專利名稱：優(yōu)化的乳糖酶基因及其分泌表達方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及乳糖酶優(yōu)化基因,尤其涉及將來源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的乳糖酶原基因進行密碼子優(yōu)化后所得到的乳糖酶優(yōu)化基因，本發(fā)明還涉及該乳糖酶優(yōu)化基因在制備重組乳糖酶中的應用，屬于乳糖酶的制備領域。
背景技術：
乳糖酶(β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，β-D-galactosidegalactohydrolase,EC3. 2. 1.23)具有水解和轉糖苷的雙重作用。一方面，人們利用其水解功能生產(chǎn)低乳糖乳制品來解除乳糖不耐受患者因食用乳制品而引起的多種不良反應；另一方面，可利用其轉糖苷特性的作用生產(chǎn)具有良好保健作用的低聚半乳糖(Hydrolysisof lactose :aliterature review.Journal Name : Process Biochem. ; (United Kingdom) ; Journal Volu-me: 20:11985, Medium: X; Size: Pages: 2-12.) 乳糖酶廣泛存在于植物、微生物以及動物腸道細胞中。目前，商業(yè)化生產(chǎn)的乳糖酶主要來源于曲霉(Aspergillus sp.)和克魯維斯氏酵母(Kluyveromyces sp.)這兩個屬的微生物發(fā)酵?？唆斁S斯氏酵母是從牛乳中分離到的，其產(chǎn)生的乳糖酶最適PH與新鮮牛乳的天然pH(6. 6
6.8)相近，主要適用于分解牛乳及脫脂奶粉中的乳糖，該酶在pH6. 2 7. O穩(wěn)定，6. 2 7. O以上或以下酶活迅速下降。最適溫度為35 40°C。分子量為135kDa。40°C處理lh，pH在6. 5 8. 5之間穩(wěn)定。40°C以上就急劇失活(謝毅等，復旦學報(自然科學版)，1999，Vol. 38，No. 5:523-528)。從曲霉所得的乳糖酶pH較低，而且在高溫下有活性，分子量為106kDa,最適溫度60°C,最適pH在3. 5 5. O。從霉菌來的乳糖酶的最大特點是熱穩(wěn)定性高，最適PH值低，這樣在食品工業(yè)上就不容易受到微生物的污染，更具有應用價值。由于原始菌株生產(chǎn)的乳糖酶產(chǎn)量低，無法滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求，因此本領域研究人員試圖利用基因工程手段來提高乳糖酶的表達量。特別是利用畢赤酵母和曲霉表達系統(tǒng)在提高乳糖酶的表達水平上取得了較大進展。Berka(US 5，736，374)公開了一種提高曲霉乳糖酶表達的方法，該方法將產(chǎn)乳糖酶的米曲霉(A. oryaze)CCC28菌株通過紫外、NTG誘變處理獲得乳糖酶表達量較高的突變株CCC161 (ATCC74285)(親本乳糖酶分泌量為5U/ml，突變株分泌量為50U/ml)，以其為受體，將其自身的乳糖酶基因置于GalA啟動子之下導入其中，所篩選的陽性克隆子中的乳糖酶蛋白表達量為lg/L發(fā)酵液，乳糖酶活性達500U/ml以上，比原始菌提高了 100倍。本發(fā)明人公開了一種性質(zhì)優(yōu)良的乳糖酶編碼基因的克隆、高效表達乳糖酶的重組畢赤酵母的構建以及重組酵母的高密度發(fā)酵大量產(chǎn)生乳糖酶的方法，重組酵母中乳糖酶的表達量可達到6mg/ml發(fā)酵液，酶活達到3600U/ml，高效表達乳糖酶的重組酵母可用來大規(guī)模工業(yè)化廉價生產(chǎn)乳糖酶(授權公告號CN 1233826C，發(fā)明名稱一種重組畢赤酵母乳糖酶及其應用)。Machida, Μ.