專利名稱：含治療細(xì)胞的柔性低溫儲(chǔ)存袋的自動(dòng)灌裝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制造、存儲(chǔ)和分裝體細(xì)胞治療產(chǎn)品的方法和系統(tǒng)，體細(xì)胞治療產(chǎn)品符合監(jiān)管機(jī)構(gòu)的要求，例如設(shè)備、生物制品和藥品的現(xiàn)行良好的生產(chǎn)規(guī)范(CGMP)。特別是，本發(fā)明涉及用于灌裝容器，尤其是含有活細(xì)胞治療產(chǎn)品的柔性低溫儲(chǔ)存袋的部分或全部的自動(dòng)化、封閉的系統(tǒng)、裝置和方法。進(jìn)旦冃月^
美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)規(guī)定，細(xì)胞治療，如預(yù)防、治療、治愈或緩解人類疾病或傷痛，是通過(guò)施加經(jīng)體外處理或改變的自體、異體或異種細(xì)胞。細(xì)胞治療、再生醫(yī)學(xué)的目標(biāo)一致，就是要修理、更換或恢復(fù)受損的組織或器官。
供體細(xì)胞的體外擴(kuò)增用于，例如，增加用于自體和異體細(xì)胞治療的干細(xì)胞和祖細(xì)胞數(shù)目。例如，多能間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)目前在許多臨床試驗(yàn)中使用，以探究其在免疫調(diào)節(jié)作用 、造血功能和組織再生中的潛能。MSCs在組織中數(shù)量極低，為了達(dá)到移植數(shù)目，需要細(xì)胞擴(kuò)增。
任何細(xì)胞治療面臨的挑戰(zhàn)是要確保細(xì)胞生產(chǎn)的安全性和高品質(zhì)。特別是，在cGMP 分級(jí)條件下，為了進(jìn)行先進(jìn)細(xì)胞療法，細(xì)胞處理是強(qiáng)制性的。對(duì)于同種異基因療法，在生產(chǎn)細(xì)胞過(guò)程中，方法和產(chǎn)品是否符合GMP的測(cè)試和認(rèn)證是一個(gè)重要的經(jīng)濟(jì)因素，大力鼓勵(lì)生產(chǎn)最大批量和最小批量。
因此，為了擴(kuò)大臨床規(guī)模，最理想的治療細(xì)胞生產(chǎn)，從細(xì)胞收集到培養(yǎng)后處理，是一個(gè)完全自動(dòng)化的封閉過(guò)程。這樣的封閉過(guò)程，將促進(jìn)符合cGMP生產(chǎn)的治療細(xì)胞產(chǎn)品適于儲(chǔ)存和在臨床中使用，由于機(jī)械或生理應(yīng)激，從而降低微生物污染和存活率損失的風(fēng)險(xiǎn)。
已經(jīng)確立大規(guī)模的自動(dòng)化封閉過(guò)程用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)，如生物療法。 然而，無(wú)論是細(xì)胞破碎時(shí)有意地釋放細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)品，或通過(guò)苛刻的方法順便分離細(xì)胞和分泌產(chǎn)物，例如高速離心，大多數(shù)這樣的生產(chǎn)工序旨在恢復(fù)蛋白產(chǎn)物和丟棄死亡細(xì)胞。相反， 擴(kuò)增后的治療細(xì)胞的生產(chǎn)工序，在維持細(xì)胞存活率最終至臨床功能的條件下，通常需要細(xì)胞收集、體積減少、洗滌、制劑、貯存容器灌裝，和低溫貯藏產(chǎn)品細(xì)胞。
此外，治療性細(xì)胞在已知的細(xì)胞生產(chǎn)蛋白過(guò)程中可能無(wú)法存活，因?yàn)?，與細(xì)胞療法的祖細(xì)胞或干細(xì)胞相比，后者通常代表高度操做的細(xì)胞株，在廣泛復(fù)制的培養(yǎng)過(guò)程中，可能會(huì)選擇對(duì)機(jī)械剪切力和生理壓力較低敏感的細(xì)胞株。因此，為了保留療效，治療細(xì)胞通常是有限培養(yǎng)，以便保持脫離人體組織的原始親表型；因此，治療細(xì)胞一般不選擇或不經(jīng)基因工程便于下游加工。
從歷史上看，為了獲得功能上有用的增加的細(xì)胞數(shù)目，哺乳動(dòng)物細(xì)胞的體外擴(kuò)增很大程度上手動(dòng)執(zhí)行，由專門工作人員使用開放的設(shè)備、高度復(fù)雜的操作。這種特殊的技能高度個(gè)性化，利用現(xiàn)有的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，很多這樣的手工技術(shù)難以重現(xiàn)，更難以形成規(guī)模和轉(zhuǎn)換為自動(dòng)化、封閉的過(guò)程。
然而，啟動(dòng)細(xì)胞治療產(chǎn)品臨床試驗(yàn)的早期階段后，整個(gè)試驗(yàn)中保持著相同的基本生產(chǎn)工序。因此，許可審批前，更改工序需向FDA提交研究性新藥申請(qǐng)(INDA)。確立可比性的程度取決于預(yù)測(cè)任何產(chǎn)品或工藝改變的科學(xué)依據(jù)、工序改變的程度、以及產(chǎn)品的發(fā)展階段。一般的方法是通過(guò)體外手段，分析和比較生物制品。當(dāng)差異顯著時(shí)，根據(jù)他們的有效性和相關(guān)性，比較在動(dòng)物模型的藥代動(dòng)力學(xué)、毒理學(xué)和有效性中的新舊產(chǎn)品。最后，在動(dòng)物研究中，如果差異顯著，必須對(duì)人類受試者進(jìn)行臨床等效性研究，目的是建立等效安全、藥代動(dòng)力學(xué)和藥效。對(duì)于一個(gè)給定的產(chǎn)品和條件，所需的臨床試驗(yàn)顯示臨床可比性，逐案判斷臨床試驗(yàn)的性質(zhì)和程度。額外的臨床前或臨床試驗(yàn)是一個(gè)非常昂貴的過(guò)程，因此盡可能避免。
FDA已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，當(dāng)一個(gè)產(chǎn)品第一次進(jìn)入臨床試驗(yàn)時(shí)鎖定進(jìn)程，為免提交一份新的產(chǎn)品許可證申請(qǐng)，在產(chǎn)品的整個(gè)商業(yè)生命周期內(nèi)避免改進(jìn)生產(chǎn)工藝，這些都是不切實(shí)際的。 對(duì)于某些生物技術(shù)生產(chǎn)的產(chǎn)品，如單克隆抗體，F(xiàn)DA已經(jīng)發(fā)展相對(duì)簡(jiǎn)化方法，用以比較由新舊方法生產(chǎn)的產(chǎn)品，通過(guò)工藝驗(yàn)證(例如，清除病毒的研究，去除污染物或溶出物)所有影響工序的因素。然而，與治療蛋白質(zhì)相比，因?yàn)橹委熂?xì)胞的更高復(fù)雜性和脆弱性，和療效在體外和動(dòng)物模型中通常較少的可用性，一般很少建立預(yù)測(cè)任何工序變化對(duì)人體療效的科學(xué)依據(jù)。因此，對(duì)于治療產(chǎn)品，作為臨床試驗(yàn)前置審批進(jìn)程中的第一階段和第三階段，通過(guò)簡(jiǎn)單地?cái)U(kuò)大或縮小最早的人體試驗(yàn)中的基本的手工工 藝，以滿足持續(xù)增長(zhǎng)的需求。
因此，鑒于臨床試驗(yàn)早期階段的增長(zhǎng)的治療細(xì)胞產(chǎn)品，盡量減少人類受試者需要臨床等效性研究的產(chǎn)品的無(wú)意變化，需要符合CGMP標(biāo)準(zhǔn)，大批量生產(chǎn)治療性細(xì)胞產(chǎn)品的自動(dòng)化封閉過(guò)程，包含幾個(gè)數(shù)量級(jí)以上的細(xì)胞，相比大量的手工傳統(tǒng)工藝相比，傳統(tǒng)工序的基本原則的最小變化。
動(dòng)物細(xì)胞，包括治療細(xì)胞，長(zhǎng)期超低溫保存，提供了一個(gè)關(guān)鍵的下游細(xì)胞生產(chǎn)工序的例子，歷來(lái)采用勞動(dòng)密集的手工技術(shù)。因此，美國(guó)專利號(hào)6136525 (“525專利”)的“肝細(xì)胞冷凍保存方法”由Mullon等人于2000年10月24日公開了肝細(xì)胞的超低溫保存，通過(guò)將肝細(xì)胞分裝到冷凍容器，在零下50到零下90攝氏度中凍結(jié)容器，和在流體氮或蒸汽氮中儲(chǔ)存容器。見(jiàn)摘要。“525專利”還公開了冷凍保存方法，最優(yōu)選的是一種包括10%的胎兒牛血清(FBS)和10%二甲亞砜(DMSO)的冷凍保護(hù)劑介質(zhì)。見(jiàn)第3欄，5-8行。將細(xì)胞分裝到冷凍室耐熱容器，最優(yōu)選的是來(lái)自Baxter國(guó)際公司Cryocyte 塑料袋，其容量范圍大約50 至500毫升，最優(yōu)選的是用注射器協(xié)助這種冷凍袋分裝。見(jiàn)第3欄，16-34行。在這個(gè)過(guò)程中，通過(guò)注射器利用重力來(lái)匯集細(xì)胞或輕壓分裝入袋。一旦細(xì)胞被導(dǎo)入袋，注射器用于除去促進(jìn)解凍過(guò)程的過(guò)量空氣。然后密封此袋。密封方法可包括機(jī)械鋁密封件，熱脈沖熱封機(jī)， 魯爾鎖插頭等，最優(yōu)選的是熱封。同上。
