專利名稱：產(chǎn)生氫的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明,在其一些實(shí)施方式中，涉及在藻類中產(chǎn)生氫氣的光催化方法。
背景技術(shù)：
因?yàn)闅錃馊紵尫糯罅磕芰?重量而不產(chǎn)生CO2 (而是產(chǎn)生H2O)并且氫很容易通過燃料電池轉(zhuǎn)化成電力，在減輕空氣污染，防止全球變暖，以及以經(jīng)濟(jì)可持續(xù)的方式保護(hù)環(huán)境方面，氫氣(分子氫)被認(rèn)為是理想的燃料。氫和電力可以組合從而在運(yùn)輸和發(fā)電方面提供有吸引力的選擇。這兩種形式的能量之間的相互轉(zhuǎn)化提供了現(xiàn)場利用氫進(jìn)行發(fā)電，而電網(wǎng)用于根據(jù)需要進(jìn)行能源傳輸，分布利用，以及氫再生。然而，可再生地并且環(huán)境友好地產(chǎn)生大量H2氣體為使用H2作為未來能源提出了具有挑戰(zhàn)性的問題。與光電化學(xué)，或熱化學(xué)過程相比較，生物氫的生產(chǎn)具有幾個優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗鼉H需要具有較低能量要求的簡單太陽能反應(yīng)器，而不是需要高能量的電池來為電化學(xué)過程供電。藍(lán)細(xì)菌和綠藻是具有產(chǎn)氧光合作用以及氫氣生產(chǎn)兩者的唯一已知的生物體。在20世紀(jì)中期，在厭氧的并且限光的條件下(暗適應(yīng))培養(yǎng)之后，當(dāng)光照時在綠藻柵藻中首次觀察到氫氣產(chǎn)生。此后，在綠色微藻中光生物氫氣的生產(chǎn)備受關(guān)注，目的是使用光合電子傳遞途徑作為通過鐵氧化還原蛋白連接的氫化酶途徑將H+還原成氫氣的電子源。此外，在厭氧條件下，碳化合物的發(fā)酵可以提供氫生產(chǎn)的還原當(dāng)量?？赡娴腇e-氫化酶是高度氧敏感的，因此必須限制通過光合作用釋放O2，從而實(shí)現(xiàn)當(dāng)光照暗適應(yīng)的培養(yǎng)基時由氫化酶光生產(chǎn)H2。已經(jīng)通過用對于規(guī)模放大的培養(yǎng)而言是昂貴并且不切實(shí)際的惰性氣體(如氬氣或氮?dú)?充入反應(yīng)容器以及通過使用對于細(xì)胞具有潛在毒性的外源性還原劑(例如，用于抑制光合作用O2釋放的連二亞硫酸鈉或除草劑)試圖建立厭氧生活。在2000年，在伯克利大學(xué)，在通過使光合作用氧氣釋放(伴隨碳積聚)與細(xì)胞代謝產(chǎn)物的消耗分離而努力地規(guī)避可逆氫化酶的嚴(yán)重的氧氣敏感性中，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，在光照下將萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)去除硫使PS-II (光系統(tǒng)II)的氧氣生產(chǎn)失活，并且引起核酮糖二磷酸羥化酶(RuBisc0)急劇下降，從而通過卡爾文本森循環(huán)以及厭氧條件導(dǎo)致減少的二氧化碳同化作用(Melis et al. , Plant Physiol 2000;122:127-135)。在充分照射2天之后，當(dāng)藻類的環(huán)境轉(zhuǎn)變成厭氧的并且所有的氧氣被消耗時，藻類開始生產(chǎn)氫氣持續(xù)很少的數(shù)天。然而，在這種系統(tǒng)中藻類的氫生產(chǎn)率未達(dá)到商業(yè)可行性，并且確保營養(yǎng)應(yīng)激逐漸破壞，并且最終對于細(xì)胞具有毒性。因此，在梅利斯(Melis)方法中，氫氣積聚的實(shí)際速率最多是細(xì)胞光合作用能力的15%至20% [Melis and Happe 2001，PlantPhysiol. November ；127 (3) :740-8],而通過將藻類去除硫來生產(chǎn)氫不能無限地繼續(xù)下去。在去除硫約40-70小時之后產(chǎn)量開始變平緩以及下降，而在去除硫約100小時之后，需要將藻類恢復(fù)到正常光合作用的階段以便補(bǔ)充內(nèi)源性底物。氫氣光生產(chǎn)的引發(fā)(“第2階段”)顯著地滯后，典型地24-30小時，直至建立厭氧性條件。