等報道了一種從米曲霉(Aspergillusoryzae)中分離、克隆的乳糖酶基因(Machida, M. , Asai, K. , Sano, Μ. , et. al, Genomesequencing and analysis of Aspergillus oryzae, Nature, 2005, 438(7071), 1157-1161)，該乳糖酶基因在酵母細胞中的分泌表達水平較低，所表達的乳糖酶酶活不高，限制了其在工業(yè)化擴大生產(chǎn)中的應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種密碼子經(jīng)過改造且mRNA 二級結構穩(wěn)定性好的乳糖酶優(yōu)化基因，該乳糖酶優(yōu)化基因在宿主細胞中的分泌表達量高；本發(fā)明目的之二是提供含有該乳糖酶優(yōu)化基因的重組表達載體以及含有該重組表達載體的重組宿主細胞；本發(fā)明目的之三是將所述乳糖酶優(yōu)化基因以及含有該優(yōu)化基因的重組表達載體和重組宿主細胞應用于生產(chǎn)重組乳糖酶；為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先將米曲霉(Aspergillus oryzae)乳糖酶基因進行修飾改造得到乳糖酶優(yōu)化基因(Iacm)，其核苷酸序列為SEQ ID No. I所示。
本發(fā)明將米曲霉(Aspergillus oryzae)乳糖酶原基因(Iaco) (SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列)在不改變其蛋白質(zhì)氨基酸序列的前提下，綜合考慮密碼子使用頻率，GC含量的調(diào)整，不穩(wěn)定序列的刪除、mRNA 二級結構等影響因素，按照巴斯德畢赤酵母的偏愛密碼子對米曲霉(Aspergillus oryzae)乳糖酶基因(Iaco)進行改造,其中,共改變379個堿基，涉及311個氨基酸，修飾改造后獲得的乳糖酶優(yōu)化基因(Iacm) (SEQID NO. I)的GC含量由51. 5%降為48. 5% ;此外，優(yōu)化后乳糖酶基因的mRNA二級結構自由能也得到了較大幅度的提高，降低了轉錄能量屏障，提高了轉錄效率，有效提高了其在畢赤酵母中的分泌表達量。本發(fā)明另一方面提供了含有所述乳糖酶優(yōu)化基因的重組表達載體以及含有該重組表達載體的重組宿主細胞；優(yōu)選的，所述重組表達載體是重組真核表達載體，更優(yōu)選為重組酵母表達載體，最優(yōu)選為重組畢赤酵母(Pichia pastoris)表達載體。將所述乳糖酶優(yōu)化基因可操作的與酵母的表達調(diào)控序列相連就可得到在酵母細胞中分泌表達乳糖酶的重組酵母表達載體；為了達到更好的分泌表達效果，本發(fā)明優(yōu)選將所述乳糖酶優(yōu)化基因可操作的與畢赤酵母的表達調(diào)控序列相連得到在畢赤酵母細胞中分泌表達重組乳糖酶的重組畢赤酵母表達載體。本發(fā)明所述的酵母包括能夠表達編碼乳糖酶的優(yōu)化基因的各種酵母中的任一種。選擇用于表達重組乳糖酶的合適酵母是在所屬領域的普通技術人員的能力范圍之內(nèi)。在選擇用于表達的酵母宿主中，合適的宿主可包括展示具有例如良好分泌能力、低蛋白水解活性、良好的可溶蛋白產(chǎn)生和總體穩(wěn)固的酵母。這些酵母包括但不限于產(chǎn)子囊酵母(內(nèi)孢霉目(Endomycetales)、擔孢子酵母和屬于半知菌(芽孢綱(Blastomycetes))類的酵母。所述產(chǎn)子囊酵母分為兩科，即蝕精霉科(Spermophthoraceae)和酵母菌科(Saccharomycetaceae)。后者包含四個亞科，Schizosaccharomycoideae (例如裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces))、Nadsonioideae> Lipomycoideae 和 Saccharomycoideae (例如畢赤酵母屬(Pichia)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)和酵母屬(Saccharomyces)。