事實(shí)上普遍認(rèn)可，成功的超低溫保存和恢復(fù)，在冷凍前，手動(dòng)除去冷灌裝凍保護(hù)劑介質(zhì)中的細(xì)胞的容器中的空氣。例如，上述內(nèi)容除了在“525專利”披露，美國(guó)專利號(hào) 5564279 (下稱“279專利”)披露“凍結(jié)袋”，托馬斯等人于1996年10月15日公開了存儲(chǔ)血細(xì)胞的冷凍袋，和在細(xì)胞和冷凍保護(hù)劑通過(guò)連接袋的管灌裝袋后，和在盡可能地驅(qū)逐袋內(nèi)的所有空氣，密封管之前，使用該袋冷凍紅血細(xì)胞的方法。見(jiàn)，權(quán)利要求11，第5欄，45 行-第6欄，5行。
因此，需要改進(jìn)治療細(xì)胞的生產(chǎn)工藝，從細(xì)胞收集到培養(yǎng)后處理，包括用懸浮在冷凍保護(hù)劑的細(xì)胞灌裝容器，特別是，這樣的過(guò)程盡管保持著傳統(tǒng)手工工藝的基本原理，但是便于在自動(dòng)化、封閉的系統(tǒng)中生產(chǎn)。
美國(guó)專利號(hào)4021283 (“283專利，，)的“無(wú)菌包裝的方法”由Weikert于1977年5月3日公開，其中包括制作無(wú)菌袋網(wǎng)，首先，吹擠出一個(gè)連續(xù)的、封閉的熱塑管，使用的非感染性的氣體，用橫向熱封部分將管分割成一系列，在一個(gè)封閉的系統(tǒng)中，用一個(gè)貫穿其開口的連續(xù)的通道彼此互連的袋，在封閉、無(wú)菌條件下的網(wǎng)袋中灌裝無(wú)菌產(chǎn)品，然后密封該袋， 從而產(chǎn)生密封、無(wú)菌的包裝袋。見(jiàn)摘要?！?83專利”顯然并沒(méi)有考慮從所公開的袋中除去空氣或其它流體，無(wú)論在灌裝之前、期間或之后。
美國(guó)專利號(hào)4964261 (“261專利”)的“用于制備制藥的無(wú)菌溶液的裝袋的方法和裝置”，由Benn于1990年10月23日公布，公開了一種裝袋的方法和裝置，在一個(gè)非無(wú)菌的環(huán)境中，在多個(gè)無(wú)菌的柔性袋中制備制藥的無(wú)菌溶液，該方法和裝置包括提供一個(gè)預(yù)先滅菌的筒狀袋，該筒狀袋具有一個(gè)單一的入口，通過(guò)一消毒過(guò)濾器導(dǎo)入溶液，無(wú)菌溶液引入到筒狀袋的入口，灌裝一定體積的無(wú)菌溶液后，密封多個(gè)筒狀袋，以形成多個(gè)分離的柔性無(wú)菌袋。見(jiàn)摘要?！?61專利”顯然沒(méi)有考慮從所公開的袋中除去空氣或其它流體，無(wú)論灌裝之前、期間或之后。
“261專利”還稱，美國(guó)專利號(hào)4610790 (“790專利”)的“生產(chǎn)無(wú)菌水和無(wú)菌水溶液的工藝與系統(tǒng)”，由Reti等人于1986年9月9日公布，公開了一種方法和裝置，以確保高水平無(wú)菌灌裝包裝袋，安全地供人類使用靜脈輸液。見(jiàn)“261專利”，第I欄，20-58行。根據(jù)“261專利”，單個(gè)無(wú)菌溶液袋的生產(chǎn)是通過(guò)使用包括18個(gè)柔性乙烯基袋的袋組，柔性袋通過(guò)管連接至含有18個(gè)閥的歧管，閥依次連接至一消毒過(guò)濾器，在廠里，組裝成組袋后都要預(yù)先滅菌。同上，“790專利”中公開稀溶液的包 裝包括一個(gè)無(wú)菌容器和傳統(tǒng)方法滅菌的管，容器和管整體上由包含預(yù)先滅菌的過(guò)濾器的過(guò)濾器殼體形成；管子安裝在過(guò)濾器殼體上，以致于本發(fā)明系統(tǒng)所產(chǎn)生的稀溶液通過(guò)過(guò)濾器進(jìn)入容器中，過(guò)濾器適于保存微生物；使用適當(dāng)?shù)墓苈?，殼體可以連接多個(gè)容器，如塑料組合物形成的柔性透明袋，使得水或水溶液中通過(guò)過(guò)濾器流向所有袋。見(jiàn)第7欄，17-40行。“790專利”顯然并沒(méi)有考慮從所公開的袋除去空氣或其它流體，無(wú)論灌裝之前，期間或之后。
美國(guó)專利5641004號(hào)(“004專利”)的“在無(wú)菌條件下灌裝一個(gè)密封容器的方法”由 Py于1997年6月24日公布，公開了一種密封容器的自動(dòng)灌裝，密封容器至少有一個(gè)部件由能夠被中空針頭刺穿的材料制成，并且足夠柔軟以便除去中空針后再次封閉本身。見(jiàn)摘要。在自動(dòng)化過(guò)程中，密封容器的柔性部分使用中空灌裝針穿孔，與流體接觸引導(dǎo)流體進(jìn)入容器。在灌裝容器的過(guò)程中，中空灌裝針的穿孔端通過(guò)氣體層流保持無(wú)菌條件。同上“004 專利”還公開了灌裝的密封容器，優(yōu)選灌裝氣體或抽出氣體，由柔性材料構(gòu)成的袋，例如彈性體(見(jiàn)第2欄，40-42行)，還公開了使用與灌裝針同類型的中空疏散針，將已經(jīng)存在于容器中的流體導(dǎo)出。(見(jiàn)第4欄，27-36行)?！?04專利”還指出，“如果需要，由于灌裝流體進(jìn)入容器的簡(jiǎn)單注射，可以獲得疏散。更好的是，使用例如一個(gè)排氣裝置協(xié)助疏散，優(yōu)選與灌裝同步，如泵。疏散可以發(fā)生在灌裝之前，期間或之后。編號(hào)
美國(guó)專利號(hào)6712963 (2004年3月30日公布)，7052603 (2006年5月30日公布)，由Schick公布的“生物工藝應(yīng)用中溶液的自動(dòng)化無(wú)菌轉(zhuǎn)移的一次性使用的歧管”，和美國(guó)專利公布號(hào)2006/0118472，由?？说热擞?006年6月8日公布的“在生物工藝應(yīng)用溶液的自動(dòng)化無(wú)菌轉(zhuǎn)移的一次性使用歧管和傳感器”，都披露了用于無(wú)菌包裝和一次性使用方法的消毒的歧管。見(jiàn)摘要。通過(guò)無(wú)菌連接器組裝一次性管和容器柔性壁(如袋)。這些歧管與至少一個(gè)遠(yuǎn)程控制的只有與歧管配管的外表面接合的夾緊閥交互。這種歧管和夾緊閥系統(tǒng)可以與蠕動(dòng)類型的泵結(jié)合使用，與遠(yuǎn)程控制的夾緊閥一起的蠕動(dòng)泵由一個(gè)控制器控制， 控制器提供在無(wú)菌環(huán)境中自動(dòng)和準(zhǔn)確的生物技術(shù)流體傳遞，同時(shí)避免或降低清洗和質(zhì)量保證程序。所披露的歧管的各收集/存儲(chǔ)袋具有三個(gè)管連接，包括一個(gè)主入口管，一個(gè)用于緩解灌裝操作過(guò)程中的任何袋內(nèi)堆積的氣體和/或壓力的次管，和一個(gè)輔助袋內(nèi)物質(zhì)再循環(huán)的入口 /出口。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種在非無(wú)菌的環(huán)境中，將活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)菌分裝無(wú)菌的柔性袋的裝置和方法。本發(fā)明是特別用于將活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為治療性產(chǎn)品中使用，如低溫保存細(xì)胞。
本發(fā)明的一個(gè)方面提供一種方法，用于在非無(wú)菌的環(huán)境中，將活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)菌分裝到無(wú)菌的柔性袋，所述方法包括以下步驟Ca)提供多個(gè)無(wú)菌的柔性袋；(b)提供所述活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液，該懸浮液盛在一個(gè)無(wú)菌的細(xì)胞源容器中；(C)將無(wú)菌袋連接至細(xì)胞源容器、一個(gè)真空源和一個(gè)無(wú)菌凈化氣體源，以形成一個(gè)無(wú)菌系統(tǒng)，該系統(tǒng)對(duì)外部環(huán)境是封閉的，其中，系統(tǒng)選擇性地允許流體在無(wú)菌袋和真空源或細(xì)胞源容器或無(wú)菌氣體源之間流動(dòng)；(d)排出至少一個(gè)柔性袋中空氣，通過(guò)選擇性地允許流體在至少一個(gè)袋與真空源之間流動(dòng)；(e)所需體積的流體分裝到至少一個(gè)所述袋，通過(guò)選擇性地允許所需體積的流體在該袋和細(xì)胞源容器之間流動(dòng)jP(f)細(xì)胞源容器與灌裝袋之間的系統(tǒng)中的所需體積的流體逼進(jìn)灌裝袋，通過(guò)選擇性地允許無(wú)菌凈化氣體從所述氣體容器通過(guò)該系統(tǒng)流入一個(gè)袋內(nèi)。
