專利名稱：一種簡單快速同步檢測三種水稻病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種簡單快速同步檢測三種水稻病毒的方法。
背景技術(shù)：
近年來，上世紀(jì)60年代初在江浙一帶發(fā)現(xiàn)的水稻條紋病毒(rice stripe virus, RSV)和水稻黑條矮縮病毒(rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)又在我國多個水稻種植區(qū)流行，僅2004-2005年間水稻條紋病毒在江蘇省的發(fā)病面積就在2000萬畝以上。南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)，又名水稻黑條矮縮病毒2號(Rice black-streaked dwarf virus 2，RBSDV-2)，是最近新發(fā)現(xiàn)的一種重要的水稻病毒，自2001年在廣東陽江市報道以來，2010年已在越南北部和我國華南、 華中、華東等14個省市自治區(qū)發(fā)生，發(fā)病面積達(dá)2000萬畝以上。以上3種重要的水稻病毒均由昆蟲以持續(xù)性方式傳播，且在田間均可感染水稻、玉米、高梁、稗草等一些常見的禾本科作物和雜草。其中，由灰飛虱傳播的水稻條紋病毒、水稻黑條矮縮病毒分屬于纖細(xì)病毒屬 (genus Tenuivirus)禾口呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟(jì)病毒屬(genus Fi jivirus)，由白背飛虱傳播的南方水稻黑條矮縮病毒是呼腸孤病毒科斐濟(jì)病毒屬第二組一個暫定的新成員。從寄主范圍、流行特點、地理分布等流行學(xué)來看，這3種水稻病毒病在我國都曾大面積流行并造成了水稻等作物產(chǎn)量的嚴(yán)重?fù)p失，近年來雖病情指數(shù)有所不同但都常年發(fā)生且發(fā)生地域存在一定的重疊，尤其在我國華東地區(qū)，這給該類病害的診斷、預(yù)測預(yù)報和防控帶來了一定的困難，也對病害的檢測提出了更高的技術(shù)要求。血清學(xué)方法是常用的快速廉價的檢測方法之一，但由于RBSDV與SRBSDV之間存在強烈的血清學(xué)交叉反應(yīng)，目前所制備的多克隆抗體尚不能用來區(qū)分這2種病毒。大量RSV、RBSDV、SRBSDV基因組全序列相繼測定及其登錄和公開促進(jìn)了這些病毒的分子檢測方法的建立，華南農(nóng)大周國輝等]和湖南農(nóng)大周倩等根據(jù)SlO序列分別發(fā)展了巢式和一步RT-PCR方法用于特異性地檢測SRBSDV，江蘇農(nóng)科院季英華等根據(jù)序列差異較多的S9序列發(fā)展了檢測RBSDV和SRBSDV的方法。日本學(xué)者Le et al.采用環(huán)介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增技術(shù)建立了 9種水稻病毒的檢測方法，但這些方法均不能用來同時檢測這3種病毒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供一種快速、準(zhǔn)確、靈敏且同步檢測這3種重要水稻病毒的方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案這種簡單快速同步檢測三種水稻病毒的方法，應(yīng)用一套病毒特異性引物以待測樣品總RNA為模板進(jìn)行一步RT-PCR擴(kuò)增，該引物共有6條，它們的基因序列表示如下DRS-1，5，-CACTCTAGCTGATTTGCAGAAGGCA-3，；DRS-2,5' -GGTCTTCACTTTCCCATTGGTGATG-3 ；
DRB-1，5，-ACTAAGCTTATTTGCTACCTCCAAAC-3，；DRB-2，5，-ATTAGTRCGCAAMGTGGACAAACTG-3，(R = A, G ;M = A, C)；DSR-1，5，-CGCTTTAGATGCTGACAAATCACTTTTA-3，；DSR-2，5 ’ -CTCCTTTTCTAAGTGCAGACAGTCC-3 ’。最后通過凝膠電泳條帶以判斷水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)、水稻條紋病毒(RSV) 以及南方水稻黑條矮縮病毒(SRBSDV)的侵染狀況，其具體包括以下步驟1)引物設(shè)計通過分析GenBank數(shù)據(jù)庫公布和本實驗室測定的水稻黑條矮縮病毒、水稻條紋病毒以及南方水稻黑條矮縮病毒外殼蛋白的基因，獲得3種病毒種內(nèi)保守種間呈多態(tài)性的區(qū)域，并應(yīng)用I^rimere. 