專利名稱：重組膽紅素氧化酶及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組膽紅素氧化酶和該酶的生產(chǎn)方法。更具體而言，本發(fā)明涉及來源于半知絲狀真菌撫孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)的重組膽紅素氧化酶等。
背景技術(shù)：
“膽紅素氧化酶”是催化膽紅素氧化成為膽綠素的反應(yīng)的酶，是屬于多銅氧化酶(在其活性中心具有多個銅離子的酶的通稱)中的一類酶。習(xí)慣上將膽紅素氧化酶廣泛用作肝功能等臨床檢測的試劑(血清中膽紅素的測定試劑)。此外，在近幾年中，還將膽紅素氧化酶用作在酶電池的陰極(正電極)側(cè)催化氧的電化學(xué)四電子還原反應(yīng)的電極酶。在過去，將從半知絲狀真菌疣孢漆斑菌MT-I中提取并將提取物部分純化得到的酶樣品(下文中將此類樣品稱為“天然膽紅素氧化酶”)作為膽紅素氧化酶使用(參見專利文·件I)。另外，非專利文件I已報道了對編碼膽紅素氧化酶的基因的堿基序列的測定，以及使用酵母構(gòu)建用于重組膽紅素氧化酶的表達(dá)系統(tǒng)(還可參見專利文件2)?，F(xiàn)有技術(shù)文件專利文件專利文件I :特開平5-199882號公報專利文件2 :特開2005-73660號公報非專利文件非專利文件I :“Molecular cloning of the gene for bilirubin oxidase fromMyrothecium verrucaria and its expression in yeast.，’,J Biol Chem. ,1993 年 9 月 5日，268 (25):18801-9。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題為了大量供應(yīng)作為用于臨床檢測試劑或者用于酶電池的電極酶的、來源于半知絲狀真菌疣孢漆斑菌的膽紅素氧化酶，期望構(gòu)建出出色的重組膽紅素氧化酶表達(dá)系統(tǒng)。然而，使用半知絲狀真菌疣孢漆斑菌或酵母的傳統(tǒng)方法存在著如下缺陷酶的表達(dá)量低或者所表達(dá)的酶的活性不足。因此，本發(fā)明的目的是提供一種簡單技術(shù)，用于獲得具有高表達(dá)和高活性的、來源于半知絲狀真菌疣孢漆斑菌的重組膽紅素氧化酶。技術(shù)方案為解決上述問題，本發(fā)明人嘗試使來源于半知絲狀真菌疣孢漆斑菌(作為真核生物的真菌)的膽紅素氧化酶基因在大腸桿菌(Escherichia coli)(作為原核生物的細(xì)菌)中進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用簡單的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)能夠表達(dá)和純化出具有足夠活性的重組膽紅素氧化酶。而且，本發(fā)明人了解了如下事實出人意料地，在缺少翻譯后糖鏈修飾的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，能夠得到比來源于半知絲狀真菌疣孢漆斑菌的天然膽紅素氧化酶活性更高的重組膽紅素氧化酶?；谶@些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了通過如下方式得到的重組膽紅素氧化酶將來源于半知絲狀真菌疣孢漆斑菌的膽紅素氧化酶基因?qū)氪竽c桿菌中并使其得以表達(dá)。這一重組膽紅素氧化酶具有如SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列，并且具有比來源于半知絲狀真菌疣孢漆斑菌的天然膽紅素氧化酶更高的高酶活性。SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列是通過去除來自天然膽紅素氧化酶的氨基酸序列的分泌信號肽的37個殘基得到的序列。另外，本發(fā)明提供了重組膽紅素氧化酶的生產(chǎn)方法，所述方法包括如下步驟將來源于半知絲狀真菌疣孢漆斑菌的膽紅素氧化酶基因?qū)氪竽c桿菌中并使其得以表達(dá)。在所述重組膽紅素氧化酶的生產(chǎn)方法中，優(yōu)選使用來源于半知絲狀真菌疣孢漆斑菌的膽紅素氧化酶基因，所述膽紅素氧化酶基因具有如SEQ ID N0:2所示的堿基序列，并且 優(yōu)選使用來源于K-12的大腸桿菌菌株。SEQ ID NO: 2所示的堿基序列是通過去除編碼分泌信號肽的部分而得到的序列。有益效果本發(fā)明提供了一種簡單技術(shù)，用于獲得具有高表達(dá)和高活性的、來源于半知絲狀真菌疣孢漆斑菌的重組膽紅素氧化酶。