本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施例中，多個(gè)柔性袋、細(xì)胞源容器、真空源和無(wú)菌凈化氣體源至少部分通過(guò)撓性管流動(dòng)地連接在一起。在本實(shí)施例中，至少一個(gè)外部接合撓性管的夾緊閥選擇性地允許流體在無(wú)菌袋和細(xì)胞源容器或真空源或氣源之間流動(dòng)。在該方法中，使用蠕動(dòng)泵單元將流體從源容器中通過(guò)撓性管泵送到柔性袋，是有利的，使得整個(gè)系統(tǒng)保持外部封閉性，也不會(huì)移動(dòng)的泵的泵部件，這使得病毒難以接觸無(wú)菌系統(tǒng)內(nèi)的流體。在該方法的一些實(shí)施例中，無(wú)論是泵單元或至少一個(gè)夾緊閥，或泵和一個(gè)或多個(gè)夾緊閥都是由控制器遠(yuǎn)程控制的。
在該方法的一個(gè)特定的實(shí)施例中，在封閉的無(wú)菌系統(tǒng)的撓性管包括一條主線和至少一條分支線。主線是一段撓性管，其一端連接至細(xì)胞源容器和氣體源，以便選擇性地允許流體從該容器或氣源進(jìn)入主線，例如，通過(guò)一個(gè)雙向閥或通過(guò)一個(gè)Y型連接器和夾緊閥。在本實(shí)施例中，各柔性袋通過(guò)一條分支線流動(dòng)地連接至主線，各分支線是一段撓性管，其一端流動(dòng)地連接至一個(gè)柔性袋，另一端流動(dòng)地連接至主線，以便允許流體或氣體從主線流入該袋。此外，該真空源流動(dòng)地連接至主線，以便允許該真空源通過(guò)主線和分支線排出各袋中的氣體。該真空源可連接主線上的任何地方，不一定接近細(xì)胞源容器和氣體源連接處，該袋可以在同一時(shí)間或選擇性地，通過(guò)使用額外的夾緊閥選擇性關(guān)閉不同袋子的分支線，抽空所有空氣。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的方法用于將活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)菌分裝到無(wú)菌的柔性袋，還包括無(wú)菌密封和斷開已灌裝袋的分支線，例如，通過(guò)熱焊接的管。
本發(fā)明的方法，在分配流體灌裝袋之前，最后灌裝的袋中的細(xì)胞存活率至少為細(xì)胞源容器的初始細(xì)胞存活率的90 %，95 %，98 %，或99 %。例如，在已灌袋中，至少約70 %， 80 %，90 %，95 %，98 %，或99 %的細(xì)胞在灌裝后是活的。該方法，保持較高的存活率，當(dāng)通過(guò)管灌裝的流體流速是從約10毫升/分鐘到I升/分鐘，在懸浮液中的細(xì)胞密度是從約100 萬(wàn)/毫升至約3000萬(wàn)/毫升，流體包括從O至約10%二甲亞砜(DMS0)，它在本領(lǐng)域中公知用于冷凍保護(hù)。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面，是存儲(chǔ)活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，包括分裝細(xì)胞到無(wú)菌的柔性袋，根據(jù)本發(fā)明的方法無(wú)菌分裝活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞至無(wú)菌的柔性袋，并且， 斷開已灌裝的袋后，根據(jù)已知的方法，低溫保存袋子里的細(xì)胞，例如液氮。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法包括以下步驟(a)提供懸浮在流體中的細(xì)胞； (b)提供多個(gè)無(wú)菌柔性袋，無(wú)菌柔性袋通過(guò)支線連接到無(wú)菌撓性管的主線；(C)通過(guò)施加真空到主線，排出柔性袋內(nèi)的空氣；(d)除了要灌裝的袋的分支線外，防止流體流過(guò)其他所有分支線；(e)分裝所需體積的細(xì)胞懸浮液到主線；(f)強(qiáng)迫凈化氣體進(jìn)入主線，來(lái)驅(qū)動(dòng)任何殘留的細(xì)胞懸浮液從主線通過(guò)分支線進(jìn)入要灌裝的袋。
更特別地，在本發(fā)明中使用的細(xì)胞是典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，通常被用作治療性產(chǎn)品的是人體細(xì)胞，如人類干細(xì)胞。通常情況下，將細(xì)胞懸浮在流體培養(yǎng)基中用于存儲(chǔ)細(xì)胞， 例如，在液氮(DMSO)中冷凍保存或其他公知的冷凍保存劑。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了預(yù)消毒的柔性袋組或歧管，根據(jù)本發(fā)明的方法用于灌裝無(wú)菌的柔性袋。這些袋組包括流動(dòng)地通過(guò)多個(gè)支線連接至主線的多個(gè)無(wú)菌柔性袋。 這條主線是一段無(wú)菌撓性管，具有一個(gè)開口端可用于流體流入或流出主線；主線的另一端可被密封，或連接至一條分支線。各分支線是一段無(wú)菌撓性管，其一端流動(dòng)地連接至袋組中的一個(gè)袋子，而另一端流動(dòng)地連接至主線。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，多個(gè)主線可以獨(dú)立地連接至一個(gè)細(xì)胞源容器，灌裝多個(gè)平行袋組，由此進(jìn)一步提高大批量的細(xì)胞灌裝袋率。
適合于在本發(fā)明中使用的袋組已被公開，例如，在美國(guó)專利號(hào)6712963和 7052603，和美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)2006/0118472號(hào)引用，使用市售的柔性袋袋歧管組裝袋組，如ΡΠΠ-ΡΑΚ 4個(gè)75mL的傳輸包，創(chuàng)世紀(jì)BPS公司，商務(wù)路65號(hào)，哈肯薩克市，新澤西 (07601)。本發(fā)明的袋組也可以通過(guò)連接任何其他柔性袋組裝，主線和分支線適用于低溫儲(chǔ)藏哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括無(wú)菌焊接到所需的歧管裝置的一段撓性管。
與常規(guī)方法相反，本發(fā)明中，在用冷凍保存的哺乳動(dòng)物的細(xì)胞懸浮液灌裝柔性袋之前，排出柔性袋中的空氣。特別是，該方法包括排出歧管中的至少一個(gè)柔性袋中空氣，通過(guò)施加真空到主線的開口端。通常情況下，施加真空時(shí)使用實(shí)驗(yàn)室級(jí)真空泵。真空應(yīng)用的水平和持續(xù)時(shí)間可以變化，可根據(jù)需要在一個(gè)合適的時(shí)間期間除去足夠的空氣，根據(jù)本發(fā)明， 在下面的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明。在灌裝袋之前，真空可被應(yīng)用到該袋，或有利地，在同一時(shí)間內(nèi)應(yīng)用所有袋。
通過(guò)主線和分支線排出袋中的空氣后，本發(fā)明的方法涉及，除要灌裝袋的分支線外，防止流體流過(guò)的所有分支線。一般來(lái)說(shuō)，主線或分支線的流體流量通過(guò)閥控制，可以選擇性地允許或停止撓性管中的流體流動(dòng)。夾管閥被有利地用于此目的，因?yàn)檫@樣的閥不破壞撓性管的無(wú)菌完整性。通常情況下，可以防止一個(gè)分支線流體流動(dòng)，通過(guò)施加夾緊閥到主線交界處附近的管，從而有利地提供流入封閉分支線的最小流量。
根據(jù)本發(fā)明的方法，阻止除了要灌裝袋的分支線外的所有分支線的流體流動(dòng)后， 所需量的細(xì)胞懸浮液分裝到主線的開口端。例如，用注射器手動(dòng)分裝或由任何馬達(dá)驅(qū)動(dòng)的泵。有利的是，所需量的細(xì)胞懸浮液用蠕動(dòng)泵分裝，懸浮液流過(guò)封閉的無(wú)菌管，沒(méi)有直接接觸泵裝置，細(xì)菌污染的機(jī)會(huì)再次減至最小。分裝所需量后，可停止流體流到主線，通過(guò)停止泵和/或用閥關(guān)閉主線的開口端，例如，夾緊閥。泵馬達(dá)或主線閥可能停止，例如，由遙控器檢測(cè)分裝到袋組或細(xì)胞源容器中剩余的流體的重量?；蛘?，控制器可以監(jiān)視泵送時(shí)間，泵送所需量后停止分注。
