專(zhuān)利名稱(chēng)：尼羅羅非魚(yú)性染色體特異分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及魚(yú)類(lèi)性染色體特異分子標(biāo)記及遺傳性別鑒定方法，特別涉及羅非魚(yú)性染色體特異分子標(biāo)記及遺傳性別鑒定方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)有著豐富的魚(yú)類(lèi)資源，其中許多魚(yú)類(lèi)品種在生長(zhǎng)速率上存在著性別差異，有的品種雌性個(gè)體比雄性個(gè)體生長(zhǎng)快^Tl(Km)，如牙鲆、半滑舌鰨、圓斑星鰈、南方鲇等；有的品種雄性個(gè)體比雌性個(gè)體生長(zhǎng)快00%以上)，如黃顙魚(yú)、羅非魚(yú)等。開(kāi)展這些魚(yú)類(lèi)品種遺傳性別鑒定和性別控制技術(shù)研究既有重要的科學(xué)意義，又有廣闊的應(yīng)用前景。羅非魚(yú)具有食性雜、生長(zhǎng)快、繁殖強(qiáng)、味道鮮美且肌間刺少等優(yōu)良特征，是世界水產(chǎn)業(yè)重點(diǎn)科研培養(yǎng)的淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)，目前養(yǎng)殖品種主要有莫桑比克羅非魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)、奧利亞羅非魚(yú)和吉富羅非魚(yú)等。其中，尼羅羅非魚(yú)(Preochromis Niloticus)體型較大、生長(zhǎng)較快，是聯(lián)合國(guó)推薦養(yǎng)殖的優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，現(xiàn)已成為世界性的主要養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)品種之一， 產(chǎn)量逐年遞增。由于羅非魚(yú)雄魚(yú)比雌魚(yú)生長(zhǎng)快約50%，且羅非魚(yú)的銷(xiāo)售價(jià)格與其個(gè)體大小有很大關(guān)系，體重40(T500g的羅非魚(yú)售價(jià)要比體重800g以上的羅非魚(yú)低40%左右，因此，如果能夠在育種中人工控制羅非魚(yú)的性別，培育出全雄羅非魚(yú)，將大大提高羅非魚(yú)的養(yǎng)殖產(chǎn)量，降低養(yǎng)殖成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。傳統(tǒng)生產(chǎn)全雄魚(yú)主要通過(guò)人工選育、雄性激素直接誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)等，但這些方法都存在缺陷，如人工選育工作量大，準(zhǔn)確性差；雄性激素直接誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)存在食品安全性問(wèn)題等。目前，國(guó)內(nèi)普遍采用種間雜交(主要是尼羅羅非魚(yú)早X奧利亞羅非魚(yú)$ )的方法培育全雄羅非魚(yú)，雄性率為90、5%，仍有相當(dāng)數(shù)量的雌魚(yú)。最近有研究者先利用魚(yú)類(lèi)性逆轉(zhuǎn)技術(shù)獲得XY生理雌魚(yú)，再通過(guò)XY生理雌魚(yú)雌核發(fā)育產(chǎn)生了 YY超雄魚(yú)，由此建立起兩個(gè)成熟的繁育體系YY超雄魚(yú)繁育體系(YY超雄魚(yú)與 XY生理雌魚(yú)交配，生產(chǎn)YY超雄魚(yú))和全雄魚(yú)繁育體系(YY超雄魚(yú)與XX雌魚(yú)交配，生產(chǎn)全雄魚(yú))，從而可利用YY超雄魚(yú)持續(xù)生產(chǎn)全雄魚(yú)。但由于YY超雄魚(yú)繁育體系在產(chǎn)生YY超雄魚(yú)的同時(shí)也產(chǎn)生數(shù)量相當(dāng)?shù)腦Y雄魚(yú)，而區(qū)分YY超雄魚(yú)和XY雄魚(yú)的傳統(tǒng)方法是在測(cè)交實(shí)驗(yàn)后根據(jù)測(cè)交子代性別比例來(lái)判斷其父本為YY超雄魚(yú)或XY雄魚(yú)，測(cè)交子代需要養(yǎng)殖3個(gè)月以上才能解剖根據(jù)組織學(xué)判斷其性別，存在實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、養(yǎng)殖成本高、不利于規(guī)?