0程序設(shè)計針對3種水稻病毒的6條特異性引物，這些引物在上海生工生物工程服務(wù)有限公司合成；2)樣品總RNA提取對于水稻等植物樣品，取0. Ig病株或健株葉片于研缽中加液氮研磨成粉狀，轉(zhuǎn)入1. 5mL離心管后，再加入ImL TRIzol試劑(Invitrogen)；對于飛虱樣品，取單頭蟲體，置于1.5mL離心管中，加入500 μ L TRIzol試劑Qnvitrogen)，再用經(jīng)過高溫處理的玻棒將蟲體充分研磨；此后的操作均按TRIzoI試劑使用說明書提取總RNA 振蕩混勻后，加入氯仿0. 2ml，混勻后靜置3 5min ； 12000g離心lOmin，取上清至新離心管并加入等體積的異丙醇，混勻后12000g，4°C條件下離心lOmin，棄上清，沉淀用70%乙醇洗2 次，干燥后將沉淀溶于無RNase的ddH20中，提取的總RNA保存于_80°C冰箱中備用；3)擴(kuò)增反應(yīng)采用One Step RT-PCRKit (寶生物工程(大連)有限公司)以樣品總RNA提取物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)總體積50 μ L，內(nèi)含樣品總RNA抽提物5 μ L，其他各組分參照試劑盒說明，包括:2Χ反應(yīng)緩沖液25 μ L，6條引物各1 μ L，酶混合物2 μ L，再添加無RNase的ddH20至總體積50 μ L，反應(yīng)程序為50°C反轉(zhuǎn)錄30min ；94°C預(yù)變性^iiin ；94°C 變性30s，63°C退火30s，72°C延伸30 60s, 30個循環(huán)；72°C延伸IOmin ；4)電泳分析取擴(kuò)增產(chǎn)物5yL，點樣至1.2%的瓊脂糖凝膠上樣孔中，以 DL2000DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量作為參照，在120伏的電壓下于IXTAE電泳緩沖液中電泳30 60min, EB染色后在紫外燈下觀察，記錄并分析與預(yù)期片斷大小的一致性。引物合成后通過梯度PCR確定引物的最適退火溫度為63°C，如圖1所示；其中 DRS-I和DRS-2特異性地擴(kuò)增RSV的核衣殼蛋白基因，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為757bp ；DRB-I和 DRB-2特異性地擴(kuò)增RBSDV的主要外層衣殼蛋白基因，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為592bp ；DSR-I和 DSR-2特異性地擴(kuò)增SRBSDV的主要外層衣殼蛋白基因，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為142bp。發(fā)明有益的效果是本發(fā)明針對生產(chǎn)實際，發(fā)展建立了一種快速、準(zhǔn)確、靈敏且同步檢測這3種重要水稻病毒的方法，并成功應(yīng)用于單頭飛虱以及田間樣品的檢測和診斷， 為水稻黑條矮縮病、條紋病、南方黑條矮縮病的準(zhǔn)確診斷、預(yù)測預(yù)報和科學(xué)防控提供了技術(shù)支撐。


圖1顯示在梯度退火溫度(Tm)條件下RT-PCR的擴(kuò)增效率。其中M表示DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000 ；泳道1-12分別為在Tm = 59. 8 72. 0°C條件下的擴(kuò)增產(chǎn)物；圖2為本檢測方法特異性和靈敏毒分析。其中M表示DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000 ；泳道1 3為引物DRB-1/DRB-2依次擴(kuò)增RBSDV，SRBSDV和RSV標(biāo)準(zhǔn)樣品；泳道4 6為弓丨物DRZ-1/DRZ-2依次擴(kuò)增RBSDV，SRBSDV和RSV標(biāo)準(zhǔn)樣品；泳道7 9為引物DRS-1/DRS-2 依次擴(kuò)增RBSDV，SRBSDV和RSV標(biāo)準(zhǔn)樣品；泳道10 12為三對混合引物依次擴(kuò)增RBSDV， SRBSDV和RSV標(biāo)準(zhǔn)樣品；泳道13-16為三對混合引物擴(kuò)增RBSDV、SRBSDV, RSV混合樣品； 泳道17 28為三對混合引物擴(kuò)增按1 10比例梯度稀釋的RBSDV、SRBSDV和RSV混合樣
P