為了減少浪費(fèi)，并提供更好的灌裝量的一致性，本發(fā)明還提供了清除主線和分支線殘余的細(xì)胞懸浮液，在所需量通過(guò)主線的開口端分裝到袋組后。因此，該方法在這方面， 足以使無(wú)菌凈化氣體在壓力下導(dǎo)入主線的開口端，以促使任何在主線或袋的分支線的開口端剩余的分裝流體進(jìn)入要灌裝的袋中。便利地，無(wú)菌的凈化氣體是被過(guò)濾的空氣，但其他惰性氣體也可以使用，如活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的低溫保存的領(lǐng)域中，已知氮?dú)庖部梢允褂?。?dāng)所有的殘留流體時(shí)被強(qiáng)制進(jìn)入灌裝的袋，凈化氣體的流量可以由閥停止。凈化氣體的流量可以由凈化氣體源和主線之間的閥來(lái)控制，但通常是通過(guò)要灌裝的袋的主線或分支線的夾緊閥控制。有利的是，由控制器遠(yuǎn)程控制停 止凈化氣體流動(dòng)的閥，控制器檢測(cè)去除灌裝袋的主線和分支線的所有殘留流體，例如，按已灌裝袋或通過(guò)后彎月面的殘余流體的重量計(jì)，殘留流體經(jīng)過(guò)位于灌裝袋與分支線連接處的檢測(cè)器，從而同時(shí)盡量減少管道中的產(chǎn)品損失和不必要的凈化氣體進(jìn)入灌裝袋。
灌裝后，本發(fā)明的方法提供了無(wú)菌地密封和斷開已灌裝袋的分支線，通常是通過(guò)無(wú)菌焊接封閉和切割的分支線的管。灌裝后后連續(xù)刪除各袋，或一起刪除所有袋。
雖然在本發(fā)明中的方法和裝置中，使用夾緊閥有利于盡量減少滅菌管裂口，但本發(fā)明還考慮在某些情況下，使用管式閥。比如，簡(jiǎn)化自動(dòng)化技術(shù)是可取的，使用單個(gè)三通行閥選擇性地連接細(xì)胞懸浮液源、真空源或凈化氣體源和袋組的主線，特別是一次性使用的塑料管式閥。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明存儲(chǔ)活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，包括根據(jù)本發(fā)明的所述方法分裝這些細(xì)胞到無(wú)菌的柔性袋，然后低溫保存灌裝袋、密封袋內(nèi)的細(xì)胞。
然而，本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種在一個(gè)非無(wú)菌的環(huán)境中，將活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)菌分配至無(wú)菌的柔性袋的裝置，根據(jù)本發(fā)明的方法。在一些實(shí)施例中，該裝置包括 多個(gè)無(wú)菌的柔性袋，包含懸浮在流體中活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞源容器，一個(gè)真空源；和無(wú)菌凈化氣體源。在這些實(shí)施例中，多個(gè)柔性袋，細(xì)胞源容器，真空源和氣體源流體連接在一起，以形成無(wú)菌系統(tǒng)，該系統(tǒng)對(duì)外部環(huán)境是封閉的，以致于該系統(tǒng)選擇性地允許流體在無(wú)菌袋和細(xì)胞源容器或真空源或氣源之間流動(dòng)。在一些實(shí)施例中，多個(gè)柔性袋囊，細(xì)胞源容器， 真空源和無(wú)菌凈化氣體源流體連接在一起，至少部分地由撓性管，以及設(shè)置有選擇性地允許外部撓性管接合的至少一個(gè)夾緊閥無(wú)菌袋和細(xì)胞源容器或真空源或氣源之間的流體流動(dòng)。該裝置還可以進(jìn)一步包括一個(gè)蠕動(dòng)泵單元，其被配置成泵送流體從源容器通過(guò)撓性管進(jìn)入柔性袋，和泵單元或一個(gè)或多個(gè)夾管閥，或兩者，有利地是由一個(gè)控制器遠(yuǎn)程控制。
在該裝置中的一個(gè)特定的實(shí)施例中，撓性管包括一條主線和至少一條分支線，其中的主線是一個(gè)長(zhǎng)的撓性管，其一端連接至細(xì)胞源容器和凈化氣體源，以便有選擇地允許流體流從容器或氣源流入主線。在本實(shí)施例中，每個(gè)柔性袋流體連接至主線，通過(guò)一個(gè)分支線，各分支線是一條長(zhǎng)的撓性管，其一端流體連接至一個(gè)袋，另一端流體連接至主線，以便允許流體或氣體從主線流入該袋。此外，所述真空源流體連接至主線路，從而允許真空源從各袋通過(guò)主線和支線撤回氣體。
接觸細(xì)胞源容器中的流體的裝置的所有內(nèi)部表面預(yù)先滅菌，該裝置被設(shè)計(jì)為排除周圍大氣中未經(jīng)滅菌的空氣。比如，一消毒過(guò)濾器可被用于在該裝置任何朝外部的開口部， 該裝置可能需要以允許進(jìn)入，退出，或該裝置在非無(wú)菌環(huán)境中的氣體交換。因此，本發(fā)明的裝置提供了一種滅菌的，一次性的對(duì)外部的微生物污染完全封閉的 系統(tǒng)，用于無(wú)菌灌裝活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞至柔性袋，例如，用于低溫保存。
有利的是，在本發(fā)明中使用的細(xì)胞源容器是一次性的，通常是預(yù)先滅菌的柔性袋， 可以無(wú)菌灌裝到容器通過(guò)無(wú)菌焊接撓性管。在該裝置中，該容器連接至主線上，這是一條長(zhǎng)的撓性管，其一端流體連接至容器上，直接或通過(guò)連接至另一條已經(jīng)連接至容器的管上。甚至在任何主線管被連接至容器上，以便允許容器中的流體流入主線。
本發(fā)明的裝置還包括一組袋或歧管，這是用細(xì)胞懸浮液灌裝多個(gè)柔性袋，其中每個(gè)袋通過(guò)一個(gè)分支線連接至主線。每個(gè)分支線是一條長(zhǎng)的撓性管，一端流體連接至一個(gè)柔性袋和另一端流體連接至主線，以便允許流體從容器中流入該袋。在本發(fā)明的一組袋中袋的數(shù)目可以是從 2 到超過(guò) 1000，如 3，4，5，8，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，200，400 或 800，優(yōu)選從約10至約100。合適的組袋和組裝袋子的方法由如上文所述市售材料提到。
本發(fā)明的裝置還包括一個(gè)選擇性地連接至一組袋的真空源，從而允許真空被施加到該組的每個(gè)袋子，或者在同一時(shí)間全部施加或單獨(dú)施加。真空源在灌裝之前撤離該組袋， 例如，以避免冷凍保存已灌裝袋中的細(xì)胞，含有太多的空氣，妨礙細(xì)胞懸浮液的一致冷卻速度的問(wèn)題。
該裝置還提供了一種無(wú)菌的凈化氣體源，流體連接至組袋，以便允許這樣的氣體從氣源流到各袋，驅(qū)動(dòng)在主線或分支線管中剩余的任何流體流入待灌裝的袋，上述的本發(fā)明的灌裝方法。有利的是，氣源被選擇性地連接至一組袋，例如，到主線上，靠近細(xì)胞源容器連接處，使凈化氣體進(jìn)入靠近其中的流體進(jìn)入該系統(tǒng)，因此清除大部分撓性管的細(xì)胞源和待灌裝袋之間的路徑。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的裝置還包括一個(gè)閥，其選擇性地允許或停止流體流過(guò)一個(gè)長(zhǎng)的撓性管。優(yōu)選地，該閥是一個(gè)夾緊閥，其外部與該組袋的撓性管接合，在不破壞無(wú)菌管的條件下選擇性地允許或停止流體流入該管。另外，該裝置有利地包括一個(gè)蠕動(dòng)泵單元，被定位成允許從源容器中的流體通過(guò)主線和支線抽入袋。
本發(fā)明的整個(gè)裝置和方法允許在一個(gè)完全封閉的無(wú)菌系統(tǒng)中灌裝無(wú)菌袋，并且也容易地適于使用遠(yuǎn)程控制的泵、閥門和無(wú)菌焊接管的部分或全部自動(dòng)化，根據(jù)本領(lǐng)域中公知的工藝控制和自動(dòng)化的方法。由此，與以前相比，本發(fā)明極大地提高了產(chǎn)率和質(zhì)量，這主要是因?yàn)闊o(wú)菌分配活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞至無(wú)菌的柔性袋，例如，在液氮中冷凍保存，是人工操作。圖片說(shuō)明


圖1是灌裝單個(gè)最終產(chǎn)品袋的本發(fā)明方法中使用裝置的示意圖2是一個(gè)本發(fā)明的自動(dòng)封閉的灌裝袋裝置，提交組袋中的5個(gè)最終產(chǎn)品袋或歧管單元(PD=產(chǎn)品劑量)的示意圖3表明，根據(jù)本發(fā)明，在灌裝袋的殘留空氣量取決于灌裝之前施加真空水平；
圖4表明，根據(jù)本發(fā)明，最終的灌裝產(chǎn)品袋中的殘留空氣的真空持續(xù)時(shí)間(商業(yè)真空泵連接至實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部線上)的效果；
圖5表明，凈化殘余流體使用空氣壓力從灌裝線到最終產(chǎn)品中袋的打包的流體量的效果；