圖I為表明pET-BO載體結(jié)構(gòu)的示意圖。圖2為代替圖片的照片，該照片示出了純化后的重組膽紅素氧化酶的SDS-PAGE結(jié)
果O圖3為示出純化后的重組膽紅素氧化酶的吸收光譜的光譜圖。圖4為示出重組膽紅素氧化酶的活性評價結(jié)果的圖。
具體實施例方式現(xiàn)在，將參考附圖對實施本發(fā)明的優(yōu)選方式進(jìn)行描述。此外，下文中將描述的實施本發(fā)明的方式為實施本發(fā)明的代表性方式的實例，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不會因此而被狹義解釋。通過將來源于半知絲狀真菌疣孢漆斑菌的膽紅素氧化酶基因?qū)氪竽c桿菌中并使其得以表達(dá)，得到本發(fā)明的重組膽紅素氧化酶。所述重組膽紅素氧化酶的特征在于具有比來源于半知絲狀真菌疣孢漆斑菌的天然膽紅素氧化酶更高的酶活性(參見“實施例”)。此夕卜，由于是通過在沒有翻譯后糖鏈修飾的大腸桿菌中表達(dá)而得到所述重組膽紅素氧化酶，所以不同于天然膽紅素氧化酶和由酵母表達(dá)的重組(野生型)膽紅素氧化酶，所述重組膽紅素氧化酶無糖鏈修飾。作為來源于半知絲狀真菌疣孢漆斑菌的膽紅素氧化酶基因，可使用具有如SEQ IDN0:2所示的堿基序列的DNA片段。這一堿基序列被認(rèn)為是通過從編碼天然膽紅素氧化酶的DNA中去除編碼分泌信號肽的部分而得到的序列。通過膽紅素氧化酶基因的表達(dá)而獲得的重組膽紅素氧化酶具有如SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列，所述序列是通過從天然膽紅素氧化酶的氨基酸序列中去除分泌信號肽的37個殘基而得到。此外，本發(fā)明的重組膽紅素氧化酶可為具有通過如下得到的序列的重組膽紅素氧化酶從如SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列中去除對應(yīng)于起始密碼子的甲硫氨酸(從N末端起的第一個甲硫氨酸)。作為用于重組膽紅素氧化酶表達(dá)的載體，可采用通常用于重組蛋白質(zhì)表達(dá)的質(zhì)粒載體。所述載體的實例包括pET22b、pUC18、pHSG398、pHSG399、pRIT2T、pUEXl 至 pUEX3、pKK223-3、pINIII I、pTTQ18、pGEMEX-1、pGH_L9 和 pKK233_2。作為用于重組膽紅素氧化酶表達(dá)的宿主細(xì)胞，可采用通常用于重組蛋白質(zhì)表達(dá)的大腸桿菌細(xì)胞。作為大腸桿菌、尤其是優(yōu)選來源于K-12的菌株，其實例包括如下菌株BL21(DE3)、BB4、BM25. 5、BMH71_18mutS、BW313、C_la、C600、CJ236、DHU DH5、DH5 α、DH10B、DP50supF、ED8654、ED8767、ER1647、HB101、HMS174、HST02、HST04dam-/dcm-、HST08Premium、JM83、JM101、JM105、JM106、JM107、JM108、JM109、JM110、K802、K803、LE392、MC1061、MV1184、MV1193、NovaBlue、RR1、TAP90、TGI、TG2、TH2、XLl-Blue、X-1776、y-1088, y-1089 和y-1090。