擔孢子酵母包括Leucosporidium屬、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)、Filobasidium 屬和線黑粉菌屬(Filobasidiella)。優(yōu)選的，本發(fā)明所述的酵母為畢赤酵母(Pichia pastoris)。用于酵母表達載體的表達調(diào)控序列對于所屬領域的普通技術人員是眾所周知的，包括但不限于來自諸如以下基因的啟動子區(qū)域醇脫氫酶(ADH)、烯醇化酶、葡糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP或GAPDH)、己糖激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸變位酶和丙酮酸激酶(PYK)。其它用于酵母宿主的合適啟動子序列包括用于 3-磷酸甘油 酸激酶(Hitzeman et al. , J. Biol. Chem. (1980) 255:2073)及其它諸如丙酮酸脫羧酶、磷酸丙糖異構酶和磷酸葡糖異構酶的糖解酶的啟動子(Holland etal. , Biochemistry (1978) 17:4900 ；Hess etal. , J. Adv. ENZYME REG. (1968) 7:149)。酵母增強子也可與酵母啟動子一起使用。此外，合成啟動子也可起到酵母啟動子的作用。酵母啟動子可包括具有結合酵母RNA聚合酶和起始轉錄的能力的天然產(chǎn)生的非酵母來源的啟動子，可包含部分酵母表達載體的其它控制元件包括例如來自GAPDH或烯醇化酶基因的終止子(Holland et al.，J. Biol. Chem. (1981)256:1385)。用于酵母中的合適選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒中的trpl基因，所述trpl基因提供用于缺乏在色氨酸中生長的能力的酵母突變株的選擇標記。進一步的，本發(fā)明提供了一種利用所述的乳糖酶基因生產(chǎn)重組乳糖酶的方法，包括將SEQ ID NO. I所示的乳糖酶優(yōu)化基因可操作性的與表達載體相連接得到重組表達載體；將所述重組表達載體轉化宿主細胞，得到重組菌株；培養(yǎng)重組菌株，誘導重組乳糖酶的表達，回收并純化所表達的重組乳糖酶，即得。上述生產(chǎn)重組乳糖酶的方法中，所述的重組表達載體優(yōu)選為重組真核表達載體，更優(yōu)選為重組畢赤酵母表達載體；所述的宿主細胞優(yōu)選為酵母，更優(yōu)選為畢赤酵母(Pichiapastoris)細胞。將乳糖酶優(yōu)化基因轉化到酵母宿主中的方法對所屬領域的普通技術人員是眾所周知的。舉例而言，酵母轉化可根據(jù)以下文獻中描述的方法進行Hsial et al. , P. Natl.Acad. SCI. USA (1979) 76:3829 和 Van Solingen et al. , J. Bact. (1977) 130:946 ;也可按照通常在 SAMBR00K et al. , Molecular Cloning:A Lab Manual (2001)中所述的方法進行轉化，諸如通過核注射、電穿孔或原生質(zhì)體融合等方式，將乳糖酶優(yōu)化基因引入到酵母細胞中；只要構建了重組宿主細胞菌株(即將重組酵母表達載體引入酵母細胞中并分離具有合適表達載體的重組酵母宿主細胞)，則在適于產(chǎn)生重組乳糖酶的條件下培養(yǎng)重組宿主細胞菌株，培養(yǎng)重組宿主細胞菌株的方法依賴于所用表達載體的性質(zhì)和宿主細胞的特性，這對所屬領域的普通技術人員來說屬于常規(guī)的技術手段，其包括但不限于發(fā)酵罐、振蕩燒瓶、流化床生物反應器、空心纖維生物反應器、轉瓶培養(yǎng)系統(tǒng)和攪拌槽生物反應器系統(tǒng)等方法，這些方法的每一種都可以采用分批、補料或連續(xù)模式等方法進行，同時以分批或連續(xù)型式采集細胞或采集培養(yǎng)物上清液。在含有碳、氮和無機鹽的可吸收源和視情況含有維生素、氨基酸、生長因子及其它眾所周知的蛋白培養(yǎng)補充物的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組宿主細胞。