圖6表明，根據(jù)本發(fā)明，泵速測(cè)試范圍(100-400分鐘轉(zhuǎn)速)和管尺寸(O. 8至3. 2 毫米ID)，產(chǎn)品袋灌裝過(guò)程中，蠕動(dòng)泵的轉(zhuǎn)速和泵管尺寸對(duì)細(xì)胞的存活率沒(méi)有實(shí)質(zhì)性影響；
圖7A表明，泵的轉(zhuǎn)速和泵管尺寸(內(nèi)徑)在300萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升對(duì)細(xì)胞存活率的影響；
圖7B表明，泵的轉(zhuǎn)速和管尺寸(內(nèi)徑)(B) 1000萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升對(duì)細(xì)胞存活率的影響；
圖8表明，在本發(fā)明的灌裝過(guò)程中，保持均勻的源細(xì)胞懸浮液，可以很容易地通過(guò)源懸浮液的機(jī)械攪拌；
圖9表明，本發(fā)明的灌裝過(guò)程中大規(guī)模的試驗(yàn)，20個(gè)灌裝的產(chǎn)品袋連續(xù)使用工藝的疏散和凈化步驟的結(jié)果。詳細(xì)說(shuō)明
本發(fā)明提供的改進(jìn)方法，以及與那些方法相關(guān)的自動(dòng)化的裝置和系統(tǒng)，用于有效地、可靠地和安全地用含有活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞治療產(chǎn)品灌裝最終產(chǎn)品袋。在目前的制造細(xì)胞治療產(chǎn)品、灌裝最終產(chǎn)品容器的工藝中，一個(gè)柔性的低溫儲(chǔ)存袋，是目前生產(chǎn)的瓶頸-即使是在少于100個(gè)最終產(chǎn)品袋的小批量生產(chǎn)中。在下游加工階段的主要時(shí)間約束是添加冷凍保護(hù) 劑、DMSO后有限的時(shí)間，哺乳動(dòng)物細(xì)胞通常將保留可接受的存活率，一般只有約60分鐘到第90分鐘。
傳統(tǒng)的灌裝袋過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的多步驟的手動(dòng)過(guò)程，需要使用注射器灌裝和灌裝后抽出空氣。見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)6136525的“肝細(xì)胞的冷凍保存方法”，上面引用。為了減少潛在的微生物污染，同時(shí)連接和斷開連接細(xì)胞源注射器和最終產(chǎn)品袋，來(lái)源、產(chǎn)品袋和注射器可設(shè)置為通過(guò)無(wú)菌管道焊接的拼接和分離的整體連接的管件。見(jiàn)，例如，無(wú)菌管道焊接工藝和設(shè)備的專利申請(qǐng)公布號(hào)20070142960的“無(wú)菌管焊機(jī)系統(tǒng)”，由Bollinger等人在美國(guó)于2007年6月21日公布，其中引用其他專利文件。無(wú)菌焊接創(chuàng)建無(wú)菌管道連接，同時(shí)保持功能上的封閉系統(tǒng)，從而即使在非無(wú)菌環(huán)境中，也能最大限度地減少污染。
在本發(fā)明先前使用的傳統(tǒng)的袋灌裝過(guò)程中，例如，一個(gè)無(wú)菌焊接到源袋的注射器， 該源袋含有I升或更多最終細(xì)胞治療產(chǎn)品，該細(xì)胞治療產(chǎn)品包括懸浮在含DMSO的冷凍保護(hù)介質(zhì)的治療細(xì)胞。源袋中的細(xì)胞懸浮在一個(gè)預(yù)先設(shè)定的密度的溶液中，注射器灌裝預(yù)先設(shè)定的量，兩者都是特定產(chǎn)品。每個(gè)注射器通過(guò)用管封口機(jī)切斷源的連接管，與之分離，焊接到連接至最終產(chǎn)品容器的管是無(wú)菌的，典型的是50ml CryuuyLefc柔性冷凍袋(Baxter保健公司，歐文，加利福尼亞州)。最終的產(chǎn)品，通常是5-20ml細(xì)胞懸浮液，然后將其注入袋子， 袋子被反轉(zhuǎn)和注射器被用于除去上述細(xì)胞懸浮液的任何殘留的空氣袋或氣泡，小心避免任何最終產(chǎn)品懸浮液的意外脫落。最后，注射器管用管封口機(jī)斷開，袋子準(zhǔn)備冷凍。使用6個(gè)專業(yè)培訓(xùn)的技術(shù)人員，手工工藝的生產(chǎn)量，是每小時(shí)約60袋，允許處理一批規(guī)模約1. 2升， 20毫升/袋和只有約O. 3升，5毫升/袋，在首選60分鐘的窗口內(nèi)，加入DMSO后冷凍細(xì)胞。
本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)分析了所述的用在冷凍保護(hù)劑中的治療細(xì)胞灌裝袋的傳統(tǒng)工藝，并發(fā)現(xiàn)了一些改進(jìn)，以便能有效地完全隔離外部污染的加工自動(dòng)化，導(dǎo)致最終產(chǎn)品劑量更大的生產(chǎn)量和再現(xiàn)性。在最初嘗試即時(shí)加工自動(dòng)化，但是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，用蠕動(dòng)泵把細(xì)胞懸浮液引入到常規(guī)的低溫冷凍袋(例如，一個(gè)50毫升Cryocyte· 袋)，在袋中留下來(lái)自袋制造和管灌裝的不可接受的空氣量。在上述手工過(guò)程，殘留的空氣用灌裝注射器抽空。正如在本文別處中所述，非常不希望在低溫冷凍袋存在的氣泡或氣穴。例如，Cryocyte 袋的灌裝指令(www. cryocyte. com記載)多次重復(fù),在冷凍保存之前,必須小心抽空灌裝袋的所有空氣。氣泡或氣穴可能會(huì)導(dǎo)致非均質(zhì)的細(xì)胞體積分布，導(dǎo)致凍結(jié)控制缺乏，并且它也可能導(dǎo)致由低溫下在液氮存儲(chǔ)系統(tǒng)中的機(jī)械攪拌引起的袋破裂。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在通過(guò)蠕動(dòng)泵泵送最終細(xì)胞產(chǎn)品灌裝柔性袋時(shí)的另一個(gè)問(wèn)題是，由于連接產(chǎn)品源和灌裝袋的管道內(nèi)的流體，可能會(huì)發(fā)生大量的產(chǎn)品損失。相比之前的手工方法，從一個(gè)大的產(chǎn)品源泵送產(chǎn)品通常會(huì)導(dǎo)致更多的產(chǎn)品被保留在管，實(shí)踐中考慮，很可能會(huì)決定與之前使用的注射器與小灌裝袋的連接管相比，一個(gè)大源與一個(gè)小的灌裝袋的連接管長(zhǎng)。因此，在蠕動(dòng)泵灌裝系統(tǒng)，在灌裝管的一些最終產(chǎn)品的損失是不可避免的，但是為了高效生產(chǎn)，有必要把這發(fā)面的損失最小化。
此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在所述手動(dòng)袋灌裝過(guò)程中，主要限制存活率是多個(gè)無(wú)菌焊縫的必要性能，用以灌裝注射器并清空它到一個(gè)袋，因?yàn)楫?dāng)前的無(wú)菌焊接工藝通常需要幾分鐘才能完成每個(gè)焊接。
因此，為了解決有效自動(dòng)灌裝低溫存儲(chǔ)細(xì)胞的袋子的問(wèn)題，包括減少袋子里的殘余空氣，同時(shí)最大限度地減少無(wú)菌焊縫和產(chǎn)品損失的數(shù)目，本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了一種新方法，用注射器或泵消除至少灌裝后冷凍袋中約95%的空氣，無(wú)需打開系統(tǒng)或納入更多無(wú)菌焊接。該方法只需要一個(gè)到最終產(chǎn)品袋的無(wú)菌焊接，灌裝和密封后可以立即進(jìn)行包裝用于冷凍保存或冷藏。
因此，在一個(gè)實(shí)施例中，新工藝涉及(例如，Cryocyte 低溫冷凍袋)，通過(guò)一個(gè)無(wú)菌的塑料管網(wǎng)絡(luò)，最終產(chǎn)品袋連接至至少(a) —個(gè)細(xì)胞源容器，優(yōu)選一個(gè)柔性袋，含有最終產(chǎn)品密度的細(xì)胞懸浮液，其冷凍保護(hù)劑介質(zhì)通過(guò)分裝泵從源輸?shù)疆a(chǎn)品袋，和(b)—個(gè)真空源。 任選地，所述最終產(chǎn)品的袋也通過(guò)無(wú)菌管網(wǎng)絡(luò)連接至(C) 一個(gè)凈化氣源，如無(wú)菌加壓空氣源。圖1是用于執(zhí)行本發(fā)明的新方法的一個(gè)簡(jiǎn)單的裝置，用于灌裝單一的最終產(chǎn)品袋。本發(fā)明該裝置的無(wú)菌管網(wǎng)絡(luò)，包括凈化氣體源，其有至少三個(gè)閥，如夾管閥，它可以依次打開和關(guān)閉真空，凈化，和細(xì)胞源極線到最終產(chǎn)品袋(1)除去最終產(chǎn)品袋和管道網(wǎng)絡(luò)的空氣；(2)所需量的最終產(chǎn)品灌裝最終產(chǎn)品袋；和(3)保留流體產(chǎn)品的凈化管道網(wǎng)絡(luò)，強(qiáng)制該流體流入最終產(chǎn)品袋，從而最大限度地減少管道中產(chǎn)品損失。
