升。所述步驟(A)中，具體可將195 u L所述核酸探針甲溶液與5 U L所述溶液M混合，并將195 u L所述核酸探針甲溶液與5 u L所述溶液N混合。所述核酸探針甲溶液具體可由所述核酸探針甲的核酸適體元件、所述互補(bǔ)元件和所述雜交緩沖液組成，所述核酸適體元件的濃度為0. 3 y M，所述互補(bǔ)元件的濃度為I. 2 y M。所述雜交緩沖液具體如下含IOmMNa2HPO4,2mM KH2PO4和150mM NaCl，其余為水，pH7. 4。所述溶液M中，所述待測(cè)物質(zhì)的終濃度可為511] 、1011]\1或5011]\1。所述步驟(B)(或所述步驟(C))中，具體可將195 UL所述核酸探針乙溶液(或所述核酸探針丙溶液)與5 y L所述溶液P混合，并將195 u L所述核酸探針乙溶液(或所述核酸探針丙溶液)與5 u L所述溶液Q混合。所述核酸探針乙溶液(或所述核酸探針丙溶液)具體可由所述核酸探針乙(或所述核酸探針丙)的核酸適體元件、所述互補(bǔ)元件和所述雜交緩沖液組成，所述核酸適體元件的濃度為0.5 PM，所述互補(bǔ)元件的濃度為1.0 PM。所述雜交緩沖液具體如下含IOmM Na2HPO4,2mM KH2POjP 150mMNaCl，其余為水，pH7. 4。所述溶液P中，所述待測(cè)物質(zhì)的終濃度可為10 PM。
本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中玉米素含量的方法。該方法可包括如下(D)或(E)的步驟(D)將待測(cè)物質(zhì)溶液與所述核酸適體溶液孵育，之后加入納米金溶液孵育，之后再加入氯化鈉溶液，肉眼觀察顏色變化，確定所述待測(cè)物質(zhì)中所述玉米素的含量；在本發(fā)明中，所述確定所述待測(cè)物質(zhì)中所述玉米素的含量具體可通過(guò)對(duì)照相同條件下不同濃度玉米素標(biāo)準(zhǔn)品的顏色變化來(lái)確定。(E)將所述核酸探針丁溶液與石墨烯溶液孵育，再將混合溶液與所述待測(cè)物質(zhì)溶液孵育，然后檢測(cè)熒光信號(hào)，確定所述待測(cè)物質(zhì)中所述玉米素的含量。在本發(fā)明中，所述確定所述待測(cè)物質(zhì)中所述玉米素的含量具體可通過(guò)對(duì)照相同條件下不同濃度玉米素標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信號(hào)來(lái)確定，也可將所述待測(cè)物質(zhì)的熒光信號(hào)值代入所述玉米素標(biāo)準(zhǔn)品與熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)曲線中來(lái)確定。 所述步驟(D)和所述步驟(E)中，所述孵育條件均具體可為室溫、30分鐘。所述步驟(D)中，具體可將95 ii L所述核酸適體溶液與5 U L所述待測(cè)物質(zhì)溶液混合，30分鐘后加入95 ii L所述納米金溶液，10分鐘后再加入5 u L所述氯化鈉溶液。所述核酸適體溶液具體可由以上任一所述核酸適體和所述緩沖液組成，所述核酸適體的濃度為0. 15 ii M ;所述緩沖液具體為含15mM Tris-HCl的水溶液，pH7. 4。所述待測(cè)物質(zhì)溶液中，所述待測(cè)物質(zhì)的終濃度可為0-20i! Mjn 1-15UM。所述氯化鈉溶液的濃度可為170mM。所述納米金溶液的濃度可為0. Img / mL。所述步驟(E)中，具體可將170 u L所述核酸探針丁溶液與25 y L所述石墨烯溶液混合，10分鐘后加入5 u L所述待測(cè)物質(zhì)溶液。所述核酸探針丁溶液可由所述核酸探針丁和緩沖液組成，所述核酸探針丁的濃度為0. 5 PM ;所述緩沖液具體如下含IOmMTris-HCl,150mM NaCl、5mM KCl和2mM MgCl2，其它為水，pH7. 4。所述待測(cè)物質(zhì)的濃度可為0-50 y M，如3-50 PM。所述石墨烯溶液的濃度可為0. 7mg / mL。所述“檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)組和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)”的參數(shù)具體如下激發(fā)波長(zhǎng)485nm，發(fā)射波長(zhǎng)500_570nm。具體可采用熒光儀 FL4600 fluorescence spectrometer (Hitachi, Japan)進(jìn)行檢測(cè)。在本發(fā)明中，上述所有的所述玉米素均可為順式玉米素、反式玉米素、二氫玉米素及其核苷、核苷酸衍生物中的至少一種。本發(fā)明所提供的核酸適體以及核酸探針能夠特異性的識(shí)別玉米素，且與反式玉米素及反式玉米素核苷的親和力優(yōu)于順式玉米素及二氫玉米素，可用于檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中是否含有玉米素，及其含量，且本發(fā)明所提供的方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏、快速、特異、成本低等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明在玉米素的分離、富集和檢測(cè)方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值。


