專利名稱：一種利用海洋弧菌生產(chǎn)褐藻膠裂解酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及微生物培養(yǎng)基和微生物發(fā)酵工藝；更具體的，本發(fā)明涉及一種利用海洋弧菌生產(chǎn)褐藻膠裂解酶的方法。
背景技術(shù)：
近年來隨著海洋藥物的蓬勃發(fā)展，海藻多糖的研究日益受到重視，褐藻膠便是其中之一。褐藻膠又稱褐藻酸鈉，是從海帶、馬尾藻、巨藻中提取的天然高分子多糖聚合物，主要由兩種糖醛酸單體聚合而成。褐藻膠具有廣泛的應(yīng)用價值，褐藻膠降解物具有很強的生物活性，以酶法降解褐藻膠為代表的生物降解取代傳統(tǒng)的化學降解已成為趨勢。褐藻膠裂解酶通過β -消去機制催化褐藻膠的降解在非還原端C4，5間形成不飽和雙鍵，根據(jù)作用底物的不同可分為甘露糖醛酸裂解酶(EC4. 2. 2. 3)和古羅糖醛酸裂解酶(EC4. 2. 2. 11)。褐藻膠裂解酶可降解藻類細胞壁制備原生質(zhì)體，用于藻類基礎(chǔ)研究，也可用于研究Fucus細胞壁的發(fā)育，甚至作為解聚酶系統(tǒng)的一部分用來研究固氮菌的動力學。另外，褐藻膠裂解酶本身具有一定的藥用價值，褐藻膠裂解酶能降解綠膿桿菌的細胞膜，恢復病原菌對抗生素的敏感性，用于輔助治療綠膿桿菌引起的慢性感染，用其治療肺部囊性纖維化一直是研究褐藻膠裂解酶的重要目標之一。因此褐藻膠裂解酶的研究生產(chǎn)有著深遠的理論意義和應(yīng)用價值。近年來，隨著褐藻膠裂解酶越來越多的應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工、農(nóng)業(yè)、分子生物學、海洋生物學等領(lǐng)域，褐藻膠裂解酶日益成為海洋生物資源研究開發(fā)的競爭熱點。目前國內(nèi)外對褐藻膠低聚糖的研究工作主要集中在1、褐藻膠酵解工藝的研究；2、特定褐藻膠低聚糖分子片段的提取和純化；3、褐藻膠低聚糖的生理活性的開發(fā)和應(yīng)用等方面。迄今為止， 國內(nèi)外市場均未見有褐藻膠裂解酶制劑的產(chǎn)品，也沒有生產(chǎn)性的酶解褐藻膠產(chǎn)物的產(chǎn)品。中國海洋大學從馬尾藻表面分離得到一株產(chǎn)生高效胞外褐藻膠裂解酶的海洋弧菌Vibrio sp. QY102，其產(chǎn)生的褐藻膠裂解酶活性高、pH穩(wěn)定范圍廣，甘露糖醛酸活性高于古羅糖醛酸活性，具有重要的開發(fā)應(yīng)用價值。然而原始菌株在現(xiàn)有培養(yǎng)條件下的產(chǎn)酶量較低，且國內(nèi)外鮮有關(guān)于原始菌株產(chǎn)褐藻膠裂解酶的發(fā)酵研究的報告。建立褐藻膠裂解酶的發(fā)酵工藝對于大規(guī)模生產(chǎn)褐藻膠裂解酶并促進其在工農(nóng)醫(yī)等領(lǐng)域的應(yīng)用十分重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用海洋弧菌生產(chǎn)褐藻膠裂解酶的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種利用海洋弧菌生產(chǎn)褐藻膠裂解酶的方法，該方法包括將海洋弧菌接種到以淀粉為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待海洋弧菌生長到對數(shù)生長期末期時，每1-6小時添加褐藻膠O. 2_6g/L，誘導海洋弧菌生產(chǎn)褐藻膠裂解酶，至發(fā)酵結(jié)束。在一個優(yōu)選例中，所述的海洋弧菌是能以褐藻膠為碳源，在褐藻膠誘導的情況下產(chǎn)生褐藻膠裂解酶的菌。
在另一優(yōu)選例中，所述的海洋弧菌選自海洋弧菌Vibrio Sp.QY102，海洋弧菌 Vibrio sp. QY101,海洋弧菌 Vibrio sp. QY103。在另一優(yōu)選例中，每2-5小時添加褐藻膠O. 3_4g/L，誘導海洋弧菌生產(chǎn)褐藻膠裂解酶。在另一優(yōu)選例中，每3-4小時添加褐藻膠O. 5_3g/L(較佳地,為lg/L)。在另一優(yōu)選例中，所述的以淀粉為碳源的培養(yǎng)基含有可溶性淀粉3_7g/L，蛋白胨2-6g/L，酵母提取物l_6g/L，磷酸二氫鉀l_3g/L，七水硫酸鎂O. 06-0. 20g/L,氯化鈉 20-50g/L,混合于水(較佳地，為去離子水)中。在另一優(yōu)選例中，所述的以淀粉為碳源的培養(yǎng)基含有可溶性淀粉4_6g/L，蛋白胨3-5. 5g/L，酵母提取物I. 