；a(chǎn)等缺陷。因此，如何經(jīng)濟(jì)、快捷、準(zhǔn)確地區(qū)分YY超雄魚(yú)和XY雄魚(yú)，成為利用該技術(shù)規(guī)?；a(chǎn)全雄魚(yú)的關(guān)鍵問(wèn)題。隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展和成熟，利用DNA分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳性別鑒定成為可能，但前提是要篩選到性別特異的DNA分子標(biāo)記。此外，魚(yú)類(lèi)的性別特異分子標(biāo)記通常具有物種或者品系特異性，一種魚(yú)類(lèi)的性別特異分子標(biāo)記通常不能跨物種使用。目前，在一些經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)中，通過(guò)各種DNA分子標(biāo)記技術(shù)如隨機(jī)擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat, SSR)、擴(kuò)增的限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)等篩選性別特異分子標(biāo)記已有文獻(xiàn)報(bào)道，如=Kovacs等利用RAPD掃描非洲鯰魚(yú)、Clarias gariepinus)雌、雄基因池，找到兩個(gè)與雄性性別相關(guān)的RAPD標(biāo)記；Sakamoto等發(fā)現(xiàn)兩個(gè)SSR標(biāo)記(0myreT19 TUF和0myRGT28 TUF)與雄性虹鱒(Pncorhynchus mykiss)的性別決定位點(diǎn)相連鎖。此外， 還有以下研究報(bào)道Lee等用集團(tuán)分離分析法找到10個(gè)與羅非魚(yú)表型性別連鎖的SSR標(biāo)記，這些標(biāo)記可直接用于不同Y染色體等位基因功能的研究和具有一個(gè)或幾個(gè)Y染色體拷貝的親魚(yú)的鑒定出zaz等用AFLP掃描尼羅羅非魚(yú)基因組，找到3個(gè)Y染色體連鎖AFLP標(biāo)記(0niY425、0niY382和0niY227)和1個(gè)X染色體連鎖AFLP標(biāo)記(0niX420)，但這些標(biāo)記的性別特異性不強(qiáng)，不適用于尼羅羅非魚(yú)的遺傳性別鑒定。因此，迄今為止，全世界尚未發(fā)現(xiàn)可用于尼羅羅非魚(yú)遺傳性別鑒定的性染色體特異分子標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供尼羅羅非魚(yú)的性染色體特異分子標(biāo)記，特異性強(qiáng)，適用于尼羅羅非魚(yú)的遺傳性別鑒定。為達(dá)到此目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案尼羅羅非魚(yú)性染色體特異分子標(biāo)記，Y 染色體特異分子標(biāo)記NtYl的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，Y染色體特異分子標(biāo)記NtY2 的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，X染色體特異分子標(biāo)記NtXl的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明的目的之二在于提供利用所述尼羅羅非魚(yú)性染色體特異分子標(biāo)記進(jìn)行尼羅羅非魚(yú)遺傳性別鑒定的方法，操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、成本低，能夠經(jīng)濟(jì)、快捷、準(zhǔn)確地區(qū)分YY超雄魚(yú)和XY雄魚(yú)，有助于通過(guò)YY超雄魚(yú)培育路線實(shí)現(xiàn)全雄羅非魚(yú)魚(yú)苗的規(guī)?；a(chǎn)，顯著提高羅非魚(yú)的養(yǎng)殖產(chǎn)量，降低養(yǎng)殖成本，提高經(jīng)濟(jì)效益，在滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求的同時(shí)加快農(nóng)村發(fā)展。為達(dá)到此目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案利用所述尼羅羅非魚(yú)性染色體特異分子標(biāo)記進(jìn)行尼羅羅非魚(yú)遺傳性別鑒定的方法，包括以下步驟