使用如圖1所示的裝置，本發(fā)明操作過(guò)程可以根據(jù)以下指導(dǎo)來(lái)進(jìn)行(1)組裝源袋，分裝泵，真空泵和清洗泵；(2)無(wú)菌焊接最終產(chǎn)品袋；(3)關(guān)閉閥1，打開閥2，在預(yù)定(優(yōu)化)的時(shí)間內(nèi)排出最終產(chǎn)品袋和管的空氣；(4)關(guān)閉 閥2，打開閥1，分配產(chǎn)品的具體容量; (5)關(guān)閉閥1，打開閥3，允許足夠的凈化流體(例如，無(wú)菌空氣)強(qiáng)制殘余產(chǎn)物從管道到最終產(chǎn)品袋；(6)凈化流體進(jìn)入最終產(chǎn)品袋之前，關(guān)閉閥3 ; (7)無(wú)菌密封和切割管到灌裝袋，然后可以打包灌裝袋用以冷凍保存或冷藏。
為了增加本發(fā)明裝置和袋灌裝方法的生產(chǎn)量，為更有效地灌裝多個(gè)最終產(chǎn)品袋， 本發(fā)明人還設(shè)計(jì)柔性袋組(在本文的一些實(shí)施例中，也稱為“多袋歧管單元”)，其中各袋通過(guò)管道連接至一個(gè)共同的主要管道部件，使得被導(dǎo)入一個(gè)共同的主要管道一端的流體可以流入每個(gè)所連接的袋。圖2是操作本發(fā)明方法的一個(gè)簡(jiǎn)單裝置示意圖，用于灌裝在一個(gè)多袋歧管單元中的5個(gè)最終產(chǎn)品袋。
在一個(gè)如圖2所示的多袋歧管單元，灌裝多袋的過(guò)程如下(1)組裝源袋，分裝泵， 真空泵，清洗泵；(2)無(wú)菌焊接如圖2所示的最終產(chǎn)品袋；(3)關(guān)閉閥1，打開閥2，在預(yù)定(優(yōu)化)的時(shí)間內(nèi)排出最終產(chǎn)品袋和管的空氣；(4)關(guān)閉閥2，打開閥1，分配產(chǎn)品的具體容量;(5)關(guān)閉閥1，打開閥3，允許足夠的凈化流體(例如，無(wú)菌空氣)強(qiáng)制殘余產(chǎn)物從管道到最終產(chǎn)品袋；(6)凈化流體進(jìn)入最終產(chǎn)品袋之前，關(guān)閉閥3 ;(7)無(wú)菌密封和切割管到每個(gè)灌裝袋，然后可以打包灌裝袋用以冷凍保存或冷藏。
上述步驟按各最終產(chǎn)品袋的順序重復(fù)。在另一實(shí)施例中，灌裝物可以平行進(jìn)行，因此產(chǎn)品袋如上所述平行灌裝，其后按順序或平行密封和切割。
一次性管和柔性袋組成的歧管，適合用于實(shí)施本發(fā)明的使用蠕動(dòng)泵的方法，連同一個(gè)或多個(gè)遠(yuǎn)程操作的夾緊閥(S)，夾緊閥由控制器操作以提供流體在無(wú)菌環(huán)境中自動(dòng)進(jìn)入一個(gè)生物流體袋，這是已知的。參見(jiàn)，例如，上面提到的美國(guó)專利第6712963和7052603 號(hào)，和美國(guó)專利公布第2006/0118472號(hào)，公開披露使用柔性袋歧管單元，通過(guò)無(wú)菌連接器組裝，自動(dòng)化分裝生物流體，例如色譜洗脫液。典型的柔性袋被稱為PEM-PAK 四個(gè)75毫升傳輸包的，創(chuàng)世紀(jì)BPS公司，新澤西洲哈肯薩克市商務(wù)路65號(hào)，07601。
為了證明在用細(xì)胞灌裝前從低溫袋中去除足夠的空氣，不選清洗泵，圖1所述的裝置是最初的測(cè)試。如下面的實(shí)施例1所述，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，留在袋中的空氣數(shù)量取決于灌裝步驟之前施加的真空水平。圖3和圖4從實(shí)驗(yàn)中顯示數(shù)據(jù)，在抽成真空的袋的殘余空氣量，灌裝后通過(guò)一個(gè)注射器中排出殘留空氣進(jìn)行定量。結(jié)果表明，不同的真空源和應(yīng)用期間可以充分在袋子灌裝前排出空氣，一個(gè)普通的實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)真空線幾秒鐘足以除去至少約 95 %的殘余空氣。雖然通常沒(méi)有必要，在裝袋之前可以實(shí)現(xiàn)去除額外的空氣，通過(guò)施加更強(qiáng)的真空源，或通過(guò)施加真空的更長(zhǎng)時(shí)間，(更有效地排出空氣)，或袋灌裝之后，例如，通過(guò)進(jìn)一步應(yīng)用真空，無(wú)論是有或沒(méi)有使用袋，手動(dòng)或通過(guò)機(jī)械裝置以驅(qū)動(dòng)截留的空氣氣泡至袋子上方。
關(guān)于保留在灌裝管的產(chǎn)品損失，圖1的裝置在單袋測(cè)試中，本發(fā)明人觀察到，超過(guò) I毫升的產(chǎn)品在灌裝過(guò)程中丟失，它表示從5% (20mL的劑量)到最多20% (5mL的劑量) 的最終產(chǎn)物的損失，因?yàn)檫@些固有的昂貴的產(chǎn)品，這是不能接受的。請(qǐng)參見(jiàn)下面的實(shí)施例2。 通過(guò)使用現(xiàn)成的裝置組件盡可能地減少管的長(zhǎng)度，這種產(chǎn)品的損耗可以降低，如圖5所示， 通過(guò)附加的凈化線，產(chǎn)品的損耗也可以大大減少。用空氣凈化管的附加步驟，發(fā)現(xiàn)不僅是為了減少產(chǎn)品的損失，而且也可以減少在最終產(chǎn)物袋的產(chǎn)品劑量的變化(標(biāo)準(zhǔn)偏差)，盡可能低為+/-0. 5% (見(jiàn)例2)，從而用更嚴(yán)格的劑量規(guī)格創(chuàng)造一個(gè)更強(qiáng)大的過(guò)程。
更重要的是，這個(gè)凈化步驟是簡(jiǎn)單的自動(dòng)化和通過(guò)一次性管和袋組加上控制邏輯和閥門控制，加上關(guān)閉凈化源閥的傳感器，從而防止過(guò)量的清洗流體進(jìn)入灌裝袋，例如，通過(guò)檢測(cè)，當(dāng)袋子包含一個(gè)完整的用量(按重量計(jì))或當(dāng)凈化流體與產(chǎn)物流體之間的接口通過(guò)灌裝袋附近的一個(gè)點(diǎn)，使用的傳感器是已知的和容易自動(dòng)化分配流體。因此，本發(fā)明的工藝，可以是完全或部分自動(dòng)的，使用圖2所示裝置，例如，手動(dòng)或計(jì)算機(jī)控制的真空度，分裝泵，清洗泵，閥，以及其他設(shè)備和本發(fā)明設(shè)計(jì)以提供完整的裝袋系統(tǒng)的一次性用品。計(jì)算機(jī)控制所有的閥門和泵是通過(guò)簡(jiǎn)單的控制邏輯的軟件來(lái)操作的，在灌裝幾個(gè)單獨(dú)的歧管單元的幾十個(gè)袋子時(shí)特別有用。這將大大提高治療性細(xì)胞制造裝袋的生產(chǎn)量，并進(jìn)一步緩解關(guān)鍵生廣瓶頸。
本發(fā)明的裝袋過(guò)程和裝置，與以前使用的手工工藝相比，在用細(xì)胞治療產(chǎn)品灌裝低溫袋，使用較少的勞力提供實(shí)質(zhì)上更大的生產(chǎn)量。如上所述，手動(dòng)過(guò)程的生產(chǎn)量，使用六個(gè)專業(yè)培訓(xùn)的技術(shù)人員，是每小時(shí)約60灌裝袋，允許批處理大小約為1. 2升，20mL/袋劑量， 只有約O. 3升，5mL/袋劑量，在優(yōu)選60分鐘的窗口，加入DMSO后冷凍細(xì)胞。正如在下面的實(shí)施例4中，本發(fā)明人估計(jì)，用18毫升的劑量，例如，單個(gè)技術(shù)員在一小時(shí)內(nèi)只能灌裝65個(gè)單袋，同樣條件下使用一個(gè)3袋歧管可以灌裝139個(gè)袋。雖然這估計(jì)不包括在實(shí)際生產(chǎn)條件下，所需的所有努力，很顯然，本發(fā)明可以顯著地提高技術(shù)員的每小時(shí)生產(chǎn)量，從每小時(shí)約10個(gè)灌裝袋至超過(guò)100袋，由此允許由一個(gè)單一的技術(shù)人員處理一個(gè)1. 2升批次，或由多個(gè)技術(shù)人員處理大得多的批次，每個(gè)技術(shù)人員使用一個(gè)單獨(dú)的裝置(尤其是，泵和管道焊機(jī))。