5-4g/L，磷酸二氫鉀I. 5-2. 5g/L，七水硫酸鎂O. 08-0. 15g/L，氯化鈉30-50g/L，混合于水中。在另一優(yōu)選例中，所述的以淀粉為碳源的培養(yǎng)基含有可溶性淀粉4.5-5. 5g/L， 蛋白胨4-5g/L，酵母提取物I. 8-3g/L，磷酸二氫鉀I. 5_2g/L，七水硫酸鎂O. 08-0. 12g/L，氯化鈉40-45/L，混合于水中。在另一優(yōu)選例中，先將可溶性淀粉進行糊化處理，再與其它組分混合。在另一優(yōu)選例中，所述的海洋弧菌生長到對數(shù)生長期末期為菌體生長到0D_值 3. 5-4. 5 (較佳地為4. O)的時期。在另一優(yōu)選例中，初始培養(yǎng)時，培養(yǎng)基的pH值是5±1 (較佳地5±0. 5 ;較佳地 5±0· 2)。在另一優(yōu)選例中，初始培養(yǎng)之后的整個培養(yǎng)過程不再調(diào)節(jié)pH值。在另一優(yōu)選例中，將海洋弧菌接種到以淀粉為碳源的培養(yǎng)基中的接種量為3 10% (v/v),如 5% (ν/ν) ο在另一優(yōu)選例中，將按照OD6tltl為2±0. 2的海洋弧菌種子液接種到以淀粉為碳源
的培養(yǎng)基中。在另一優(yōu)選例中，種子培養(yǎng)是在30°C，175r/min搖床培養(yǎng)10 12h ;按照菌體濃度OD6tltl約為2. O的所述種子液接種到發(fā)酵罐中，接種量為3 10% (ν/ν)。在另一優(yōu)選例中，培養(yǎng)條件為30±2°C，350±100r/min，通氣O. 2_2vvm(較佳地， 1±0· 3vvm)，罐壓 O. 02±0· OlMPa0在另一優(yōu)選例中，在發(fā)酵結(jié)束后，還包括步驟從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離或純化褐藻膠裂解酶。在本發(fā)明的另一方面，提供一種培養(yǎng)海洋弧菌的培養(yǎng)基，含有可溶性淀粉3_7g/ L，蛋白胨2-6g/L，酵母提取物l_6g/L，磷酸二氫鉀l_3g/L，七水硫酸鎂O. 06-0. 20g/L，氯化鈉 20-50g/L。在另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)基中，各組分混合于水(較佳地，為去離子水)中。較佳地，先將可溶性淀粉進行糊化處理，再與其它組分混合。在另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)基中，含有可溶性淀粉4_6g/L，蛋白胨3-5. 5g/L， 酵母提取物I. 5-4g/L,磷酸二氫鉀I. 5-2. 5g/L，七水硫酸鎂O. 08-0. 15g/L，氯化鈉30_50g/ L0在本發(fā)明的另一方面，提供所述的培養(yǎng)基的用途，用于培養(yǎng)海洋弧菌生產(chǎn)褐藻膠裂解酶。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖I、發(fā)酵過程每3h添加3g固體褐藻膠的分批發(fā)酵的過程曲線，褐藻膠添加總量見實施例I。圖2、發(fā)酵過程每3h添加Ig固體褐藻膠的分批發(fā)酵的過程曲線，褐藻膠添加總量與實施例I相同。圖3、發(fā)酵過程每3h添加3g固體褐藻膠至發(fā)酵結(jié)束的分批發(fā)酵的過程曲線。圖4、普通分批發(fā)酵過程曲線，褐藻膠在培養(yǎng)基配制時一次性加入。
具體實施例方式針對現(xiàn)有技術(shù)中難以大規(guī)模獲得褐藻膠裂解酶的技術(shù)缺陷，本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，第一次針對褐藻膠裂解酶生產(chǎn)菌株設(shè)計了適合大規(guī)模發(fā)酵的新型培養(yǎng)基，并基于代謝研究開發(fā)了新型的發(fā)酵工藝。如本文所用，術(shù)語“含有”或“包括”包括了 “包含”、“主要由……構(gòu)成(制成)”、 “基本上由......構(gòu)成”、和“由......構(gòu)成”。如本文所用，所述的“海洋弧菌”是能以褐藻膠為碳源，在褐藻膠誘導的情況下產(chǎn)生褐藻膠裂解酶的菌；例如選自:海洋弧菌Vibrio Sp.QY102，海洋弧菌Vibrio sp.QYIOl， 海洋弧菌Vibrio Sp.QY103。所述的海洋弧菌產(chǎn)的褐藻膠裂解酶AlyVIII是一種誘導酶。 褐藻膠既可以作為其生長的底物也可以作為其產(chǎn)酶的誘導物。