由于藻類使用其Fe-氫化酶生產(chǎn)大量氫氣的潛力較高，已經(jīng)例如通過重復(fù)限光循環(huán)和具有未剝硫(undeprived)光合作用循環(huán)的氧耗循環(huán)繼續(xù)努力增強(qiáng)這種藻類或其他藻類的氫生產(chǎn)力(參見，例如，梅利斯等的美國專利US20010053543)，通過限制光照光能和選擇和/或產(chǎn)生具有有限光收集機(jī)制的遺傳工程控制光合作用(參見，例如，梅利斯的美國專利US20080120749)，減少硫的攝取(參見梅利斯等的美國專利US20050014239)或降低其氫酶的氧敏感性(參見，例如，金等(King et al)的兩個美國專利US20090263846和US20060228774)。不過，到今天為止，已經(jīng)取得的顯著進(jìn)步不大。有人已經(jīng)認(rèn)為(Terauchi et al，JBC 2009 ;284:25867-878)這種系統(tǒng)中氫產(chǎn)量低的主要原因是剝硫期間將電子從PS-I傳送至氫酶的大部分對氧敏感的已還原鐵氧化還原蛋白(PetF，F(xiàn)DX2)被氧化，并因?yàn)榕囵B(yǎng)基中缺乏硫而藻類不能有效更新鐵氧化還原蛋白，鐵硫蛋白的水平。此外，剝硫?qū)е鹿夂献饔玫呐浜衔?，以及酶和其他生物活性分子的許多組件轉(zhuǎn)錄下降。這就增加了梅利斯過程滯后時間(通常24-48h)的缺點(diǎn)，直至建立厭氧條件。因此，當(dāng)環(huán)境變成厭氧環(huán)境時藻類已經(jīng)變得虛弱而隨著鐵氧化還原蛋白降低，進(jìn)一步降低了光生氫氣產(chǎn)量。有人提出共培養(yǎng)藻類和光合厭氧產(chǎn)氫細(xì)菌進(jìn)行氫的藻類光生，正如以上所述。藻類和細(xì)菌共存在于自然界，人們已經(jīng)作出很多努力以識別細(xì)菌的共生體而提高，例如，污染物或生物質(zhì)生產(chǎn)的生物修復(fù)中藻類生長的效率(參見，例如，Gonzalez-Bashan et al, Can. J. Microbiol. , 2000 ;46:653-59 ;和 Belaiev 等的美國專利US20100311156)。Kawaguchi 等(J. Bioscience and Bioengineering 2001 ;91:277-282)提出將光合細(xì)菌海紅菌(R. marinum)沿連同麥汁生物酸化菌(Lactobacillus amylovorus)和藻類生物質(zhì)一起培養(yǎng)，而將藻淀粉代謝成乳酸酯作為細(xì)菌產(chǎn)氫的電子供體。梅利斯的美國專利申請20030162273和20050014239公開了為了提高產(chǎn)氫產(chǎn)量的光合產(chǎn)氫藻類(野生型和降低硫酸鹽利用的遺傳設(shè)計(jì)的)與產(chǎn)氫細(xì)菌的共培養(yǎng)方法。然而，由于硫是生產(chǎn)鐵氧化還原蛋白的關(guān)鍵組分，隨著剝硫或缺硫的藻類中鐵氧化還原蛋白減少，向Fe-氫酶的電子傳輸也降低,并隨之導(dǎo)致氫產(chǎn)量變低。向培養(yǎng)基中加入?yún)捬醍a(chǎn)氫細(xì)菌預(yù)想能夠彌補(bǔ)由于藻類硫酸鹽攝取降低所致的藻類氫生產(chǎn)率損失。通過加入?yún)捬踅湍妇缢鬆钛挎邨U菌獲得了進(jìn)一步的產(chǎn)氫能力。然而，藻類產(chǎn)氫仍然受到抑制，直至經(jīng)歷過漫長的潛伏期和建立移動微氧和/或厭氧培養(yǎng)條件。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的一方面，提供了一種產(chǎn)生氫氣的方法，所述方法按序包括(a)在繁殖培養(yǎng)基中繁殖光合藻類，這種繁殖培養(yǎng)基含有硫；(b)在培養(yǎng)基中將藻類與細(xì)菌共培養(yǎng)足夠長的一段時間而確保氧降低的培養(yǎng)條件，其中所述培養(yǎng)基相比于所述繁殖培養(yǎng)基包含的硫含量降低；