用于培養(yǎng)宿主細胞的液體培養(yǎng)基可視情況含有抗生素或抗真菌劑以防止不希望的微生物生長和/或含有包括但不限于抗生素的化合物以選擇含有表達載體的宿主細胞。用于在酵母宿主細胞中表達異源蛋白的其它方法對所屬領域的普通技術人員是眾所周知的?？稍跀U增階段使用所屬領域的普通技術人員眾所周知的標準補料發(fā)酵法(standard feed batch fermentation method)使酵母宿主菌株在發(fā)酵罐內(nèi)生長。所述發(fā)酵法可經(jīng)調(diào)適以解決特定酵母宿主的碳利用路徑或表達控制模式中的差異。舉例而言，酵母屬酵母宿主的發(fā)酵可能需要單個葡萄糖、復合氮源(例如酪蛋白水解產(chǎn)物)和多種維生素補充。通常為碳的生長限制營養(yǎng)素可在擴增階段加入發(fā)酵罐中以允許最大生長。另外，發(fā)酵法通常應用設計為含有足夠量的碳、氮、基本鹽、磷及其它次要營養(yǎng)素(例如維生素、微量礦物質(zhì)和鹽等)的發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明的重組乳糖酶于重組系統(tǒng)中表達之后進行純化，可以采用多種所屬領域中已知的方法從酵母宿主細胞中純化或濃縮重組乳糖酶，任何以下方法或手段都可用于純化本發(fā)明重組乳糖酶，例如親和色譜、陰離子或陽離子交換色譜(例如DEAESEPHAROSE)、硅膠色譜、反相HPLC、凝膠過濾(例如SEPHADEX G-75)、疏水相互作用色譜、大小排除色譜、金 屬螯合色譜、超濾/透濾、乙醇沉淀、硫酸銨沉淀、色譜聚焦、置換色譜、電泳程序(包括但不限于制備型等電聚焦)、差別溶解性(包括但不限于硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或萃取。舉例而言，可離心或過濾發(fā)酵培養(yǎng)液以去除細胞碎片，將上清液濃縮或稀釋到所要體積或透濾入合適緩沖液中以調(diào)節(jié)制劑以用于進一步純化。更優(yōu)選的，可以將發(fā)酵后的上清液離心去除菌體沉淀，將上清酶液過濾，棄去濾過液，即得到濃縮的酶液；其中，所述的過濾可分為兩次，第一次過濾采用O. Iym微濾膜進行過濾，以除去上清酶液中殘留的細胞碎片和可能存在的雜質(zhì)，收集濾過液；第二次過濾是將第一次的濾過液再經(jīng)過截留分子量為IOkDa的超濾膜進行過濾。除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常所了解相同的含義。術語“酵母宿主”或“酵母宿主細胞”包括可用作或者已經(jīng)用作重組載體或其他轉移DNA的接受體的酵母。所述術語包括已經(jīng)接收重組載體或其它轉移DNA的原始酵母宿主細胞的后代。由于偶然或有意的突變，單個親本細胞的后代可不必在形態(tài)上或與原始親本互補的基因組或總DNA上完全一致。術語“重組宿主細胞”或“宿主細胞”意指包括外源性多核苷酸的細胞，而不管使用何種方法進行插入以產(chǎn)生重組宿主細胞，例如直接攝取、轉導、f配對或所屬領域中已知的其他方法。外源性多核苷酸可保持為例如質(zhì)粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。術語“多核苷酸”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結合特性并以類似于天然產(chǎn)生的核苷酸的方式進行代謝。除非另外特定限制，否則所述術語也意指寡核苷酸類似物，其包括PNA (肽核酸)、在反義技術中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡并密碼子取代)和互補序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產(chǎn)生其中一個或一個以上所選(或所有)密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現(xiàn)簡并密石馬子取代(Batzer et al. , Nucleic Acid Res. 19:5081(1991) ; Ohtsuka et al. , J. Biol.Chem. 260:2605-2608(1985);Cassol et al.