用于檢測(cè)水稻條紋病毒NS2基因的qPCR引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及用于檢測(cè)水稻條紋病毒ASS基因表達(dá)量的 qPCR引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻在中國(guó)的分布十分遼闊，是我國(guó)重要的糧食作物，然而，水稻病毒病卻嚴(yán)重影 響著中國(guó)水稻的產(chǎn)量和質(zhì)量。水稻條紋葉枯病（Ricestripevirusdisease)是水稻病毒 病之一，該病害會(huì)造成水稻減產(chǎn)甚至顆粒無(wú)收，被稱為水稻上的"癌癥"。
[0003] 水稻條紋病毒（ViceKirys，RSV)是水稻條紋葉枯病的病原物，它是纖 細(xì)病毒屬的代表成員，由4條單鏈RNA組成，共編碼7個(gè)蛋白，NS2是其中 的一個(gè)蛋白，但目前對(duì)該蛋白的研究較少。2011年，NS2被本課題組鑒定為弱沉默抑制子， 并與水稻編碼的基因沉默抑制子3(supperssorofgenesilengcing3，SGS3)互作； 2014年，本課題組又發(fā)現(xiàn)NS2能與水稻、煙草的纖維蛋白（Fibrillarin，F(xiàn)ib)互作，該互 作關(guān)系影響了RSV的積累及運(yùn)動(dòng)?？梢?，NS2在RSV致病過程中起著重要的作用，對(duì)其進(jìn)行 深入研究，有利于完善對(duì)ASS基因功能及RSV致病機(jī)制的理解。
[0004] 在研究基因功能時(shí)，往往涉及基因表達(dá)量的檢測(cè)。半定量RT-PCR法是檢測(cè)靶基因 表達(dá)量的傳統(tǒng)方法之一，但該法只是對(duì)基因的一個(gè)非常粗略的定量，誤差較大；熒光實(shí)時(shí)定 量PCR(qPCR)法是近幾十年來新興的檢測(cè)靶基因表達(dá)量的方法，該法是在PCR反應(yīng)體系中 加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過特定數(shù)學(xué)原理對(duì)未知 模板進(jìn)行定量分析的方法，誤差較小。在使用qPCR法時(shí)，設(shè)計(jì)合理的qPCR引物甚至、為關(guān) 鍵，該發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物尤為適合檢測(cè)水稻條紋病毒ASSfE基因的表達(dá)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)水稻條紋病毒ASS基因表達(dá)量的qPCR引物。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 用于檢測(cè)沉默植株中靶基因的表達(dá)量的qPCR引物，所述引物序列為NS2_qPCRF:ATCAACAGACGGAGCATC；NS2-qPCRR：CATTGGTTACAACTATGTGCTT〇
[0007] 所述qPCR反應(yīng)體系20. 0yL，包括上下游引物10yM各0? 4yL，SYBRqPCRMix 10yL，DEPCH2O8.4yL，cDNA0.8yL;所述qPCR反應(yīng)條件為：95 °C，Imin;95 °C，15sec; 60 °C，45sec，共 40 個(gè)循環(huán)。
[0008] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于： 1.引物優(yōu)點(diǎn)：GC含量為36%-50%，擴(kuò)增片段大小為107bp，在優(yōu)化的體系中，引物用量 合理，上述優(yōu)點(diǎn)保證了該引物擴(kuò)增片段的特異性。
[0009] 2.擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線起峰單一，為單峰圖，說明不含有非特異性擴(kuò)增成分，說明 產(chǎn)物為特異性產(chǎn)物，引物特異性好 3.瓊脂糖電泳圖表明擴(kuò)增產(chǎn)物非常單一，無(wú)引物二聚體，說明引物特異性良好。
[0010] 4.標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示相關(guān)系數(shù)R2為0. 995,符合R2X). 98的要求；擴(kuò)增效率為0. 99,介 于0. 90~1. 05之間，符合作為qPCR引物的要求。