圖I為核酸適體隨篩選輪次的富集過(guò)程；柱形圖代表固定有反式玉米素分子的葡聚糖微球與羧基熒光素(FAM)標(biāo)記文庫(kù)，和第2輪至第11輪產(chǎn)物結(jié)合的情況。圖2為核酸適體對(duì)玉米素及其類似物的識(shí)別。圖3為核酸探針甲對(duì)玉米素的響應(yīng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)圖。圖中的5^、10^、50^代表的是反應(yīng)體系中反式玉米素的終濃度。圖4為核酸探針乙對(duì)玉米素的響應(yīng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)圖。
圖5為核酸適體2與納米金共同檢測(cè)不同濃度玉米素的響應(yīng)圖。圖中道夫管上標(biāo)0. 2 u M,0. 5 u MU u M,2 u M,5 u M,6 u M,8 u MUO u MU5 u M 20 y M 表示各自反
應(yīng)體系中反式玉米素的終濃度。圖6為核酸探針丁 _521墨烯共同檢 測(cè)不同濃度玉米素的熒光響應(yīng)圖。在圖6中，對(duì)應(yīng)橫坐標(biāo)525nm波長(zhǎng)處，沿著熒光強(qiáng)度由小到大的順序，12條線所對(duì)應(yīng)的反應(yīng)體系中反式玉米素的終濃度依次為 0. liiM、0. 3iiM、0. 8iiM、2iiM、3iiM、4iiM、5iiM、10iiM、20iiM、30 ii M 和 50 ii M0圖7為核酸探針丁 _521與石墨烯協(xié)作產(chǎn)生的信號(hào)變化對(duì)玉米素的濃度之間的線性關(guān)系。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。順式玉米素(CZ)購(gòu)于青島騰龍微波科技有限公司，反式玉米素(TZ)購(gòu)于北京拓英坊科技有限公司，二氫玉米素(DZ)購(gòu)于北京和諧偉業(yè)化學(xué)科技有限公司，反式玉米素核苷(ZR)北京雷根生物技術(shù)有限公司，腺嘌呤(A)、腺嘌呤核苷(AR)、一磷酸腺苷(AMP)、三磷酸腺苷(ATP)、乙醇胺(AA)、2-甲基烯丙醇(MA)均購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司。結(jié)合緩沖溶液(pH7.4):含 137mM NaCl、2mM MgCl2,2. 7mM KCl、2mM KH2PO4 和 IOmMNa2HPO40洗脫緩沖液(pH8.0):含 25mM Tris-HClUOmM EDTA 和 3. 5M 尿素。實(shí)施例I、玉米素核酸適體的篩選一、L-組氨酸和玉米素的固定將0. 5g環(huán)氧活化Sepharose6B (通用電氣醫(yī)療集團(tuán)，瑞典)微球用IOOmL水反復(fù)洗滌，獲得I. 75mL濕球，然后用0. 2M Na2CO3CpH 乂 12)置換溶脹的微球中的水分，在3. 5mL反應(yīng)體系中加入45mM L-組氨酸或氨基修飾的反式玉米素(合成步驟見下文)，置于室溫條件下振蕩反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后用pH4. 5醋酸鈉緩沖溶液(0. IM醋酸鈉，0. 5M NaCl)和pH12碳酸鈉緩沖溶液(0. 2M NaHCO3 / Na2CO3,0. 5M NaCl ;即用 0. 2M Na2CO3 溶液加 HCl 調(diào)節(jié) pH至12，同時(shí)使NaCl的濃度為0. 5M)反復(fù)交替洗滌微球，最后用水洗滌，并定容至3. 5mL，4°C冰箱保存。所述氨基修飾的反式玉米素具體合成步驟為1、將50mg反式玉米素及IOmg碳酸鉀溶于2mL DMF溶液中，60°C反應(yīng)I個(gè)小時(shí)；2、將20mg N- (2-溴乙基)鄰苯二甲酰亞胺溶于500 u LDMF溶液中，并慢慢滴加至上述I混合液中，60°C反應(yīng)10小時(shí)；3、將反應(yīng)混合液進(jìn)行薄層分離(展開劑二氯甲烷甲醇=體積比5:1)得到中間體I ;4、將IOmg上述所得中間體I溶于2mL乙醇中，將2mL50%水合肼溶液慢慢滴加至中間體I的乙醇溶液中，80°C反應(yīng)2個(gè)小時(shí)；5、將得到的反應(yīng)混合液進(jìn)行高效液相色譜分離(流動(dòng)相甲醇和0. l%(v / v)三氟乙酸水溶液兩者的混合溶液,其中甲醇0. 1%三氟乙酸水溶液=體積比40% 60% ;色譜柱Agela，Venusil XBP C18, 5 u m, IOOA, 10 X 250mm ;流速3. 0 毫升 / 分鐘；檢測(cè)波長(zhǎng)254納米)，收集保留時(shí)間為4. 5min的峰，得到目標(biāo)物氨基修飾的反式玉米素。二、隨機(jī)核酸文庫(kù)的設(shè)計(jì)與合成