a、PCR克隆剪取待測(cè)尼羅羅非魚(yú)的鰭條，提取基因組DNA；以所得基因組DNA為模板， PCR擴(kuò)增下述尼羅羅非魚(yú)性染色體特異分子標(biāo)記中的任一個(gè)或多個(gè)Y染色體特異分子標(biāo)記NtYl、Y染色體特異分子標(biāo)記NtY2和X染色體特異分子標(biāo)記NtXl ；
b、結(jié)果判斷當(dāng)從待測(cè)尼羅羅非魚(yú)的基因組DNA中擴(kuò)增出Y染色體特異分子標(biāo)記NtYl 和/或NtY2時(shí)，則判斷該待測(cè)尼羅羅非魚(yú)為遺傳上的雄魚(yú)，性染色體基因型為XY或YY ；當(dāng)從待測(cè)尼羅羅非魚(yú)的基因組DNA中擴(kuò)增出Y染色體特異分子標(biāo)記NtYl和/或NtY2以及X 染色體特異分子標(biāo)記NtXl時(shí)，則判斷該待測(cè)尼羅羅非魚(yú)為遺傳上的雄魚(yú)，性染色體基因型為XY ；當(dāng)從待測(cè)尼羅羅非魚(yú)的基因組DNA中擴(kuò)增出Y染色體特異分子標(biāo)記NtYl和/或NtY2 而未擴(kuò)增出X染色體特異分子標(biāo)記NtXl時(shí)，則判斷該待測(cè)尼羅羅非魚(yú)為遺傳上的超雄魚(yú)， 性染色體基因型為YY ；當(dāng)從待測(cè)尼羅羅非魚(yú)的基因組DNA中未擴(kuò)增出Y染色體特異分子標(biāo)記NtYl和/或NtY2而擴(kuò)增出X染色體特異分子標(biāo)記NtXl時(shí)，則判斷該待測(cè)尼羅羅非魚(yú)為遺傳上的雌魚(yú)，性染色體基因型為XX。
進(jìn)一步，步驟a中所述Y染色體特異分子標(biāo)記NtYl的PCR擴(kuò)增引物為NtYFl與 NtYR, Y染色體特異分子標(biāo)記NtY2的PCR擴(kuò)增引物為NtYFl與NtYMR8，X染色體特異分子標(biāo)記NtXl的PCR擴(kuò)增引物為NtYFl與NtXFR8 ；所述引物NtYFl的核苷酸序列如SEQ ID No. 4 所示，引物NtYR的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示，引物NtYMR8的核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示，引物NtXFR8的核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明先采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)篩選出尼羅羅非魚(yú)Y染色體特異AFLP標(biāo)記并將其轉(zhuǎn)化成方便使用的序列特異性擴(kuò)增區(qū)(SCAR)標(biāo)記，再采用基因組掃描技術(shù)篩選出尼羅羅非魚(yú)性染色體特異分子標(biāo)記，并據(jù)此建立了尼羅羅非魚(yú)的遺傳性別鑒定方法，該方法具有特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、成本低等優(yōu)點(diǎn)，能夠經(jīng)濟(jì)、快捷、準(zhǔn)確地區(qū)分YY超雄魚(yú)和XY雄魚(yú)，有助于通過(guò)YY超雄魚(yú)培育路線實(shí)現(xiàn)全雄羅非魚(yú)魚(yú)苗的規(guī)?；a(chǎn)，顯著提高羅非魚(yú)的養(yǎng)殖產(chǎn)量，降低養(yǎng)殖成本，提高經(jīng)濟(jì)效益，在滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求的同時(shí)加快農(nóng)村發(fā)展。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。