[0011] 上述表明該引物GC含量合理，特異性強(qiáng)，無(wú)引物二聚體，其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線符合 qPCR引物要求，非常適合用于檢測(cè)引物對(duì)應(yīng)的靶基因表達(dá)量的檢測(cè)。
【附圖說明】
[0012] 圖IqPCR引物擴(kuò)增的基因片段M:DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；1 :水稻條紋病毒（RSV) ;2 : 水稻草狀矮縮病毒（RGSV) ;3:水稻鋸齒葉矮縮病毒（RRSV) ; 4:陰性對(duì)照（滅菌水為模 板）。
[0013] 圖2qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線，擴(kuò)增產(chǎn)物為么橫坐標(biāo)：相對(duì)熒光值；縱坐標(biāo)：溫 度。
[0014] 圖3qPCR擴(kuò)增曲線圖（A:模板為RGSVcDNA;B:模板為RRSVcDNA)橫坐標(biāo)：循 環(huán)數(shù)；縱坐標(biāo)：熒光值。
[0015] 圖4感RSV水稻病株中ASS基因表達(dá)量縱坐標(biāo)：相對(duì)表達(dá)量；橫坐標(biāo)：感染 RSV水稻植株編號(hào)。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 以下通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明 一、水稻病毒總RNA的提取及cDNA的轉(zhuǎn)錄 取感染水稻條紋病毒的水稻病葉〇.Ig，迅速放入液氮中，按北京全式金生物技術(shù)有限 公司的RNA提取試劑盒（EasyPurePlantRNAKit)說明書提取RNA，具體操作如下： (1) 將研磨好的葉片組織，放入1.5mLEppendorf管中，加入ImL結(jié)合緩沖液 (BindingBuffer6，BB6)和10yL(6-巰基乙醇，震蕩渦旋數(shù)秒，室溫放置3min; (2) 12 000rpm離心5min，吸上清至新離心管； (3) 加入1/2倍體積無(wú)水乙醇，混勻并渦旋數(shù)秒； (4) 將上述混合液移入離心柱中，12 000rpm離心30sec，倒棄流出液，柱子放回離心 管； (5) 加入500yL清洗緩沖液（CleanBuffer6，CB6)到柱子中央，12 000rpm離心 30sec，倒棄流出液； (6) 加入80yLDNaseI工作液到柱子中央，室溫放置5min，DNaseI工作配制：70ULReactionBuffer+30UDNaseI； (7) 重復(fù)步驟（5); (8) 加500yL洗滌緩沖液（WashBuffer6，WB6)(已加入無(wú)水乙醇），12 000rpm離心30sec，倒棄流出液； (9) 重復(fù)步驟（8); (10) 12 000rpm離心2min，徹底去除殘留的乙醇，室溫放置5min; (11) 柱子移至1.5mL新離心管上，并加入50yLRNase-freeH2O至柱子中央，室溫 3min，12 000rpm離心 2min; (12) 吸取流出液，再次加入到柱子中央，室溫3min，12 000rpm離心2min。
[0017]cDNA第一鏈合成按北京天根生化科技有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（FastQuantRT KitwithgDNase)說明書操作，反應(yīng)體系及步驟如下： (1)去除基因組DNA(gDNA)的反應(yīng)體系：
上述混合液瞬離后，42 °C孵育3min，然后至于冰上； (2) 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：
⑶將⑴和⑵兩者混勻后，42°C孵育15min; (4)95 °C孵育 3min。
[0018] 二、靶基因溶解曲線的建立 以上述cDNA為模板，按以下體系和程序進(jìn)行反應(yīng)，3個(gè)重復(fù)， PCR反應(yīng)體系：
PCR反應(yīng)條件：
三、靶基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將水稻條紋病毒的cDNA按5的倍數(shù)進(jìn)行稀釋，共設(shè)5個(gè)濃度，分別以稀釋好的cDNA為 模板，進(jìn)行熒光定量PCR，每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)，PCR反應(yīng)體系：