設(shè)計(jì)合成兩端包括20個(gè)固定核苷酸、中間包括45個(gè)核苷酸的隨機(jī)文庫(kù)如下5' -AAGGAGCAGCGTGGAGGATA(N45)TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3' ；N45 代表 45 個(gè)隨機(jī)核苷酸序列，即N為A、T、C或G。三、核酸適體的篩選I、文庫(kù)預(yù)處理將約60pmol步驟二設(shè)計(jì)合成的隨機(jī)核酸文庫(kù)溶于結(jié)合緩沖液，95°C變性5min,冰上冷卻15min,室溫放置5min。2、反篩和正篩對(duì)預(yù)處理后的隨機(jī)核酸文庫(kù)進(jìn)行23輪的反篩-正篩(順次完成一次反篩和一次正 篩為一輪篩選)。(I)反篩第I輪篩選，將步驟I預(yù)處理后的隨機(jī)核酸文庫(kù)與步驟一得到的固定有L-組氨酸的微球混合，25°C下孵育I小時(shí)，離心除去L-組氨酸微球。在第2-11輪篩選，將前一輪篩選(正篩)后得到的隨機(jī)核酸文庫(kù)溶液與步驟一得到的固定有L-組氨酸的微球混合，25°C下孵育I小時(shí)，離心除去L-組氨酸微球。(2)正篩將經(jīng)過(guò)反篩過(guò)程得到的溶液與步驟一得到的固定反式玉米素的微球孵育一段時(shí)間(在第12-23輪篩選，將經(jīng)過(guò)反篩過(guò)程得到的溶液中加入ImM腺苷以除去和玉米素類似物結(jié)合的核酸適體)。再用結(jié)合緩沖液清洗微球幾次之后，用洗脫緩沖液在95°C加熱5min，洗脫結(jié)合在玉米素微球上的DNA，測(cè)定洗脫液的熒光強(qiáng)度(除第I輪篩選的隨機(jī)核酸文庫(kù)沒(méi)有進(jìn)行熒光標(biāo)記外，后續(xù)的文庫(kù)均是用帶熒光標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR得到，即2-23輪文庫(kù)均是帶熒光標(biāo)記的)。然后，向洗脫液中加入Iu L糖原(20mg / mL)和4倍體積的酒精，置于-20°C沉淀30min, 12000rpm離心15min,去上清，真空干燥，用100 U Lmillipore水定容。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的引物序列為5，-FAM-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-3，；5’-Biotin-ACCACGACGACACACCCTAA-3’。PCR 擴(kuò)增程序94°C 3min ；94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 30s，10 個(gè)循環(huán)；72°C 5min。用鏈霉親和素瓊脂糖球從PCR產(chǎn)物中分離得到FAM標(biāo)記的單鏈DNA (ssDNA)序列(用鏈霉親和素球可以除去biotin標(biāo)記的互補(bǔ)鏈，從而得到FAM標(biāo)記的目標(biāo)鏈，即2_23輪富集的隨機(jī)核苷酸文庫(kù))。將得到的ssDNA用NAP-5柱子(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)，瑞典)脫鹽，真空干燥，用于下一輪的篩選。為了提高核酸適體的親和力和特異性，在篩選過(guò)程中逐步增加洗滌次數(shù)、減少正篩球用量及與核酸文庫(kù)孵育時(shí)間、增加反篩球用量及與核酸文庫(kù)孵育時(shí)間，以增加篩選的壓力。23輪篩選后，以篩選產(chǎn)物為模板通過(guò)引物(5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-3’和5’ -ACCACGACGACACACCCTAA-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序。最終選擇的核酸適體(Z5和11)如下核酸適體Z5:5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGTTTATCCCCCGTTCTGATCTCTAATTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3’ ；
核酸適體Z7:5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATATGGTTCGGCAGGTTTAAGGTTTATCTCTCATCCTCTCAATAGCACTTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3’ 。核酸適體隨篩選輪次的富集過(guò)程如圖I所示，與反式玉米素微球結(jié)合的核苷酸序列在第5輪時(shí)得到了明顯富集，經(jīng)過(guò)逐步加壓后，結(jié)合序列在第8輪和第11輪又進(jìn)一步得到富集。3、核酸適體的優(yōu)化步驟2得到的核酸適體較長(zhǎng)，經(jīng)結(jié)構(gòu)分析后，設(shè)計(jì)并合成一系列經(jīng)截短的核酸序列，通過(guò)熒光染料修飾，然后考察它們與玉米素微球(步驟一得到的固定有反式玉米素的微球)的結(jié)合能力，挑選結(jié)合能力最強(qiáng)的序列用于進(jìn)一步的應(yīng)用，優(yōu)化后的序列長(zhǎng)度只有31-38個(gè)核苷酸。 最終得到的截短核酸適體序列如下核酸適體I:51 -C ATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGTTTAT G-3'(序列 I)核酸適體2:5, -GAGG ATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGT II M CCCC-3'(序列 2)核酸適體3:5, -AAGG ATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGTTTAT CCTT-3 丨(序列 3)核酸適體4:5, -ACGG ATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGTTTAT CCGT-3'(序列 4)核酸適體5:5' -CGG ATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGTTTAT CCG-3'(序列 5)核酸適體6:5' -GG ATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGTTTAT CC-31 (序列 6)核酸適體7:5' -G ATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGTTTAT C-3'(序列 7)核酸適體8:5' -TGGAGG ATATGGTTCGGCAGGTTTAAGGTTTAT CTCTC-3'(序列 8)其中，每條核酸適體加粗下劃線標(biāo)記部分為保守序列，即所述核酸適體的共有序列。實(shí)施例2、玉米素核酸適體的特異性檢測(cè)I、核酸適體預(yù)處理將0.5UM6-羧基熒光素(6-FAM)標(biāo)記的核酸適體2 (序列2)溶于結(jié)合緩沖液，95°C變性5min，冰上冷卻15min，室溫放置5min。2、核酸適體特異性檢測(cè)將L的玉米素微球(實(shí)施例I中步驟一得到的固定有反式玉米素的微球)與ImM的玉米素(順式玉米素(CZ)、反式玉米素(TZ)、二氫玉米素(DZ)、反式玉米素核苷(ZR))及其類似物(腺嘌呤(A)、腺嘌呤核苷(AR)、一磷酸腺苷(AMP)、三磷酸腺苷(ATP)、乙醇胺(AA)、2_甲基烯丙醇(MA))中的任一種加入到步驟I預(yù)處理后的核酸適體溶液中(玉米素及其類似物作為核酸適體的競(jìng)爭(zhēng)分子)，室溫孵育30min，用洗脫緩沖液在95°C加熱5min,洗脫結(jié)合在玉米素微球上的DNA,在激發(fā)波長(zhǎng)485nm,發(fā)射波長(zhǎng)530nm下,采用酶標(biāo)儀SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation, USA)測(cè)定洗脫液的突光強(qiáng)度。突光強(qiáng)度越低表明核酸適體與該競(jìng)爭(zhēng)分子的結(jié)合越強(qiáng)。同時(shí)設(shè)置未加任何競(jìng)爭(zhēng)分子的實(shí)驗(yàn)組(CN)作為對(duì)照。將CN的熒光強(qiáng)度定為1，計(jì)算其他組的相對(duì)熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié)果如圖2所示，反式玉米素組、反式玉米素核苷組、順式玉米素組和二氫玉米素組熒光值很低，說(shuō)明玉米素類物質(zhì)與核酸適體的結(jié)合很強(qiáng)；腺嘌呤組、腺嘌呤核苷組、一磷酸腺苷組、三磷酸腺苷組、乙醇胺組、2-甲基烯丙醇組熒光值很高，說(shuō)明這些玉米素類似物與核酸適體的結(jié)合很弱。這一結(jié)果表明，該核酸適體具有較強(qiáng)的玉米素特異性。實(shí)施例3、核酸探針的制備