圖1為應(yīng)用尼羅羅非魚(yú)X染色體特異分子標(biāo)記NtXl以及Y染色體特異分子標(biāo)記 NtYl和NtY2對(duì)12尾尼羅羅非魚(yú)雌魚(yú)(12XX)、12尾尼羅羅非魚(yú)雄魚(yú)(12XY)和7尾尼羅羅非魚(yú)超雄魚(yú)(JTi)進(jìn)行遺傳性別鑒定，其中XX、XY、YY為對(duì)照，M表示DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000。圖2為應(yīng)用尼羅羅非魚(yú)X染色體特異分子標(biāo)記NtXl以及Y染色體特異分子標(biāo)記 NtYl和NtY2對(duì)19尾XX尼羅羅非魚(yú)雜交后代進(jìn)行遺傳性別鑒定，其中XX、XY、YY為對(duì)照， M表示DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000。圖3為應(yīng)用尼羅羅非魚(yú)X染色體特異分子標(biāo)記NtXl以及Y染色體特異分子標(biāo)記 NtYl和NtY2對(duì)20尾XY尼羅羅非魚(yú)雜交后代進(jìn)行遺傳性別鑒定，其中XX、XY、YY為對(duì)照， M表示DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000。圖4為應(yīng)用尼羅羅非魚(yú)X染色體特異分子標(biāo)記NtXl以及Y染色體特異分子標(biāo)記 NtYl和NtY2對(duì)20尾尼羅羅非魚(yú)測(cè)交后代(父本性染色體基因型未知)進(jìn)行遺傳性別鑒定，其中XX、XY、YY為對(duì)照，M表示DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000。圖5為3尾尼羅羅非魚(yú)雌魚(yú)(XXI-廣XX1_3)、3尾尼羅羅非魚(yú)雄魚(yú)(XY1-廣XY1-3) 和3尾尼羅羅非魚(yú)超雄魚(yú)(ΥΥ1-ΓΥΥ1-3)基因組的性別特異多態(tài)位點(diǎn)序列比對(duì)分析，其中方框處為性別特異多態(tài)位點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式下面將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J-薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。一、尼羅羅非魚(yú)性染色體特異分子標(biāo)記的獲得 1、尼羅羅非魚(yú)性染色體特異AFLP標(biāo)記的篩選和克隆 (1)基因組DNA的提取剪取尼羅羅非魚(yú)鰭條 10mg，置裂解液[IOmM Tris-HCl (pH8. 0)+IOOmM EDTA (ρΗ8· 0) +IOOmM NaCl+5mg/ml SDS] 600 μ 1中勻漿，加入終濃度為20mg/ml的蛋白酶K和終濃度為 100 μ g/ml的核糖核酸酶A (RNaseA)，55°C水浴消化至澄清，再加入苯酚-氯仿-異戊醇混合液(體積比為25:24:1) 600 μ 1抽提DNA，充分混勻后于12000rpm離心10分鐘，吸取上清液，再次加入苯酚-氯仿-異戊醇混合液(體積比為25:24:1)抽提DNA，離心，吸取上清液，加入冰乙醇1000 μ 1沉淀DNA，離心，棄上清液，DNA沉淀經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇洗滌、 自然干燥后，用TE緩沖液溶解制成濃度為20ng/y 1的溶液(ODa5tlA)D28tl=L 76 1. 80),-20 °C 保存?zhèn)溆谩?2)基因組DNA的AFLP分析和性染色體特異AFLP標(biāo)記的篩選
用終濃度為1. 25U/y 1的^CbaI和Msel限制性內(nèi)切酶混合物對(duì)8(Tll0ng所得基因組 DNA進(jìn)行雙酶切，37°C反應(yīng)6小時(shí)后，70°C保溫15分鐘滅活限制性內(nèi)切酶。向所得酶切產(chǎn)物中加入XbaI和MseI接頭混合物12 μ 1和Τ4 DNA連接酶0. 5 μ 1，20°C孵育20小時(shí)使特異接頭連接到酶切片段上。將所得連接產(chǎn)物稀釋10倍后作為預(yù)擴(kuò)增模板，采用3’末端帶有一個(gè)選擇性堿基(A或C)的^CbaI預(yù)擴(kuò)增引物和MseI預(yù)擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增。