本發(fā)明人還研究了本發(fā)明灌裝袋的其它操作參數(shù)。tWn，實(shí)施例4中描述的測(cè)試結(jié)果，在圖6中顯示，在產(chǎn)品袋灌裝過(guò)程中蠕動(dòng)泵的轉(zhuǎn)速和泵管尺寸對(duì)細(xì)胞的存活率沒(méi)有實(shí)質(zhì)性影響，根據(jù)本發(fā)明，在測(cè)試的泵的速度范圍(100-400rpm)和管道的尺寸(O. 8至 3. 2mmID)。實(shí)施例5描述了更廣泛的測(cè)試，管道尺寸、泵的速度和在一定范圍內(nèi)的典型產(chǎn)物的濃度(100萬(wàn)至3000萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升)對(duì)細(xì)胞率的影響。如圖7A和7B所示，超過(guò)測(cè)試范圍的測(cè)試參數(shù)沒(méi)有顯著影響細(xì)胞的存活率。
另外，在實(shí)施例5中的測(cè)試，與圖8中所示的結(jié)果，表明本發(fā)明的在灌裝過(guò)程中保持均勻的源細(xì)胞懸浮液，可以容易地通過(guò)源懸浮液的機(jī)械攪拌實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明人還研究了在本發(fā)明的袋灌裝過(guò)程中，低溫保存、DMSO對(duì)細(xì)胞存活率的影響。根據(jù)本發(fā)明的袋灌裝過(guò)程， 實(shí)施例6中描述的測(cè)試表現(xiàn)出DMSO對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞(HDF)的存活率沒(méi)有顯著影響，HDF 通過(guò)管道及時(shí)泵送分裝。
相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員清楚認(rèn)識(shí)到，在不脫離本發(fā)明的范圍及其任何實(shí)施例中的情況下，本文所述的方法和應(yīng)用的其它合適的修改和調(diào)整是顯而易見(jiàn)的。現(xiàn)在已經(jīng)詳細(xì)描述了本發(fā)明，通過(guò)參考下面的實(shí)施例，將被更清楚地理解，其目的僅在于說(shuō)明，而不是為了限制本發(fā)明。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1.排出柔性袋的殘余空氣
眾所周知，低溫冷凍袋中殘余空氣對(duì)冷凍細(xì)胞的存活率和在液氮中冷凍后的袋的物理完整性具有負(fù)面影響。進(jìn)行以下測(cè)試，以確定本發(fā)明的排出低溫冷凍袋的殘余空氣的方法的有效性。材料和設(shè)備Ped1-PAK 75毫升的樣品柔性袋(p/n 402-04，創(chuàng)世紀(jì)BPS公司，美國(guó)新澤西州哈肯薩克商務(wù)路，07601)60毫升注射器(p/n 06009)18GA 針(p/n 08344)止血水頂裝規(guī)模低壓真空(商業(yè)真空泵)高壓真空(模擬用注射器)Flexicon 螺動(dòng)泵-DF6
測(cè)試用75毫升Ped1-PAK 柔性袋，以模擬最終產(chǎn)品的低溫冷凍袋。直接使用制造商的控制袋。用兩種方法之一測(cè)試袋的殘余空氣。第一包括附加一個(gè)60毫升的注射器到袋的魯爾鎖口，并手動(dòng)拉動(dòng)柱塞直到?jīng)]有多余的空氣需要排出。第二個(gè)包括附加魯爾鎖口至實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)真空線(商業(yè)真空泵)，在一分鐘之內(nèi)排出袋內(nèi)空氣。真空后，袋密封，然后取樣測(cè)量殘留空氣量。在該袋內(nèi)加入15毫升水，15毫升水足以使殘留的空氣上升到取樣口， 將18GA針注射器插入端口抽出空氣，測(cè)定剩余的空氣量。袋中的空氣量，可以從注射器只抽空氣不抽水的情況下抽出的空氣量來(lái)估計(jì)。
如圖3所示，測(cè)試結(jié)果(每個(gè)條件n=5袋)表明，控制袋(沒(méi)有空氣被排出；零真空) 的殘余空氣平均為13. 5毫升±6. 5毫升，而低真空后的殘留空氣(注射器，真空最小化)平均為1. 8毫升±0. 8毫升，高真空后的殘余空氣(室內(nèi)線，真空最大化)平均為O. 425毫升 ±0.1毫升。在真空包裝袋中殘留的空氣被認(rèn)為是在冷凍保存可接受的范圍內(nèi)，優(yōu)先采用較高的真空度，也就是控制袋中殘余空氣的97%要被抽出。
進(jìn)一步的測(cè)試表明，通過(guò)商業(yè)的真空泵在不同時(shí)間施加真空，從O到20秒，在約3 秒內(nèi)達(dá)到最大除去殘留的空氣(約97% )。參見(jiàn)圖4。
所述試驗(yàn)表明，用產(chǎn)品灌裝袋之前排出空氣(與現(xiàn)行的做法相反)，在本發(fā)明的灌裝過(guò)程中使用封閉的無(wú)菌系統(tǒng)，提供充分去除空氣的方法，以制備封閉系統(tǒng)的灌裝袋。備選地,根據(jù)本發(fā)明，由生產(chǎn)商排出袋內(nèi)空氣,供給不需經(jīng)本發(fā)明的集成真空工序的沒(méi)有空氣的包裝袋。實(shí)施例2.清除用于灌裝袋的管道中流體產(chǎn)品。
在生產(chǎn)過(guò)程中很多階段均會(huì)發(fā)生產(chǎn)品損失，包括產(chǎn)品灌裝過(guò)程中殘留在管道中的流體。當(dāng)生產(chǎn)規(guī)模提高至商業(yè)水平時(shí)，相對(duì)少量流體可累積到大量流體。此外，每毫升最終產(chǎn)品是非常有價(jià)值的，本質(zhì)上是昂貴的細(xì)胞治療，甚至在大批量生產(chǎn)(例如，500-1000產(chǎn)品劑量)中，5%的產(chǎn)品損失就高達(dá)數(shù)十萬(wàn)美元。因此，本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了一種方法，清除管線到密封之前的包裝袋中流體產(chǎn)品。材料和設(shè)備 Flexicon 螺動(dòng)泵-DF6 撓性管，內(nèi)徑(ID) 3. 2毫米頂裝規(guī)模 Ped1-Pak 袋(見(jiàn)例 O 60毫升的注射器，18GA針?biāo)?br> 凈化過(guò)程測(cè)試包括使用標(biāo)準(zhǔn)條件Flexicon泵分裝10毫升水到5個(gè)單袋和5袋歧管中各袋子。控制條件包括管道中的流體沒(méi)有凈化或操作。試驗(yàn)條件包括使用一個(gè)“Y”連接器，添加一個(gè)60毫升的注射器到灌裝線，用一鉗子關(guān)閉到注射器的線。每個(gè)袋灌裝后，釋放到鉗的注射器，足夠的空氣被驅(qū)逐以推動(dòng)保留在灌裝線的流體約在產(chǎn)品袋的3毫米內(nèi)。 然后夾緊到袋的管道，并用相同的方法灌裝下一個(gè)袋子。然后，使用帶針的注射器以除去每個(gè)袋子中的流體。稱每個(gè)袋的流體，記錄重量并分析，以確定每袋的平均交付劑量。
如圖5所示，沒(méi)有凈化的單袋平均重量為9. 09克±0. 26g，五袋歧管中沒(méi)有凈化一個(gè)袋子的平均重量為8. 76克±0. 33克。與此相反，經(jīng)過(guò)氣體凈化的一個(gè)袋子的平均重量·為9. 85克±0. 17克，而5袋歧管中一個(gè)袋子經(jīng)過(guò)氣體凈化的平均重量為9. 97克±0. 05 克。
因此，本試驗(yàn)的結(jié)果表明，每袋的凈化管線可以儲(chǔ)存超過(guò)I毫升(或10%)的產(chǎn)品。 它還表明不準(zhǔn)確的幅度從±0. 33克(3. 3%)下降至±0.05克(0.5%)。這些產(chǎn)品保留在灌裝生產(chǎn)線，將大大提高效率，降低成本和大規(guī)模生產(chǎn)的時(shí)間和金錢。實(shí)施例3.分析工藝時(shí)間和對(duì)生產(chǎn)暈的影響。
即使是專業(yè)培訓(xùn)的技術(shù)人員手動(dòng)灌裝個(gè)別產(chǎn)品的包裝袋的過(guò)程中也會(huì)消耗大量的精力。本發(fā)明人分別分析無(wú)菌焊接一個(gè)袋子到泵組件，灌裝袋，密封袋，從灌裝線取出它所需的精力?；谏鲜龇治?，提出了一個(gè)高效灌裝袋的策略，使用多袋歧管，以消除許多的手工工藝要求的無(wú)菌焊接。材料和設(shè)備 Flexicon 栗-DP6 泰爾茂無(wú)菌管焊機(jī)手管封口機(jī)(加熱)計(jì)時(shí)器 Ped1-Pak 袋水
計(jì)算過(guò)程中的各個(gè)步驟所確定的平均經(jīng)過(guò)時(shí)間，然后相加，估計(jì)總工藝時(shí)間。估計(jì)灌裝一個(gè)單袋和多袋歧管中的一個(gè)袋的總時(shí)間。灌裝過(guò)程被分解成下面列出的幾個(gè)步驟焊接對(duì)齊的管焊機(jī)焊接管焊縫檢查熱管密封袋管分支灌裝-分配流體的實(shí)際時(shí)間
無(wú)論使用單袋還是多袋歧管，每袋的灌裝時(shí)間均不會(huì)改變。對(duì)于多袋歧管每袋的焊接時(shí)間，即在細(xì)胞源線和歧管的共同主輸入線之間的單個(gè)焊縫對(duì)準(zhǔn)、焊接、和檢查，平均值超過(guò)歧管的袋數(shù)。密封和分離時(shí)間，每袋是相同的，無(wú)論是單一袋或一個(gè)歧管。然后加入這些平均的步驟時(shí)間來(lái)計(jì)算灌裝單袋系統(tǒng)或一個(gè)歧管中的每個(gè)袋子的平均的、預(yù)期的時(shí)間。