m ；圖3是本方法在不同來源的樣品檢測中的應(yīng)用。其中M為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000 ； 泳道1為健康水稻樣品；泳道2-8為水稻病株樣品；泳道9-10為玉米病株樣品；泳道11為健康無毒灰飛虱樣品；泳道12-14為灰飛虱樣品；泳道15-16為白背飛虱樣品；泳道17為健康無毒白背飛虱樣品。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明實施例1 植物樣品的檢測。植物樣品選取田間疑似病毒侵染的水稻、玉米病株樣品主要于2008-2011年間采集自我國浙江、山東、湖北、湖南、廣東、上海等省市以及越南北部省市，并保存于-80°C冰箱。引物設(shè)計通過分析GenBank數(shù)據(jù)庫公布和本實驗室測定的水稻黑條矮縮病毒、 水稻條紋病毒以及南方水稻黑條矮縮病毒外殼蛋白的基因，獲得3種病毒種內(nèi)保守種間呈多態(tài)性的區(qū)域，并應(yīng)用I^rimere. 0程序設(shè)計針對3種水稻病毒的6條特異性引物，這些引物在上海生工生物工程服務(wù)有限公司合成。植物材料總RNA提取對于水稻、玉米等植物樣品，取0. Ig葉片于研缽中加液氮研磨成粉狀，轉(zhuǎn)入1. 5mL離心管后，再加入ImL TRIzol試劑Qnvitrogen)，振蕩混勻后，加入氯仿0. anl，混勻后靜置3-5min ； 12000g離心lOmin，取上清至新離心管并加入等體積的異丙醇，混勻后12000g，4°C條件下離心lOmin，棄上清，沉淀用70%乙醇洗2次，干燥后將沉淀溶于無RNase的(MH2O中，提取的總RNA保存于_80°C冰箱中備用。擴(kuò)增反應(yīng)反應(yīng)總體積50 μ L，內(nèi)含樣品總RNA抽提物5 μ L，2X反應(yīng)緩沖液 25 μ L，6條引物各1 μ L，酶混合物2 μ L，再添加無RNase的ddH20至總體積50 μ L。反應(yīng)程序為 50°C反轉(zhuǎn)錄 30min ；94°C預(yù)變性 2min ；94°C變性 30s，63°C退火 30s，72°C延伸 30 60s， 30個循環(huán)；72°C延伸IOmin。電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μ L，點樣至1. 2%的瓊脂糖凝膠上樣孔中，以 DL2000DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量作為參照，在120伏的電壓下于IXTAE電泳緩沖液中電泳30 60min, EB染色后在紫外燈下觀察，記錄并分析與預(yù)期片斷大小的一致性，部分電泳鑒定圖片見圖3泳道1-10。結(jié)果分析根據(jù)電泳結(jié)果可判斷植物樣品是否存在上述3種病毒的侵染，若被侵染，是何種病毒侵染。例如僅擴(kuò)增出592bp的條帶，表明該植物樣品存在RBSDV侵染(見圖 3，泳道2、8-10)；僅擴(kuò)增出142bp條帶的樣品，表明該植物樣品存在SRBSDV侵染(見圖3， 泳道幻；僅擴(kuò)增出757bp條帶的樣品，表明該植物樣品存在RSV侵染(見圖3，泳道4)。依次類推，擴(kuò)增出592bp和142bp條帶的樣品，表明該植物樣品存在RBSDV和SRBSDV復(fù)合侵染 (見圖3，泳道5)；擴(kuò)增出757bp和142bp條帶的樣品，表明該植物樣品存在RSV和SRBSDV復(fù)合侵染(見圖3，泳道6-7)。實施例2 單頭飛虱樣品的檢測。飛虱樣品灰飛虱和白背飛虱樣品主要于2008-2011年間采集自浙江、海南、湖南、上海、山東等省市，部分飛虱在水稻苗上飼養(yǎng)，余下保存于70%乙醇中備用。引物設(shè)計通過分析GenBank數(shù)據(jù)庫公布和本實驗室測定的水稻黑條矮縮病毒、 水稻條紋病毒以及南方水稻黑條矮縮病毒外殼蛋白的基因，獲得3種病毒種內(nèi)保守種間呈多態(tài)性的區(qū)域，并應(yīng)用I^rimere. 0程序設(shè)計針對3種水稻病毒的6條特異性引物，這些引物在上海生工生物工程服務(wù)有限公司合成。飛虱總RNA提取取單頭蟲體，置于1.5mL離心管中，加入500 μ L TRIzol試劑 anvitrogen)，再用經(jīng)過高溫處理的玻棒將蟲體充分研磨；振蕩混勻后，加入氯仿0. Iml, 混勻后靜置3-5min ； 12000g離心lOmin，取上清至新離心管并加入等體積的異丙醇，混勻后 12000g, 4°C條件下離心lOmin，棄上清，沉淀用70%乙醇洗2次，干燥后將沉淀溶于無RNase 的ddH20中，提取的總RNA保存于_80°C冰箱中備用。擴(kuò)增反應(yīng)反應(yīng)總體積50 μ L，內(nèi)含樣品總RNA抽提物5 μ L，2X反應(yīng)緩沖液 25 μ L，6條引物各1 μ L，酶混合物2 μ L，再添加無RNase的ddH20至總體積50 μ L。反應(yīng)程序為50°C反轉(zhuǎn)錄30min ；94°C預(yù)變性^iiin ；94°C變性30s，63°C退火30s，72°C延伸30 60s, 30 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin0電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物取擴(kuò)增產(chǎn)物5μ L，點樣至1. 