將所得預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍后作為選擇性擴(kuò)增模板，分別采用由3’末端帶有三個(gè)選擇性堿基的 16個(gè)^CbaI選擇性擴(kuò)增引物和16個(gè)MseI選擇性擴(kuò)增引物兩兩組合而成的256個(gè)引物組合進(jìn)行PCR選擇性擴(kuò)增。向所得選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物中加入適量上樣緩沖液，94°C變性5分鐘后， 用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，電泳條件為電壓1500V，功率40W，電流40mA， 溫度45°C，時(shí)間3. 5小時(shí)，對(duì)電泳后產(chǎn)生的DNA條帶進(jìn)行觀察，照相和分析。采用上述方法分別對(duì)12尾尼羅羅非魚(yú)XX雌魚(yú)、12尾尼羅羅非魚(yú)XY雄魚(yú)和7尾尼羅羅非魚(yú)YY超雄魚(yú)的基因組DNA進(jìn)行AFLP分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，256個(gè)引物組合中有1個(gè)引物組合在所有XY個(gè)體和YY個(gè)體的基因組DNA中均擴(kuò)增出一條特異片段，而在所有XX個(gè)體的基因組DNA中均沒(méi)有擴(kuò)增出該片段，因此，該特異片段即為篩選出的Y染色體特異AFLP片段。(3)性染色體特異AFLP標(biāo)記的克隆和序列分析
用刀片切下含有上述Y染色體特異AFLP片段的聚丙烯酰胺凝膠，回收目的片段，將其克隆入PMD-19T載體，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，用藍(lán)白斑篩選法篩選陽(yáng)性克隆，挑取白斑單菌落，用PCR法鑒定陽(yáng)性克隆，并用ABI3730測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。將來(lái)自5個(gè)陽(yáng)性克隆的相同長(zhǎng)度的核苷酸序列用DNAMAN 4. O軟件進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這5個(gè)序列的同源性分別為 99. 38% 和 99. 56%ο2、將尼羅羅非魚(yú)性染色體特異AFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記
根據(jù)上述Y染色體特異AFLP片段的核苷酸序列設(shè)計(jì)如下特異引物NtYFl 5，-tgaggtcgtccatctgcc-3，(SEQ ID No. 4)和 NtYR :5，_acaaacttcacacaaaacaaa_3，(SEQ ID No. 5)。采用引物組合NtYFl+NtYR分別對(duì)12尾尼羅羅非魚(yú)XX雌魚(yú)、12尾尼羅羅非魚(yú) XY雄魚(yú)和7尾尼羅羅非魚(yú)YY超雄魚(yú)的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果如圖1所示，引物組合NtYFl+NtYR能夠在所有XY個(gè)體和YY個(gè)體的基因組DNA中均擴(kuò)增出一條長(zhǎng)約529bp的特異片段，而在所有XX個(gè)體的基因組DNA中均沒(méi)有擴(kuò)增出該片段，說(shuō)明該特異片段(SEQ ID No. 1)是Y染色體特異SCAR標(biāo)記，將其命名為 NtYl。
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3、應(yīng)用基因組掃描技術(shù)篩選尼羅羅非魚(yú)性染色體特異分子標(biāo)記