，(1992);Rossolini et al. , Mol Cell. Probes8:91-98(1994))。術語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互換使用以意指氨基酸殘基的聚合物。SP，針對多肽的描述同樣適用于描述肽和描述蛋白且反之亦然。所述術語適用于天然產(chǎn)生氨基酸聚合物以及其中一個或一個以上氨基酸殘基為非天然編碼氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述術語涵蓋任何長度的氨基酸鏈，其包括全長蛋白(即抗原)，其中氨基酸殘基經(jīng)由共價肽鍵連接。術語“表達”指外源基因在宿主細胞中的轉錄和/或翻譯。術語“轉化”指將外源基因引入到宿主細胞中的方法。術語“外源基因”指對特定的宿主細胞而言，該基因序列是屬于外來的來源，或是來自相同的來源但其原始序列進行了修飾或改造。


圖I乳糖酶原基因(Iaco)的密碼子使用頻率。圖2本發(fā)明乳糖酶優(yōu)化基因(Iacm)的密碼子使用頻率。
圖3乳糖酶原基因(Iaco) mRNA 二級結構圖。圖4本發(fā)明乳糖酶優(yōu)化基因(Iacm) mRNA 二級結構圖。圖5酵母重組表達質(zhì)粒pPIC9_laco (Iacm)的構建示意圖。圖6轉Iacm和Iaco基因的酵母轉化子的PCR鑒定電泳圖；1 :陰性對照；2_6 :轉乳糖酶優(yōu)化基因(Iacm)酵母轉化子的PCR檢測，以MFl和MRl為引物擴增，擴增出約3kb的Iacm基因全長片段；8-12 :轉乳糖酶原基因(Iaco)酵母轉化子的PCR檢測，以5A0X和MR2為引物擴增，擴增出包括部分啟動子和Iaco基因的約I. 6kb大小的片段；M :lkb DNAmarker。圖7轉Iaco (1#)、轉lacm (Y7#)的酵母菌株3升發(fā)酵罐中乳糖酶酶活結果。圖8Y7#酵母菌株在3升發(fā)酵罐中乳糖酶經(jīng)甲醇誘導不同時間內(nèi)的表達量的SDS-PAGE ；M :蛋白分子量 marker。圖9本發(fā)明所制備的重組乳糖酶水解牛奶的應用效果試驗。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。說明以下具體實施例中所用到重組遺傳學技術均為本領域中的常規(guī)技術。在以下實施例中未作詳細介紹的技術，均按照以下實驗手冊或文獻中的相關章節(jié)或部分來進行，包括Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 3 版· 2001)；Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990) ；CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel et al, 1994)。實施例I乳糖酶基因的優(yōu)化設計和合成I. I菌株和質(zhì)粒米曲霉(Aspergillus oryzae)由本發(fā)明人實驗室保存；大腸桿菌(Escherichia coli)菌株T0P10和克隆載體pSP72購自北京全式金生物技術有限公司；lacm全基因片段由北京奧科生物技術公司合成。I. 2乳糖酶基因的優(yōu)化設計本發(fā)明首先對從米曲霉(Aspergillus oryzae)中克隆獲得的乳糖酶原始基因(Iaco)的序列進行分析，在不改變蛋白質(zhì)氨基酸序列的前提下，綜合考慮密碼子使用頻率，GC含量的調(diào)整，不穩(wěn)定序列的刪除、mRNA 二級結構穩(wěn)定性等影響因素，按照巴斯德畢赤酵母的偏愛密碼子對乳糖酶基因序列進行改造。乳糖酶基因優(yōu)化前后的密碼子使用情況如圖I和圖2所示。米曲霉來源的乳糖酶原基因全長3015bp，共編碼1005個氨基酸。其中前57個堿基編碼的19個氨基酸為信號肽序列。