實(shí)例1引物特異性檢測(cè) 分別病毒即水稻條紋病毒（沿ceWrijOeRSV),水稻草狀矮縮?。═Pice Ki/m1，RGSV),水稻據(jù)齒葉病毒（TPiceKizmi,RRSV) 的cDNA為模板，所述引物序列為NS2-qPCRF:ATCAACAGACGGAGCATC;NS2-qPCRR:CATTGGTTACAACTATGTGCTT。按以下PCR體系和程序進(jìn)行： PCR反應(yīng)體系：
結(jié)果判斷：反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)瓊脂糖電泳圖來判斷引物的特異性，電泳圖顯示只有RSV的cDNA可以擴(kuò)增出條帶，且條帶單一無(wú)引物二聚體，而RGSV和RRSV的cDNA均無(wú)法擴(kuò)增得 至條帶（圖1)，這表明該引物可特異檢測(cè)RSV的基因 [0019]實(shí)例 2 分別以病毒即水稻條紋病毒（ViceWrijOeRSV),水稻草狀矮縮?。═Pice Ki/m1，RGSV),水稻據(jù)齒葉病毒（TPiceKizmi,RRSV)的 cDNA為模板，按以下體系和程序進(jìn)行（每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)）： PCR反應(yīng)體系：
結(jié)果判斷：反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線圖來判斷結(jié)果，RSV樣品在Ct值為20-25開始起 峰且峰值高（圖2);而其他樣品則在Ct值高于35時(shí)才起峰，且峰值低。因此，若該引物能 在Ct值為30之前起峰（圖3)，則可判斷為RSV的基因么反之，則不可判斷。
[0020]實(shí)例 3 以感染RSV的水稻cDNA為模板，以水稻延伸因子(GenBank登陸號(hào)：GQ848058) 為內(nèi)參基因，按以下體系和程序進(jìn)行（每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)）：
PCR反應(yīng)條件：
結(jié)果判斷：反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)各樣品的起峰值和qPCR計(jì)算公式可獲得各樣品中勺 表達(dá)量分析圖，該圖為柱型圖，柱狀高低表示感染RSV水稻樣品中靶基因ASSI的相對(duì)表達(dá) 量，可通過圖型來判斷表達(dá)量的高低（圖4)，這表明該引物可作為檢測(cè)RSVASS的基 因相對(duì)表達(dá)量的qPCR引物。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于檢測(cè)水稻條紋病毒ASSf巴基因表達(dá)量的qPCR引物，其特征在于：所述引物序列 為 NS2-qPCRF: ATCAACAGACGGAGCATC; NS2-qPCRR: CATTGGTTACAACTATGTGCTT。2. 如權(quán)利要求1所述引物用于檢測(cè)水稻條紋病毒ASS基因表達(dá)量的qPCR方法，其特征 在于：所述qPCR反應(yīng)體系20.0 yL，包括上下游引物10 yM各0.4 yL，SYBRqPCRMixlO yL，DEPC H2O 8.4 yL，cDNA 0.8 yL;所述 qPCR 反應(yīng)條件為：95 °C，I min ; 95 °C， 15 sec; 6CTC，45 sec，共 40 個(gè)循環(huán)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)水稻條紋病毒<i>NS2</i>基因表達(dá)量的qPCR引物及其檢測(cè)方法，所述引物序列為NS2-qPCRF：ATCAACAGACGGAGCATC；？NS2-qPCRR：CATTGGTTACAACTATGTGCTT，該引物對(duì)GC含量為36%-50%，擴(kuò)增片段大小為107bp，特異性強(qiáng)，無(wú)引物二聚體，其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線符合qPCR引物要求，非常適合用于檢測(cè)引物對(duì)應(yīng)的靶基因表達(dá)量的檢測(cè)。
【IPC分類】C12Q1/70, C12N15/11, C12Q1/68, C12R1/93
【公開號(hào)】CN105087830
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510529152
【發(fā)明人】鄭璐平, 林辰, 賀杰, 吳康成, 吳祖建
【申請(qǐng)人】福建農(nóng)林大學(xué)
【公開日】2015年11月25日
【申請(qǐng)日】2015年8月26日