根據(jù)上述獲得的Y染色體特異SCAR標(biāo)記，結(jié)合基因組掃描技術(shù)，對(duì)大量尼羅羅非魚(yú) XX、XY和YY個(gè)體進(jìn)行基因組擴(kuò)增，結(jié)果成功篩選到兩個(gè)性別特異多態(tài)位點(diǎn)，如圖5所示，在 XXU ΧΧ2和ΧΧ3個(gè)體中全部為CT，在ΧΥ1、ΧΥ2和ΧΥ3個(gè)體中既有TC也有CT，而在ΥΥ1、ΥΥ2 和ΥΥ3個(gè)體中全部為T(mén)C。根據(jù)上述兩個(gè)性別特異多態(tài)位點(diǎn)設(shè)計(jì)如下特異引物NtYMR8 :5’ -aatttttttacat act-gcacaatga-3‘ (SEQ ID No. 6), NtXFR8 5' -aatttttttacatactgcacaatag-3' (SEQ ID No. 7)。分別采用引物組合NtYFl+NtYMR8、NtYFl+NtXFR8對(duì)12尾尼羅羅非魚(yú)XX雌魚(yú)、12尾尼羅羅非魚(yú)XY雄魚(yú)和7尾尼羅羅非魚(yú)YY超雄魚(yú)的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果如圖1所示，引物組合NtYFl+NtYMR8能夠在所有XY個(gè)體和YY個(gè)體的基因組DNA中均擴(kuò)增出一條長(zhǎng)約577bp的特異片段，而在所有XX個(gè)體的基因組DNA中均沒(méi)有擴(kuò)增出該片段，說(shuō)明該特異片段(SEQ ID No. 2)是Y染色體特異分子標(biāo)記，將其命名為NtY2 ；引物組合NtYFl+NtXFR8能夠在所有XX個(gè)體和XY個(gè)體的基因組DNA 中均擴(kuò)增出一條長(zhǎng)約的特異片段，而在所有YY個(gè)體的基因組DNA中卻沒(méi)有擴(kuò)增出該片段，說(shuō)明該特異片段(SEQ ID No. 3)是X染色體特異分子標(biāo)記，將其命名為NtXl。二、尼羅羅非魚(yú)的遺傳性別鑒定
剪取待測(cè)尼羅羅非魚(yú)的鰭條，按照前述方法提取基因組DNA;以所得基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增下述尼羅羅非魚(yú)性染色體特異分子標(biāo)記中的任一個(gè)或多個(gè)Y染色體特異分子標(biāo)記NtYl (引物組合為NtYFl+NtYR)、Y染色體特異分子標(biāo)記NtY2(引物組合為 NtYFl+NtYMR8)和X染色體特異分子標(biāo)記NtXl (引物組合為NtYFl+NtXFR8) ；PCR條件為 94°C預(yù)變性3分鐘，然后94°C變性30秒、58°C退火30秒、72°C延伸30秒，共38個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳。當(dāng)從待測(cè)尼羅羅非魚(yú)的基因組DNA中擴(kuò)增出Y染色體特異分子標(biāo)記NtYl和/或NtY2時(shí)，則判斷該待測(cè)尼羅羅非魚(yú)為遺傳上的雄魚(yú)，性染色體基因型為XY或YY ；當(dāng)從待測(cè)尼羅羅非魚(yú)的基因組DNA中擴(kuò)增出Y染色體特異分子標(biāo)記NtYl和/或NtY2以及X染色體特異分子標(biāo)記NtXl時(shí)，則判斷該待測(cè)尼羅羅非魚(yú)為遺傳上的雄魚(yú)，性染色體基因型為XY ；當(dāng)從待測(cè)尼羅羅非魚(yú)的基因組 DNA中擴(kuò)增出Y染色體特異分子標(biāo)記NtYl和/或NtY2而未擴(kuò)增出X染色體特異分子標(biāo)記 NtXl時(shí)，則判斷該待測(cè)尼羅羅非魚(yú)為遺傳上的超雄魚(yú)，性染色體基因型為YY ；當(dāng)從待測(cè)尼羅羅非魚(yú)的基因組DNA中未擴(kuò)增出Y染色體特異分子標(biāo)記NtYl和/或NtY2而擴(kuò)增出X染色體特異分子標(biāo)記NtXl時(shí)，則判斷該待測(cè)尼羅羅非魚(yú)為遺傳上的雌魚(yú)，性染色體基因型為 XX。圖2示出了應(yīng)用尼羅羅非魚(yú)X染色體特異分子標(biāo)記NtXl以及Y染色體特異分子標(biāo)記NtYl和NtY2對(duì)19尾尼羅羅非魚(yú)XX(早)XXX( $ )雜交后代進(jìn)行遺傳性別鑒定的結(jié)果。由圖可知，在所有待測(cè)尼羅羅非魚(yú)和對(duì)照XX個(gè)體中都沒(méi)有擴(kuò)增出Y染色體特異分子標(biāo)記NtYl和NtY2，而在對(duì)照XY和YY個(gè)體中都擴(kuò)增出了 Y染色體特異分子標(biāo)記NtYl和NtY2 ； 在所有待測(cè)尼羅羅非魚(yú)以及對(duì)照XX和XY個(gè)體中都擴(kuò)增出了 X染色體特異分子標(biāo)記NtXl， 而在對(duì)照YY個(gè)體中沒(méi)有擴(kuò)增出X染色體特異分子標(biāo)記NtXl ；說(shuō)明19尾待測(cè)尼羅羅非魚(yú)均為遺傳上的XX雌魚(yú)，與理論結(jié)果一致。