所收集的數(shù)據(jù)產(chǎn)生的平均時(shí)間對(duì)齊8. O秒密封19. O秒焊接19. 6秒分離2. O秒袋密封試驗(yàn)3. O秒
這些數(shù)字表明，一個(gè)3袋歧管完整的管道連接和斷開過(guò)程，每袋將需要31. 2秒，5 袋歧管需要27. 12秒和7袋歧管需要25. 37秒。結(jié)合灌裝時(shí)間(5毫升 2秒和18毫升 4秒)估計(jì)，用5毫升的劑量，在一小時(shí)內(nèi)，一名技術(shù)人員只能灌裝67個(gè)單袋，而使用一個(gè)3 袋歧管，可以灌裝112袋。其他灌裝體積和歧管尺寸的估計(jì)時(shí)間顯示在下面的表I中。
表I估計(jì)在一小時(shí)內(nèi)，由一名技術(shù)人員灌裝袋
權(quán)利要求
1.一種在非無(wú)菌的環(huán)境中，將活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)菌地分裝到無(wú)菌的柔性袋的方法， 其特征在于，所述方法包括以下步驟Ca)提供多個(gè)所述無(wú)菌的柔性袋；(b)提供所述活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮液，該懸浮液盛在一個(gè)無(wú)菌的細(xì)胞源容器中；(C)將所述無(wú)菌袋連接至所述細(xì)胞源容器、一個(gè)真空源和一個(gè)無(wú)菌凈化氣體源，以形成一個(gè)無(wú)菌系統(tǒng)，該系統(tǒng)對(duì)外部環(huán)境是封閉的，其中，所述系統(tǒng)選擇性地允許流體在所述無(wú)菌袋和所述真空源或所述細(xì)胞源容器或所述無(wú)菌氣體源之間流動(dòng)；(d)排出一個(gè)所述柔性袋中空氣，通過(guò)選擇性地允許流體在所述一個(gè)袋與所述真空源之間流動(dòng)；(e)所需體積的所述流體分裝到一個(gè)或多個(gè)所述袋，通過(guò)選擇性地允許所需體積的流體在一個(gè)或多個(gè)所述袋和所述細(xì)胞源容器之間流動(dòng)；(f)所述細(xì)胞源容器與一個(gè)或多個(gè)所述袋之間的所述系統(tǒng)中的所需體積的所述流體逼進(jìn)一個(gè)或多個(gè)所述袋，通過(guò)選擇性地允許所述的無(wú)菌凈化氣體從所述氣體容器通過(guò)所述系統(tǒng)流入一個(gè)或多個(gè)所述袋。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述多個(gè)柔性袋、所述細(xì)胞源容器、所述真空源和所述無(wú)菌凈化氣體源至少部分通過(guò)撓性管流動(dòng)地連接在一起，其中有一個(gè)外部接合所述撓性管的夾緊閥，該撓性管選擇性地允許流體在所述無(wú)菌袋和所述細(xì)胞源容器或所述真空源或所述氣源之間流動(dòng)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，一個(gè)蠕動(dòng)泵單元用于泵送所述流體從所述源容器中通過(guò)所述撓性管流入所述柔性袋。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，一個(gè)或多個(gè)所述泵單元和所述閥由一個(gè)控制器是遠(yuǎn)程控制的。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述撓性管包括一條主線和一條或多條分支線，其中所述主線是一段撓性管，其一端連接至所述容器和所述氣源，以便選擇性地允許流體從所述容器或所述氣源流入所述主線；各所述柔性袋通過(guò)一條分支線流動(dòng)地連接至所述主線，各所述分支線是一段撓性管， 其一端流動(dòng)地連接至一個(gè)所述袋，而另一端流動(dòng)地連接至所述主線，以便允許所述流體或所述氣體從所述主線流入所述袋；所述真空源流動(dòng)地連接至所述主線，以便允許所述真空源通過(guò)所述主線和所述分支線排出各所述袋中的空氣。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，包括無(wú)菌地密封和斷開已灌裝袋的分支線。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，最后灌裝的袋的細(xì)胞存活率為在所述細(xì)胞源容器中所述流體分裝所述袋之前初始細(xì)胞存活率的至少90%。
8.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，通過(guò)所述管的所述流體的流量是從10毫升 /分鐘至1000毫升/分鐘，在懸浮液中的細(xì)胞密度是從100萬(wàn)/毫升至3000萬(wàn)/毫升，所述流體包括從O至10%二甲亞砜。
9.一種存儲(chǔ)活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，包括所述細(xì)胞分裝到如權(quán)利要求6所述方法的無(wú)菌柔性袋中，之后斷開已經(jīng)灌裝的袋，低溫保存所述袋中的所述細(xì)胞。
10.一種在非無(wú)菌的環(huán)境中，將活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)菌分裝到無(wú)菌柔性袋中的裝置，所述裝置包括多個(gè)所述無(wú)菌柔性袋；一個(gè)包含懸浮在流體中的所述活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞源容器；一個(gè)真空源；一個(gè)無(wú)菌凈化氣體源其中，所述多個(gè)柔性袋、所述細(xì)胞源容器、所述真空源與所述氣源流動(dòng)地連接在一起， 以形成一個(gè)對(duì)外部環(huán)境封閉的無(wú)菌系統(tǒng)，如此，所述系統(tǒng)選擇性地允許流體在所述無(wú)菌袋和所述細(xì)胞源容器或所述真空源或所述氣源之間流動(dòng)。
11.如權(quán)利要求10所述的裝置，其特征在于，所述多個(gè)柔性袋、所述細(xì)胞源容器、所述真空源和所述無(wú)菌凈化氣體源部分通過(guò)撓性管流動(dòng)地連接在一起，其中有一個(gè)或多個(gè)外部接合在所述撓性管的夾緊閥，該撓性管選擇性地允許流體在所述無(wú)菌袋和所述細(xì)胞源容器或所述真空源或所述氣源之間流動(dòng)。
12.—種如權(quán)利要求11所述的裝置，其特征在于，包括一個(gè)蠕動(dòng)泵單元，用于泵送所述流體從所述源容器通過(guò)所述撓性管進(jìn)入所述柔性袋。
13.如權(quán)利要求12所述的裝置，其特征在于，一個(gè)或多個(gè)所述泵單元和所述夾緊閥是由一個(gè)控制器遠(yuǎn)程控制。
14.如權(quán)利要求12所述的裝置，其特征在于，所述撓性管包括一條主線和一條或多條分支線，其中所述主線是一段撓性管，其一端連接至所述容器和所述氣源，以便選擇性地允許流體從所述容器或所述氣源流入所述主線；各所述柔性袋通過(guò)一條分支線流動(dòng)地連接至所述主線，各所述分支線是一段撓性管， 其一端流動(dòng)地連接至一個(gè)所述袋，而另一端流動(dòng)地連接至所述主線，以便允許所述流體或所述氣體從所述主線流入所述袋；所述真空源流動(dòng)地連接至所述主線，以便允許所述真空源通過(guò)所述主線和所述分支線抽出各所述袋中的氣體。
全文摘要
一種在一個(gè)非無(wú)菌的環(huán)境中，將活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)菌分裝到無(wú)菌柔性袋的裝置和方法。該方法包括以下步驟提供懸浮在液體中的細(xì)胞；提供多個(gè)無(wú)菌的柔性袋，其通過(guò)無(wú)菌撓性管的多個(gè)分支線流動(dòng)地連接至一條主線；通過(guò)施加真空到該主線的開口端，排出柔性袋中的空氣；除了需要灌裝的袋的分支線外，防止液體流過(guò)所有其他分支線；所需體積的細(xì)胞懸浮液分裝到該主線的開口端；主線開口端需充分壓入無(wú)菌凈化氣體，足以使留在灌裝袋主線或分支線中的分裝的液體進(jìn)入袋中。細(xì)胞可在灌裝袋內(nèi)低溫保存。
文檔編號(hào)C12M1/00GK103025857SQ201180022364
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2011年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月4日
發(fā)明者喬納森·羅利, 帕特里克·紐森 申請(qǐng)人:龍沙沃克斯維爾公司