由上海生物工程公司合成如下四組核酸探針核酸探針甲由兩條DNA片段(DNA片段甲-I和DNA片段甲-2)組成；DNA片段甲-I為核酸適體I (序列1)，且其5’末端具有6-FAM (熒光報(bào)告基團(tuán))、3’末端具有BHQl(熒光淬滅基團(tuán))，簡(jiǎn)稱核酸適體元件；DNA片段甲-2為核酸適體I的部分反向互補(bǔ)序列(序列9)，簡(jiǎn)稱互補(bǔ)元件；核酸探針乙由兩條DNA片段(DNA片段乙-I和DNA片段乙-2)組成；DNA片段乙-I為核酸適體I (序列I)，且其5’末端具有6-FAM (突光報(bào)告基團(tuán)),簡(jiǎn)稱核酸適體兀件；DNA片段乙-2為核酸適體I的部分反向互補(bǔ)序列(序列10)，且其3’末端具有BHQl (熒光淬滅基團(tuán))，簡(jiǎn)稱互補(bǔ)元件；核酸探針丙由兩條DNA片段(DNA片段丙-I和DNA片段丙_2)組成；DNA片段丙-I為核酸適體5 (序列5)，且其第21位的T堿基具有6-FAM (熒光報(bào)告基團(tuán))，簡(jiǎn)稱核酸適體元件；DNA片段丙-2為核酸適體的部分反向互補(bǔ)序列(序列11)，且其3’末端具有BHQl(熒光淬滅基團(tuán))，簡(jiǎn)稱互補(bǔ)元件；核酸探針丁 (共9種)由一條DNA片段組成；DNA片段為核酸適體5 (序列5)，且其第21位的T堿基具有6-FAM (熒光報(bào)告基團(tuán))，簡(jiǎn)稱核酸適體元件；該核酸探針丁記為核酸探針丁 _521 ;或DNA片段為核酸適體1_8中任一個(gè)(序列1-8中任一個(gè)),且5’末端具有6-FAM (突光報(bào)告基團(tuán))，簡(jiǎn)稱核酸適體元件；這8個(gè)核酸探針丁，依據(jù)核酸適體的編碼依次記為核酸探針丁-I至核酸探針丁 _8。序列9:5' -CATAAACCTCT-3'序列10:5' -AACCATATG-3'序列11:5' -AACCTCTTA-3'核酸適體探針的檢測(cè)原理如下I、當(dāng)檢測(cè)體系中不存在玉米素時(shí)，核酸適體元件與互補(bǔ)元件雜交，核酸適體元件5’端的熒光報(bào)告基團(tuán)和3’端的熒光淬滅基團(tuán)遠(yuǎn)離，熒光恢復(fù)。當(dāng)檢測(cè)體系中存在玉米素時(shí)，玉米素與核酸適體元件的結(jié)合能力強(qiáng)于互補(bǔ)元件與核酸適體元件的結(jié)合能力，使得熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)接近，從而產(chǎn)生熒光的淬滅。(適用于核酸探針甲)2、當(dāng)檢測(cè)體系中不存在玉米素時(shí)，核酸適體元件與互補(bǔ)元件雜交，核酸適體元件5’端的熒光報(bào)告基團(tuán)和互補(bǔ)元件3’端的熒光淬滅基團(tuán)靠近，熒光被淬滅。當(dāng)檢測(cè)體系中存在玉米素時(shí)，玉米素與核酸適體元件的結(jié)合能力強(qiáng)于互補(bǔ)元件與核酸適體元件的結(jié)合能力，使得熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分離，從而產(chǎn)生明顯的熒光。(適用于核酸探針乙、丙)3、當(dāng)檢測(cè)體系中不存在玉米素時(shí)，核酸適體元件吸附于石墨烯上，核酸適體元件5’端的熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光被淬滅。當(dāng)檢測(cè)體系中存在玉米素時(shí)，玉米素與核酸適體元件結(jié)合，使得核酸適體元件遠(yuǎn)離石墨烯，從而產(chǎn)生明顯的熒光。(適用于核酸探針丁)實(shí)施例4、核酸探針甲對(duì)玉米素的響應(yīng)檢測(cè)探針緩沖液(pH7.4):含 IOmM Na2HPO4,2mM KH2PO4 和 150mM NaCl，其它為水。將實(shí)施例3制備的核酸探針甲進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)
I、制備核酸探針體系核酸探針體系(核酸探針甲溶液)由核酸適體元件、互補(bǔ)元件和探針緩沖液組成，核酸適體元件的濃度為0. 3 ii M，互補(bǔ)元件的濃度為I. 2 ii M。4°C保存。2、取195 UL步驟I制備的核酸探針體系，采用向該溶液中逐漸追加反式玉米素的方式，加入5 UL含有不同濃度反式玉米素的溶液(用探針緩沖液配制，反式玉米素母液的濃度依次分別為200 u M、400 u M、2000 u M,使得反應(yīng)體系中反式玉米素的終濃度依次為5iiM、10iiM、50iiM ;將探針緩沖液作為0濃度對(duì)照)，在室溫下孵育，然后用酶標(biāo)儀SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation, USA)記錄突光動(dòng)態(tài)光譜，激發(fā)波長(zhǎng)485nm,發(fā)射波長(zhǎng)530nm。核酸探針甲的結(jié)果見圖3，隨著玉米素濃度的增加及孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度呈明顯的下降趨勢(shì)，而對(duì)照組(0濃度對(duì)照)的熒光強(qiáng)度基本不變。這一結(jié)果表明，核酸探針甲對(duì)玉米素有很好的響應(yīng)，并且其響應(yīng)信號(hào)隨著玉米素濃度的增大而增大。