圖3示出了應(yīng)用尼羅羅非魚(yú)X染色體特異分子標(biāo)記NtXl以及Y染色體特異分子標(biāo)記NtYl和NtY2對(duì)20尾尼羅羅非魚(yú)XX(早)XYY( $ )雜交后代進(jìn)行遺傳性別鑒定的結(jié)果。由圖可知，在所有待測(cè)尼羅羅非魚(yú)以及對(duì)照XY和YY個(gè)體中都擴(kuò)增出了 Y染色體特異分子標(biāo)記NtYl和NtY2，而在對(duì)照XX個(gè)體中沒(méi)有擴(kuò)增出Y染色體特異分子標(biāo)記NtYl和NtY2 ； 在所有待測(cè)尼羅羅非魚(yú)以及對(duì)照XX和XY個(gè)體中都擴(kuò)增出了 X染色體特異分子標(biāo)記NtXl， 而在對(duì)照YY個(gè)體中沒(méi)有擴(kuò)增出X染色體特異分子標(biāo)記NtXl ；說(shuō)明20尾待測(cè)尼羅羅非魚(yú)均為遺傳上的XY雄魚(yú)，與理論結(jié)果一致。圖4示出了應(yīng)用尼羅羅非魚(yú)X染色體特異分子標(biāo)記NtXl以及Y染色體特異分子標(biāo)記NtYl和NtY2對(duì)20尾尼羅羅非魚(yú)測(cè)交后代(父本性染色體基因型未知)進(jìn)行遺傳性別鑒定的結(jié)果。由圖可知，在廣5、7 10、12、15、17、18、19號(hào)待測(cè)尼羅羅非魚(yú)以及對(duì)照XY和 YY個(gè)體中都擴(kuò)增出了 Y染色體特異分子標(biāo)記NtYl和NtY2，而在對(duì)照XX個(gè)體中沒(méi)有擴(kuò)增出 Y染色體特異分子標(biāo)記NtYl和NtY2 ；在所有待測(cè)尼羅羅非魚(yú)以及對(duì)照XX和XY個(gè)體中都擴(kuò)增出了 X染色體特異分子標(biāo)記NtXl，而在對(duì)照YY個(gè)體中沒(méi)有擴(kuò)增出X染色體特異分子標(biāo)記 NtXl ；說(shuō)明1 5、7 10、12、15、17、18、19號(hào)待測(cè)尼羅羅非魚(yú)均為遺傳上的XY雄魚(yú)，而6、11、 13、14、16,20號(hào)待測(cè)尼羅羅非魚(yú)均為遺傳上的XX雌魚(yú)。同時(shí)，發(fā)明人對(duì)這20尾尼羅羅非魚(yú)測(cè)交后代的性腺進(jìn)行了組織學(xué)切片及HE染色觀察，證實(shí)本發(fā)明方法的鑒定結(jié)果與組織學(xué)切片鑒定結(jié)果完全吻合。由此可以推知，用于測(cè)交實(shí)驗(yàn)的未知父本性染色體基因型為XY。最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書(shū)所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.尼羅羅非魚(yú)性染色體特異分子標(biāo)記，其特征在于為X染色體特異分子標(biāo)記Ntxi，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及尼羅羅非魚(yú)性染色體特異分子標(biāo)記，即X染色體特異分子標(biāo)記NtX1，其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；通過(guò)PCR擴(kuò)增X染色體特異分子標(biāo)記NtX1與Y染色體特異分子標(biāo)記NtY1和/或NtY2，能夠經(jīng)濟(jì)、快捷、準(zhǔn)確地區(qū)分YY超雄魚(yú)、XY雄魚(yú)以及XX雌魚(yú)，有助于通過(guò)YY超雄魚(yú)培育路線實(shí)現(xiàn)全雄羅非魚(yú)魚(yú)苗的規(guī)模化生產(chǎn)，顯著提高羅非魚(yú)的養(yǎng)殖產(chǎn)量，降低養(yǎng)殖成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102533751SQ20121003780
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月20日
發(fā)明者葉凱, 孫運(yùn)侶, 曾圣, 王德壽, 黃寶鋒 申請(qǐng)人:西南大學(xué)