根據(jù)待使用的宿主細(xì)胞，可使用常規(guī)的已知方法(如，電穿孔法和鈣法)將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中(轉(zhuǎn)化)。另外，例如，通過超聲波破碎法來打碎細(xì)胞，并通過離心除去破碎產(chǎn)物中的未破碎細(xì)胞和沉淀物，繼之以進(jìn)行透析，由此從所培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化子中提取突變的膽紅素氧化酶并對提取物進(jìn)行純化?？蓪⒂纱说玫降拇之a(chǎn)物進(jìn)一步通過液相色譜進(jìn)行純化。實施例實驗例II.來源于半知絲狀真菌疣孢漆斑菌NBRC (IF0)6113菌株的膽紅素氧化酶的cDNA克隆( 1-1)疣孢漆斑菌的培養(yǎng)疣孢漆斑菌NBRC (IFO) 6113菌株分批購自獨立行政法人日本國立技術(shù)與評估研究院(NITE)的生物技術(shù)中心(獨立行政法人製品評価技術(shù)基盤機(jī)構(gòu)〃' 4 f々7 口
一本部)。將所購買的干燥真菌體懸浮在復(fù)水液(聚蛋白胨0. 5% ;酵母提取物0. 3% ；MgSO4 · 7H20 :0. 1%)中，并將所得到的懸浮液接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平板(馬鈴薯葡萄糖2. 4% ;瓊脂1. 5%)上。在室溫下培養(yǎng)5-7天后，PDA平板表面被白色菌絲覆蓋。將所述菌絲用鏟刮下，并于_80°C下保存。菌體的產(chǎn)量為50mg-60mg (濕重)/PDA平板(直徑9cm)。(1-2) RNA 提取和 cDNA 合成從約IOOmg疣孢漆斑菌NBRC (IF0)6113菌株的冷凍真菌體粉末中提取出100 μ g(通過UV吸收測定)總RNA。將所述總RNA用作逆轉(zhuǎn)錄PCR的模板RNA。以所述總RNA作為模板，使用OneSt印RT-PCR試劑盒(由Qiagen K. K.生產(chǎn))進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR。參考已報道的BO的cDNA堿基序列，設(shè)計用于逆轉(zhuǎn)錄PCR的引物的堿基序列，如下表I所示。表I
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權(quán)利要求
1.一種重組膽紅素氧化酶，所述重組膽紅素氧化酶通過將來源于半知絲狀真菌疣孢漆斑菌的膽紅素氧化酶基因?qū)氪竽c桿菌中并使其得以表達(dá)而得到。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組膽紅素氧化酶，所述重組膽紅素氧化酶具有比來源于半知絲狀真菌疣孢漆斑菌的天然膽紅素氧化酶更高的酶活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組膽紅素氧化酶，所述重組膽紅素氧化酶具有如SEQIDNO: I所示的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的重組膽紅素氧化酶，所述重組膽紅素氧化酶用作酶電池的電極酶。
5.一種制備重組膽紅素氧化酶的方法，所述方法包括如下步驟將來源于半知絲狀真菌疣孢漆斑菌的膽紅素氧化酶基因?qū)氪竽c桿菌中并使其得以表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，使用來源于K-12的大腸桿菌菌株。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其中，使用來源于半知絲狀真菌疣孢漆斑菌的膽紅素氧化酶基因，所述膽紅素氧化酶基因具有如SEQID N0:2所示的堿基序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了重組膽紅素氧化酶的生產(chǎn)方法，所述方法包括如下步驟將來源于半知絲狀真菌疣孢漆斑菌的膽紅素氧化酶基因?qū)氪竽c桿菌中并使其得以表達(dá)。本發(fā)明還公開了由這一生產(chǎn)方法得到的重組膽紅素氧化酶。這一重組膽紅素氧化酶具有比來源于半知絲狀真菌疣孢漆斑菌的天然膽紅素氧化酶更高的酶活性。
文檔編號C12N9/06GK102884180SQ20118002276
公開日2013年1月16日 申請日期2011年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月13日
發(fā)明者汲田英之, 山口大介, 戶木田裕一, 藤田修二 申請人:索尼公司