實(shí)施例5、核酸探針乙或丙對(duì)玉米素的響應(yīng)檢測(cè)探針緩沖液(pH7.4):含 IOmM Na2HPO4,2mM KH2PO4 和 150mM NaCl，其它為水。將實(shí)施例3制備的核酸探針乙或丙進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)I、制備核酸探針體系核酸探針體系(核酸探針乙或丙溶液)由核酸適體元件、互補(bǔ)元件和探針緩沖液組成，核酸適體元件的濃度為0. 5 ii M，互補(bǔ)元件的濃度為I. 0 ii M。4°C保存。2、取195 y L步驟I制備的核酸探針體系，加入5 U L反式玉米素溶液(用探針緩沖液配制，反式玉米素母液的濃度為400 u M，使得反應(yīng)體系中反式玉米素的終濃度為10 y M ;將探針緩沖液作為0濃度對(duì)照)，在室溫下孵育，然后用酶標(biāo)儀SpectraMax M5(Molecular.Devices Corporation, USA)記錄突光動(dòng)態(tài)光譜,激發(fā)波長(zhǎng)485nm,發(fā)射波長(zhǎng)530nm。核酸探針乙的結(jié)果見圖4，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組(玉米素終濃度IOiiM)的熒光強(qiáng)度呈明顯的上升趨勢(shì)，而對(duì)照組(0濃度對(duì)照)的熒光強(qiáng)度基本不變。這一結(jié)果表明，核酸探針乙對(duì)玉米素有很好的響應(yīng)。核酸探針丙與核酸探針乙具有相似的結(jié)果。實(shí)施例6、核酸適體對(duì)不同濃度玉米素的響應(yīng)考察緩沖液(pH7.4):含 15mM Tris-HCl，其它為水。將以上任一所述核酸適體進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)I、制備核酸適體溶液
核酸適體(用緩沖液配制)濃度為0. 15 PM。4°C保存。2、步驟I制備的每種核酸適體溶液分別各取11份，每份95 u L，11份分別加入5 ii L反式玉米素溶液(用緩沖液配制，反式玉米素母液的濃度分別為8 ii M、20 ii M、40 u M、80 u M、200 u M、240 u M、320 u M、400 u M、600 ii M和800 u M,使得反應(yīng)體系中反式玉米素的終濃度依次為 0. 2 ii M、0. 5 ii M、I ii M、2 ii M、5 ii M、6 ii M、8 ii M、10 ii M、15 ii M 和 20 ii M ;將緩沖液作為0濃度對(duì)照),在室溫下孵育30分鐘，然后加入95 ii L濃度為0. Img / mL納米金溶液，孵育10分鐘，之后加入5 u L170mM氯化鈉水溶液，觀察顏色變化。當(dāng)檢測(cè)體系中不存在玉米素時(shí)，核酸適體吸附于納米金表面，當(dāng)加入氯化鈉后，納米金被表面的核酸適體保護(hù)不發(fā)生聚集，從而呈現(xiàn)紫紅色。當(dāng)檢測(cè)體系中存在玉米素時(shí)，玉米素與核酸適體結(jié)合使得核酸適體遠(yuǎn)離納米金，當(dāng)加入氯化鈉后，納米金由于缺少核酸適體的保護(hù)作用而發(fā)生聚集，顏色由紫紅色向灰色轉(zhuǎn)變。核酸適體2 (序列2)對(duì)不同濃度玉米素的響應(yīng)結(jié)果見圖5，從圖中可以看出，核酸適體2對(duì)玉米素有很好的響應(yīng)，并且其信號(hào)隨著玉米素濃度增大而增大。當(dāng)玉米素終濃度 在1-15 ii M范圍內(nèi)，核酸適體2與納米金協(xié)作產(chǎn)生的顏色變化與玉米素的濃度呈現(xiàn)良好的相關(guān)性，即隨著玉米素濃度的增大，反應(yīng)體系的顏色呈現(xiàn)由紫紅色向灰色的梯度轉(zhuǎn)變。核酸適體I和核酸適體3-8與核酸適體2具有相似的結(jié)果。實(shí)施例7、核酸探針丁對(duì)不同濃度玉米素的響應(yīng)考察探針緩沖液(pH7.4):含 IOmM Tris-HClU50mM NaCl、5mM KCl 和 2mM MgCl2，其它為水。將以上所述核酸探針丁進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)I、制備核酸探針體系核酸探針體系(核酸探針丁溶液)由核酸探針丁和探針緩沖液組成，核酸探針丁的濃度為0.5 PM。4°C保存。由9種核酸探針丁制備得到9種核酸探針體系。2、步驟I制備的9種核酸探針體系分別各取12份，每份170 iiL，12份分別與25 u L濃度為0. 7mg / mL石墨烯溶液混合，10分鐘后，分別加入5 u L反式玉米素溶液(用緩沖液配制，反式玉米素母液的濃度分別為4 ii M、12 ii M、32 ii M、80 u M、120 u M、160 u M、200 u M、400 u M、800 u M、1200 y M和2000 u M，使得反應(yīng)體系中反式玉米素的終濃度依次為0. I u M、0. 3 u M、0. 