本發(fā)明人在深入研究后發(fā)現(xiàn)，對于這類海洋弧菌來說，褐藻膠作為碳源相對淀粉來說更易被利用，淀粉也不會阻遏酶表達，在培養(yǎng)基中預加淀粉可以延遲菌體進入衰亡期從而延長菌體的產(chǎn)酶期，并且由于其代謝緩慢而延緩發(fā)酵液PH的上升，更有利于菌體生長。因此，本發(fā)明人采用以下策略來優(yōu)化菌體產(chǎn)酶以淀粉為基礎(chǔ)碳源支持菌體的生長，待菌體進入對數(shù)生長期末期時，菌體濃度已達到一個較高水平(0D_約為4. O)，且菌體活性未出現(xiàn)明顯下降，于此開始添加褐藻膠誘導菌體產(chǎn)酶。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與普通分批發(fā)酵相比，酶產(chǎn)量有很大提高。培養(yǎng)基本發(fā)明人優(yōu)化了用于海洋弧菌發(fā)酵的培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基中包含可溶性淀粉、 蛋白胨、酵母提取物、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂和氯化鈉。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，用于配制本發(fā)明的培養(yǎng)基的各組分的用量如表I所示。表I
權(quán)利要求
1.一種利用海洋弧菌生產(chǎn)褐藻膠裂解酶的方法，其特征在于，該方法包括將海洋弧菌接種到以淀粉為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待海洋弧菌生長到對數(shù)生長期末期時，每1-6小時添加褐藻膠0. 2-6g/L，誘導海洋弧菌生產(chǎn)褐藻膠裂解酶，至發(fā)酵結(jié)束。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的海洋弧菌是能以褐藻膠為碳源，在褐藻膠誘導的情況下產(chǎn)生褐藻膠裂解酶的菌。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，每2-5小時添加褐藻膠0.3-4g/L，誘導海洋弧菌生產(chǎn)褐藻膠裂解酶。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的以淀粉為碳源的培養(yǎng)基含有可溶性淀粉3-7g/L，蛋白胨2-6g/L，酵母提取物l_6g/L，磷酸二氫鉀l_3g/L，七水硫酸鎂0.06-0. 20g/L,氯化鈉20-50g/L，混合于水中。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，先將可溶性淀粉進行糊化處理，再與其它組分混合。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的海洋弧菌生長到對數(shù)生長期末期為 菌體生長到OD600值3. 5-4. 5的時期。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，初始培養(yǎng)時，培養(yǎng)基的pH值是5±1。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)條件為30±2°C，350±100r/min，通氣0.2-2vvm，罐壓 0. 02±0. OlMPa0
9.一種培養(yǎng)海洋弧菌的培養(yǎng)基，其特征在于，含有可溶性淀粉3-7g/L，蛋白胨2-6g/ L，酵母提取物l_6g/L，磷酸二氫鉀l_3g/L，七水硫酸鎂0. 06-0. 20g/L，氯化鈉20_50g/L。
10.權(quán)利要求9所述的培養(yǎng)基的用途，用于培養(yǎng)海洋弧菌生產(chǎn)褐藻膠裂解酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用海洋弧菌生產(chǎn)褐藻膠裂解酶的方法。提供了針對褐藻膠裂解酶生產(chǎn)菌株設(shè)計的適合發(fā)酵以及高產(chǎn)褐藻膠裂解酶的新型培養(yǎng)基，并提供了利用海洋弧菌高產(chǎn)褐藻膠裂解酶的新方法。
文檔編號C12N1/20GK102586216SQ20121006885
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月15日
發(fā)明者周久順, 周祥山, 張元興, 蔡孟浩 申請人:華東理工大學