2%的瓊脂糖凝膠上樣孔中，以 DL2000DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量作為參照，在120伏的電壓下于IXTAE電泳緩沖液中電泳30 60min,EB染色后在紫外燈下觀察，記錄并分析與預(yù)期片斷大小的一致性。部分電泳鑒定圖片見圖3泳道11-17。結(jié)果分析根據(jù)電泳結(jié)果可單頭飛虱物樣品中是否攜帶上述3種病毒，若攜帶的話，又?jǐn)y帶何種病毒侵染。例如僅擴(kuò)增出757bp條帶的灰飛虱樣品，表明該頭灰飛虱攜帶 RSV(見圖3，泳道12)；僅擴(kuò)增出142bp條帶的灰飛虱和白背飛虱樣品，表明該頭灰飛虱和白背飛虱均攜帶有SRBSDV(見圖3，泳道14、16)；僅擴(kuò)增出592bp條帶的白背飛虱樣品，表明該頭白背飛虱樣品攜帶有RBSDV (見圖3，泳道1 。依次類推，擴(kuò)增出592bp和757bp條帶的灰飛虱樣品，表明該頭灰飛虱同時攜帶了 RBSDV和RSV 2種病毒(見圖3，泳道13)。檢測特異性和靈敏度分析先利用上述3對引物分別對3種病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行一步法 RT-PCR擴(kuò)增(結(jié)果見圖 2，泳道 1-9)，引物對DRB-I/DRB-2、DRZ-I/DRZ-2、DRS-I/DRS-2 均僅能在相應(yīng)的病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品中擴(kuò)增到預(yù)期大小的條帶。接著利用等比例混合的3對引物并分別以RSV、RBSDV、SRBSDV標(biāo)準(zhǔn)樣品及其混合物作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(結(jié)果見圖2，泳道10-16)，利用3對混合引物在RSV、RBSDV、SRBSDV樣品同樣可擴(kuò)增到特異的預(yù)期大小的片斷；在混合樣品中，無論是2種樣品混合還是3種樣品混合，都僅能檢測到預(yù)期大小的相應(yīng)片斷。而利用這些引物在其它植物病毒如RGDV、RRSV、TMV、PVY樣品中均與健康水稻樣品一樣檢測不到任何預(yù)期大小的特異性條帶。為了更準(zhǔn)確地分析特異性，我們還對各引物在部分水稻病株樣品中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了測序分析，比對結(jié)果各擴(kuò)增產(chǎn)物序列與對應(yīng)病毒相應(yīng)區(qū)域的序列同源性在98%以上。這些結(jié)果表明，本方法可特異性地用于檢測RSV、RBSDV、 SRBSDV0在此基礎(chǔ)上，我們又采用梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)樣品的方式對該方法的靈敏度進(jìn)行了分析 (結(jié)果見圖2，泳道17-28)，當(dāng)稀釋至1/10000，仍可有效檢測，表明本方法具有較高的靈敏
除上述實施例外，本發(fā)明還可以有其他實施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種簡單快速同步檢測三種水稻病毒的方法，其特征是該檢測方法應(yīng)用一套病毒特異性引物以待測樣品總RNA為模板進(jìn)行一步RT-PCR擴(kuò)增，該引物共有6條，分別為 DRS-I、DRS-2、DRB-I、DRB-2、DSR-I以及DSR-2，它們的基因序列如序列表所示，最后通過凝膠電泳條帶判斷水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)、水稻條紋病毒(RSV)以及南方水稻黑條矮縮病毒(SRBSDV)的侵染狀況。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的簡單快速同步檢測三種水稻病毒的方法，具體包括以下步驟1)引物設(shè)計通過比對分析RBSDV、RSV以及SRBSDV外殼蛋白的基因，獲得3種病毒種內(nèi)保守種間呈多態(tài)性的區(qū)域，設(shè)計針對3種水稻病毒的6條特異性引物；2)樣品總RNA提取將待測樣品置于1.5mL離心管中，加入TRIzol試劑，提取總RNA保存于-80°C冰箱中備用；3)擴(kuò)增反應(yīng)采用OneStep RT-PCR Kit以樣品總RNA提取物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)總體積50μ L，內(nèi)含樣品總RNA抽提物5 μ L，其他各組分參照試劑盒說明，包括2 X反應(yīng)緩沖液25 μ L，6條引物各1 μ L，酶混合物2 μ L，再添加無RNase的ddH20至總體積50 μ L，反應(yīng)程序為50°C反轉(zhuǎn)錄30min ；94°C預(yù)變性^iiin ；94°C變性30s，63°C退火30s，72°C延伸30 60s, 30 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin ；4)電泳分析取擴(kuò)增產(chǎn)物5yL，點樣至1.2%的瓊脂糖凝膠上樣孔中，以DL2000DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量作為參照，在120伏的電壓下于IXTAE電泳緩沖液中電泳30 60min，EB染色后在紫外燈下觀察，記錄并分析與預(yù)期片斷大小的一致性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的簡單快速同步檢測三種水稻病毒的方法，其特征是所述步驟2)中，待測樣品為水稻、玉米等植物樣品，取0. Ig葉片于研缽中加液氮研磨成粉狀，轉(zhuǎn)入 1. 5mL離心管后，再加入ImL TRIzol試劑，振蕩混勻后，加入氯仿0. ^il,混勻后靜置3 5min ； 12000g離心lOmin，取上清至新離心管并加入等體積的異丙醇，混勻后12000g，4°C條件下離心lOmin，棄上清，沉淀用70%乙醇洗2次，干燥后將沉淀溶于無RNase的ddH20中， 提取的總RNA保存于_80°C冰箱中備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的簡單快速同步檢測三種水稻病毒的方法，其特征是所述步驟2)中，待測樣品為飛虱樣品，取單頭蟲體，置于1.5mL離心管中，加入500μ L TRIzol試劑，再用經(jīng)過高溫處理的玻棒將蟲體充分研磨；振蕩混勻后，加入氯仿0. 1ml，混勻后靜置 3 5min ； 12000g離心lOmin，取上清至新離心管并加入等體積的異丙醇，混勻后12000g， 4°C條件下離心lOmin，棄上清，沉淀用70%乙醇洗2次，干燥后將沉淀溶于無RNase WddH2O 中，提取的總RNA保存于_80°C冰箱中備用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一條所述的簡單快速同步檢測三種水稻病毒的方法，其特征是設(shè)計的引物中DRS-I和DRS-2特異性地擴(kuò)增RSV的核衣殼蛋白基因，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為757bp ；DRB-I和DRB-2特異性地擴(kuò)增RBSDV的主要外層衣殼蛋白基因，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 592bp ；DSR-I和DSR-2特異性地擴(kuò)增SRBSDV的主要外層衣殼蛋白基因，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 142bp。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一條所述的簡單快速同步檢測三種水稻病毒的方法，其特征是通過梯度PCR確定引物的最適退火溫度為63°C。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種簡單快速同步檢測三種水稻病毒的方法，應(yīng)用一套病毒特異性引物以待測樣品總RNA為模板進(jìn)行一步RT-PCR擴(kuò)增，該引物共有6條，分別為DRS-1、DRS-2、DRB-1、DRB-2、DSR-1以及DSR-2，它們的基因序列如序列表所示，最后通過凝膠電泳條帶以判斷水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)、水稻條紋病毒(RSV)以及南方水稻黑條矮縮病毒(SRBSDV)的侵染狀況。發(fā)明有益的效果是本發(fā)明針對生產(chǎn)實際，發(fā)展建立了一種快速、準(zhǔn)確、靈敏且同步檢測這3種重要水稻病毒的方法，并成功應(yīng)用于單頭飛虱以及田間樣品的檢測和診斷，為水稻黑條矮縮病、條紋病、南方黑條矮縮病的準(zhǔn)確診斷、預(yù)測預(yù)報和科學(xué)防控提供了技術(shù)支撐。
文檔編號C12R1/94GK102559937SQ20121004982
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月29日
發(fā)明者呂明芳, 吳為奇, 張恒木, 羊健, 郭西貴, 陳劍平 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院