8 ii M、2 ii M、3 ii M、4 ii M、5 ii M、10 ii M、20 ii M、30 ii M 和 50 ii M ;將緩沖液作為0濃度對(duì)照),在室溫下孵育30分鐘,然后用突光儀FL4600fluorescence spectrometer(Hitachi, Japan)記錄熒光光譜，激發(fā)波長(zhǎng)485nm，發(fā)射波長(zhǎng)500_570nm。核酸探針丁 _521對(duì)不同濃度玉米素的響應(yīng)結(jié)果見圖6，從圖中可以看出，核酸探針丁 _521對(duì)玉米素有很好的響應(yīng)，并且其信號(hào)隨著玉米素濃度增大而增大。在3-50 y M范圍內(nèi)，核酸探針丁 _521與石墨烯協(xié)作產(chǎn)生的信號(hào)變化對(duì)玉米素的濃度有很好地線性關(guān)系(圖7)。核酸探針丁 -I至核酸探針丁 -8與核酸探針丁 _521具有相似的結(jié)果。
權(quán)利要求
1.核酸適體，為序列表的序列I至序列8中任一所示的單鏈DNA片段。
2.核酸探針，為核酸探針甲、核酸探針乙、核酸探針丙或核酸探針丁，其特征在于 所述核酸探針甲由單鏈DNA片段甲-I和單鏈DNA片段甲-2組成；所述單鏈DNA片段甲-I由序列表中序列I所示的核苷酸組成，且5'末端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3'末端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；所述單鏈DNA片段甲-2由9-11個(gè)核苷酸組成，且能與序列表中序列I雜交； 所述核酸探針乙由單鏈DNA片段乙-I和單鏈DNA片段乙-2組成；所述單鏈DNA片段乙-I由序列表中序列I所示的核苷酸組成，且5'末端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)；所述單鏈DNA片段乙-2由9-11個(gè)核苷酸組成，能與序列表中序列I雜交，且3'末端具有熒光淬滅基團(tuán)； 所述核酸探針丙由單鏈DNA片段丙-I和單鏈DNA片段丙-2組成；所述單鏈DNA片段丙-I由序列表中序列5所示核苷酸組成，且第21位的T標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)；所述單鏈DNA片段丙-2由9或10個(gè)核苷酸組成，能與序列表中序列5第21-29位或第20-30位核苷酸雜交，且3'末端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)； 所述核酸探針丁由DNA片段丁組成；所述DNA片段丁為如下al)或a2): al)由序列表中序列5所不核苷酸組成,且第21位的T標(biāo)記有突光報(bào)告基團(tuán)。
a2)由序列表中序列I-序列8中任一所不核苷酸組成,且5'末端標(biāo)記有突光報(bào)告基團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸探針，其特征在于所述單鏈DNA片段甲-2與所述單鏈DNA片段甲-I上任意連續(xù)的9-11個(gè)核苷酸反向互補(bǔ)；所述單鏈DNA片段乙-2與所述單鏈DNA片段乙-I上任意連續(xù)的9-11個(gè)核苷酸反向互補(bǔ)；所述單鏈DNA片段丙-2與所述單鏈DNA片段丙-I上任意連續(xù)的9或10個(gè)核苷酸反向互補(bǔ)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸探針，其特征在于所述單鏈DNA片段甲-2由序列表中序列9所示核苷酸組成；所述單鏈DNA片段乙-2由序列表中序列10所示核苷酸組成，且3/末端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；所述單鏈DNA片段丙-2由序列表中序列11所示核苷酸組成，且3'末端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。
5.含有權(quán)利要求I所述核酸適體、或權(quán)利要求2-4中任一所述核酸探針的試劑盒。
6.權(quán)利要求I所述核酸適體、或權(quán)利要求2-4中任一所述核酸探針，或權(quán)利要求5所述試劑盒在如下任一中的應(yīng)用 (1)鑒定或輔助鑒定玉米素； (2)檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中玉米素濃度； (3)分離和/或富集玉米素。
7.篩選權(quán)利要求I所述核酸適體的方法，包括如下步驟 Ca)以如下核酸文庫(kù)為起始核酸文庫(kù) . 5' -AAGGAGCAGCGTGGAGGATA (N45) TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3'，其中 N 為 A、T、C 或 G; (b)將所述起始核酸文庫(kù)的溶液與固定有非靶標(biāo)分子的微球孵育，分離去除與所述非靶標(biāo)分子結(jié)合的核酸分子，保留與所述非靶標(biāo)分子不結(jié)合的核酸文庫(kù)溶液； (c)將所述與非靶標(biāo)分子不結(jié)合的核酸文庫(kù)溶液與固定有靶標(biāo)分子的微球孵育，分離得到與所述靶標(biāo)分子特異結(jié)合的核酸分子； (d)得到核酸適體；所述靶標(biāo)分子為玉米素分子；所述非靶標(biāo)分子為如下物質(zhì)中的至少一種L-組氨酸分子、腺嘌呤、腺嘌呤核苷、一磷酸腺苷、三磷酸腺苷、乙醇胺和2-甲基烯丙醇。