通過GenBankBlast比對，米曲霉來源的乳糖酶原基因與曲霉屬來源的乳糖酶基因相似性最高。乳糖酶原基因在畢赤酵母中表達時需去除自帶的信號肽序列，以表達載體PPIC9上的α因子為信號肽，因此去除自身信號肽的乳糖酶原基因(Iaco)由2958個堿基組成，編碼986個氨基酸(SEQ ID NO. 2)。在不改變氨基酸序列的前提下，本發(fā)明對Iaco基因進行修飾改造，共改變了 379個堿基，涉及311個氨基酸，GC%含量由原來的51. 5%降低為48. 5%(表I)，所得到的乳糖酶優(yōu)化基因(Iacm)序列為SEQID NO. I所示；而且,優(yōu)化后的基因(lacm) (SEQ ID NO. I)通過軟件預測(RNA structure4. 5)，其mRNA 二級結構自由能相比laco (SEQ ID NO. 2)得到了較大幅度的提高，這樣有利于降低轉錄能量屏障，提高轉錄效率，進而提高蛋白表達量(表2)。同時，優(yōu)化前后基因的mRNA的二級結構也發(fā)生了很大的改變，優(yōu)化基因(Iacm)的mRNA二級結構減少了發(fā)夾結構，更加簡單，有利于基因的轉錄(圖3、4)。 表I乳糖酶基因優(yōu)化前后GC含量的變化表
LacoLacm
械基
__數(shù)目百分比數(shù)目百分比
A__720 24.3%__70623.9%
_]C785 26.5%76325.8%
G__740 25.0%__67122.7%
T713 24.1%81827.7%
G+C 1560 51.5%143448.5% 表2 Iaco和Iacm的mRNA 二級結構自由能比較
mRNA自由能
--自由能提高比例
二級結構區(qū)段hcoIacm整體-1025.3 -956.36.7%
___-352__-3L5__10.5%
___-30.6__-205__33.0%注mRNA 二級結構自由能使用RNA structure 4. 5軟件進行計算。I. 3密碼子優(yōu)化后的乳糖酶基因(Iacm)的合成將lacm (SEQ IDN0. I)人工合成后連接在載體pSP72上。實施例2乳糖酶重組畢赤酵母菌株的構建和篩選I. I菌株和質(zhì)粒ToplO大腸桿菌感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司；
表達載體pPIC9和畢赤酵母受體菌株GS115為Invitrogen公司產(chǎn)品。將lacm (SEQ ID NO. I)人工合成后連接在載體pSP72上得到質(zhì)粒pSP72_lacm ；將laco (SEQ ID NO. 2)人工合成后連接在載體pSP72上得到質(zhì)粒pSP72_laco。I · 2試劑、培養(yǎng)基及其他溶液鄰硝基苯β -D-半乳卩比喃糖苷(oNPG)為Applichem公司產(chǎn)品；YPD培養(yǎng)基蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L(固體培養(yǎng)基含I. 5%瓊脂粉)，108°C滅菌15min。IOXYNB (酵母無氨基酸氮源)134g YNB固體溶于IL去離子水，過濾滅菌，4°C保存。
500X生物素生物素20mg/100mL水，過濾滅菌，4°C保存。IOX葡萄糖200g D-葡萄糖溶于IOOOmL水，過濾滅菌，4°C保存。MD 培養(yǎng)基YNB 13. 4g/L，葡萄糖 20g/L，生物素 4X10_4g/L，瓊脂糖 20g/L。MM 培養(yǎng)基YNB 13. 4g/L，甲醇 O. 5%，生物素 4xlO_4g/L，瓊脂糖 20g/L。BMGY 培養(yǎng)基蛋白胨 20g/L，酵母提取物 10g/L，YNB 13. 4g/L，生物素 4X10_4g/L，甘油10ml/L，用pH6. O磷酸鹽緩沖液配制。BMMY 培養(yǎng)基蛋白胨 20g/L，酵母提取物 10g/L，YNB 13. 4g/L，生物素 4xlO_4g/L，甲醇5mL/L，用pH6. O磷酸鹽緩沖液配制。lmol/L山梨醇將182. IgD-山梨醇溶于IL水中，過濾滅菌，4°C保存。Basal salts (發(fā)酵培養(yǎng)基)KH2PO4 12g/L, NH4H2PO4 80g/L, K2SO4 43g/L,MgSO4 · 7H20 26g/L, Ca2SO4 2. 86g/L, KOH 3. 0g/L。發(fā)酵中所用的微量鹽溶液(PTM):硫酸銅4. 0g/L、碘化鈉0. 18g/L、硫酸錳I. 8g/L、鑰酸鈉O. 4g/L、硼酸O. 02g/L、氯化鉆I. 5g/L、氯化鋅10g/L、硫酸亞鐵34g/L、生物素0. 25g/L、硫酸3ml/L ;過濾滅菌，4°C保存。I. 3乳糖酶原基因和優(yōu)化基因酵母重組表達載體的構建分別提取pSP72_lacm和pPIC9質(zhì)粒，并分別用SnaBI和NotI對這兩個重組質(zhì)粒進行雙酶切處理，并將Iacm基因(SEQ IDN0. I)和表達載體pPIC9酶切產(chǎn)物進行回收及連接，通過酶切和測序對陽性克隆進行鑒定，由此構建了酵母重組表達載體pPIC9-lacm(圖5)。參照酵母重組表達載體pPIC9-lacm的構建方法，將乳糖酶原基因(laco) (SEQIDN0. 2)和表達載體pPIC9酶切產(chǎn)物進行回收及連接，通過酶切和測序對陽性克隆進行鑒定，構建得到酵母重組表達載體pPIC9-laco (圖5)。I. 4乳糖酶原基因和優(yōu)化基因在畢赤酵母中的表達用BglII分別酶切重組表達質(zhì)粒pPIC9_lacm和pPIC9_laco，使質(zhì)粒線性化，按照畢赤酵母表達手冊分別將其轉化畢赤酵母宿主菌GS115。以每板200 μ I菌液量涂布于MD平板上，28°C培養(yǎng)至長出轉化子。隨機挑選5個克隆子提取基因組，利用CTAB法提取基因組DNA，然后以基因組DNA為模板，以特異引物進行PCR擴增檢測。對轉乳糖酶原基因(Iaco)酵母基因組的PCR檢測采用Iaco基因內(nèi)部引物MR2 (5’GGTTACCAGCACTGGTAGGAAG)和pPIC9載體啟動子處的引物5A0X(5’ GACTGGTTCCAATTGACAAGC)進行PCR擴增，可擴增出I. 6kb大小的片段；轉優(yōu)化基因(Iacm)的酵母基因組的PCR檢測，以改造基因Iacm的5’端特異引物MF1(5’TCCATCAAG CACCGTTTGAATG)與 3’ 端特異引物 MRl (5，GTAAGCTCCCTTT CTCTGCTCG)進行PCR擴增，可擴增出3kb大小的基因全長片段(圖6)。經(jīng)PCR擴增檢測表明，Iaco和Iacm基因均已成功的轉化到畢赤酵母細胞中。I. 5產(chǎn)乳糖酶重組畢赤酵母在搖床水平的篩選首先采用平板篩選方法對轉化子進行初篩。用無菌牙簽將MD平板上長出來的轉化子復制到具有編號的麗平板上(平板上均勻涂有80 μ I濃度為20mg/ml的Χ-gal)，同時復制在具有相同編號的MD平板上，將MM復制平板和MD復制平板置于28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，陽性菌株在平板上可顯示藍色，據(jù)此確定陽性率及乳糖酶畢赤酵母表達菌株。隨后對平板初篩的轉化子進行復篩。用無菌牙簽將初篩具有酶活的相應克隆挑到IOmL BMGY培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)48h (28°C，200rpm)，然后離心(6000rpm，8min),棄去培養(yǎng)基上清，加入5mL BMMY,搖床培養(yǎng)(28°C,200rpm),期間每隔24h補加O. 5%甲醇，誘導60h后離心(6000rpm,8min,4°C )，收集上清液測定酶活力。復篩結果進行再次重復試驗，確認酶活力。篩選測定了轉Iacm基因的酵母轉化子800個，發(fā)現(xiàn)800個酵母轉化子中平均約有 30%的轉化子(240個)具有乳糖酶的活性。同樣篩選測定了轉乳糖酶原基因(Iaco)的酵母轉化子1000個，發(fā)現(xiàn)1000個酵母轉化子中平均約有28%的轉化子(280個)具有乳糖酶的活性；其中轉Iaco基因的1#轉化子的酶活最高(4321. 8U/ml);轉Iacm的800個酵母轉化子中酶活最高的轉化子Y7#在搖床水平的酶活(1411. 