8.鑒定或輔助鑒定待測(cè)物質(zhì)是否含有玉米素的方法，包括如下(A)或(B)或(C)的步驟 (A)將溶液M與權(quán)利要求2或3或4中所述核酸探針甲孵育，作為實(shí)驗(yàn)組；將溶液N與所述核酸探針甲孵育，作為對(duì)照組；檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)組和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)；若所述實(shí)驗(yàn)組的熒光信號(hào)低于所述對(duì)照組的熒光信號(hào)，則所述待測(cè)物質(zhì)含有或候選含有玉米素；反之，則所述待測(cè)物質(zhì)不含有或候選不含有玉米素；所述溶液M由所述待測(cè)物質(zhì)和雜交緩沖液組成，所述溶液N為所述雜交緩沖液； (B)將溶液P與權(quán)利要求2或3或4中所述核酸探針乙孵育，作為實(shí)驗(yàn)組；將溶液Q與所述核酸探針乙孵育，作為對(duì)照組；檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)組和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)；若所述實(shí)驗(yàn)組的熒光信號(hào)高于所述對(duì)照組的熒光信號(hào)，則所述待測(cè)物質(zhì)含有或候選玉米素；反之，則所述待測(cè)物質(zhì)不含有或候選不含有玉米素；所述溶液P由所述待測(cè)物質(zhì)和雜交緩沖液組成，所述溶液Q為所述雜交緩沖液； (C)將所述溶液P與權(quán)利要求2或3或4中所述核酸探針丙孵育，作為實(shí)驗(yàn)組；將所述溶液Q與所述核酸探針丙孵育，作為對(duì)照組；檢測(cè)所述實(shí)驗(yàn)組和所述對(duì)照組的熒光信號(hào)；若所述實(shí)驗(yàn)組的熒光信號(hào)高于所述對(duì)照組的熒光信號(hào)，則所述待測(cè)物質(zhì)含有或候選玉米素；反之，則所述待測(cè)物質(zhì)不含有或候選不含有玉米素；所述溶液P由所述待測(cè)物質(zhì)和雜交緩沖液組成，所述溶液Q為所述雜交緩沖液。
9.檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中玉米素含量的方法，包括如下(D)或(E)的步驟 (D)將待測(cè)物質(zhì)與權(quán)利要求I所述核酸適體孵育，之后加入納米金溶液孵育，之后再加入氯化鈉溶液，觀察顏色變化，確定所述待測(cè)物質(zhì)中所述玉米素的含量； (E)將權(quán)利要求2或3或4中所述核酸探針丁與石墨烯孵育，再將混合溶液與所述待測(cè)物質(zhì)孵育，然后檢測(cè)熒光信號(hào)，確定所述待測(cè)物質(zhì)中所述玉米素的含量。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，或權(quán)利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于所述玉米素為順式玉米素、反式玉米素、二氫玉米素或反式玉米素核苷。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種特異性識(shí)別玉米素的核酸適體及其篩選方法和應(yīng)用。本發(fā)明所提供的核酸適體為序列表的序列1至序列8中任一所示的單鏈DNA片段。本發(fā)明所提供的核酸適體以及基于所述核酸適體的核酸探針能夠特異性的識(shí)別玉米素，且與反式玉米素及反式玉米素核苷的親和力優(yōu)于順式玉米素及二氫玉米素，可用于檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)中是否含有玉米素，及其含量，且本發(fā)明所提供的方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏、快速、特異、成本低等優(yōu)點(diǎn)，在玉米素的分離、富集和檢測(cè)方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102732523SQ20121022835
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月2日
發(fā)明者上官棣華, 乞萃, 劉祥軍, 邴濤 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所