8U/ml)是轉Iaco基因的1#轉化子(433. 6U/ml)的3. 3倍(表3);其中有75%的轉Iacm基因的轉化子的酶活均高于轉Iaco基因的產(chǎn)乳糖酶重組畢赤酵母(其中包括酶活最高的轉Iaco基因的1#轉化子)。乳糖酶活性的定義I個單位的乳糖酶的活性為在pH5. 2、60°C下每分鐘分解鄰硝基苯酚-β -D半乳糖苷(ONPG)生成IymoL鄰硝基酚(ONP)所需的酶量。酶活的測定方法將表達上清用O. lmol/L pH5. 2醋酸緩沖液稀釋，取200 μ L稀釋液加入800 μ L O. 25%0NPG (鄰硝基苯酚-β -D吡喃半乳糖苷，O. lmol/L pH5. 2醋酸緩沖液配制)，60°C水浴15min，加入lmL10%三氯乙酸終止反應，再加入ImL lmol/L碳酸鈉顯色液，OD42tl測定乳糖酶活性，同時以O. lmol/L pH5. 2醋酸緩沖液代替上清稀釋液作為對照，計算水解產(chǎn)物對硝基酚的含量，通過標準曲線算出酶的活性。表3部分轉乳糖酶優(yōu)化基因酵母的酶活測定結果
權利要求
1.乳糖酶優(yōu)化基因，其特征在于其核苷酸序列為SEQID No. I所示。
2.含有權利要求I所述乳糖酶優(yōu)化基因的重組表達載體。
3.根據(jù)權利要求2所述的重組表達載體，其特征在于所述的重組表達載體是重組真核表達載體。
4.根據(jù)權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于所述的重組真核表達載體是重組酵母表達載體。
5.根據(jù)權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于所述的重組酵母表達載體是重組畢赤酵母(Pichia pastoris)表達載體。
6.—種宿主細胞,其特征在于含有權利要求2-5任何一項所述的重組表達載體。
7.根據(jù)權利要求6所述的宿主細胞，其特征在于所述的宿主細胞是酵母細胞；優(yōu)選的，所述的酵母細胞是畢赤酵母(Pichia pastoris)細胞。
8.權利要求I所述的乳糖酶優(yōu)化基因在生產(chǎn)重組乳糖酶中的應用。
9.根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于，包括將SEQID NO. I所示的乳糖酶優(yōu)化基因可操作性的與表達載體相連接得到重組表達載體；將所述重組表達載體轉化宿主細胞，得到重組菌株；培養(yǎng)重組菌株，誘導重組乳糖酶的表達，回收并純化所表達的重組乳糖酶。
10.根據(jù)權利要求9所述的應用，其特征在于所述的重組表達載體為重組真核表達載體，優(yōu)選為重組酵母表達載體，更優(yōu)選為重組畢赤酵母表達載體；所述的宿主細胞優(yōu)選為酵母，更優(yōu)選為畢赤酵母(Pichia pastoris)細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了優(yōu)化的乳糖酶基因及其分泌表達方法和應用。本發(fā)明將源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的乳糖酶基因按照巴斯德畢赤酵母的偏愛密碼子進行改造得到核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示的乳糖酶優(yōu)化基因，優(yōu)化后的乳糖酶基因降低了轉錄能量屏障，提高了轉錄效率，顯著提升了其在畢赤酵母中的分泌表達水平，所表達的重組乳糖酶酶活高。牛奶水解實驗結果表明，本發(fā)明所制備的重組乳糖酶在不同溫度下乳糖水解率均可達到80%以上，水解乳糖效果良好。本發(fā)明為乳糖酶進一步工業(yè)化擴大生產(chǎn)奠定了基礎。
文檔編號C12N1/19GK102776215SQ20121019502
公開日2012年11月14日 申請日期2012年6月13日 優(yōu)先權日2012年6月13日
發(fā)明者劉波, 張偉, 張宇宏, 范云六 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所