(c)在這種培養(yǎng)基中耗損至少一些細(xì)菌而產(chǎn)生細(xì)菌減少的培養(yǎng)基；(d)在這種培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述藻類足夠長的一段時間而確保厭氧培養(yǎng)條件；Ce)在這種培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)條件下培養(yǎng)所述藻類，由此產(chǎn)生氫氣；和(f)收集所述氫氣。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的一方面，提供了一種產(chǎn)生氫氣的方法，這種方法包括(a)在繁殖培養(yǎng)基中繁殖光合藻類，這種繁殖培養(yǎng)基含有硫；( b )在相比于所述繁殖培養(yǎng)基包含的硫含量降低的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述藻類足夠長的一段時間而建立厭氧培養(yǎng)條件，其中所述培養(yǎng)與所加細(xì)菌共培養(yǎng)至少一部分所述時間長度； (c)在這種培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)條件下培養(yǎng)所述藻類，由此產(chǎn)生氫氣；和(d)收集所述氫氣，其中相比于藻類未與所加細(xì)菌共培養(yǎng)的類似培養(yǎng)的所述時間長度步驟(b)的厭氧培養(yǎng)條件的時間長度減少。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的一方面，提供了一種產(chǎn)生氫氣的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)按序包括(a)包含在相比于藻類繁殖培養(yǎng)基包含降低量的硫的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)的光合藻類和細(xì)菌的密封培養(yǎng)容器；(b)所述培養(yǎng)容器的光照光源；和(C)從培養(yǎng)容器中收集氫氣的裝置，其中所述細(xì)菌包含于流體連接于藻類封閉殼的細(xì)菌封閉殼，所述藻類封閉殼由此通過流體-和氣體-可滲透而細(xì)菌不可滲透的屏障與之隔離。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述細(xì)菌包含耗氧細(xì)菌。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，這種方法進(jìn)一步包括步驟(b )之后而步驟(c )之前、或期間在這種培養(yǎng)基中耗損至少一些細(xì)菌而產(chǎn)生細(xì)菌減少的培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，這種耗損實(shí)施過程中所述藻類培養(yǎng)物基的氧耗量等于或大于所述藻類培養(yǎng)物基的光合產(chǎn)氧量，這都在高強(qiáng)度光照下進(jìn)行測量。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，這種細(xì)菌減少的培養(yǎng)基基本上沒有所述細(xì)菌。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，這種繁殖培養(yǎng)基基本上沒有所述細(xì)菌。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述培養(yǎng)基基本上沒有硫。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，厭氧條件下的所述藻類培養(yǎng)在光照射條件下實(shí)施。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，這種方法進(jìn)一步包括在厭氧條件下培養(yǎng)所述藻類之前在光照射條件下實(shí)施任何這些步驟。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，在厭氧條件下培養(yǎng)實(shí)施藻類的步驟期間所述光照強(qiáng)度要大于在厭氧條件下培養(yǎng)所述藻類之前的任何這些步驟期間的光照強(qiáng)度。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，實(shí)驗(yàn)步驟都在光照射條件下實(shí)施。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述細(xì)菌包含于流體連接于藻類封閉殼的細(xì)菌封閉殼，所述藻類封閉殼通過流體-和氣體-可滲透而細(xì)菌不可滲透的屏障而與細(xì)菌封閉殼隔離。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述細(xì)菌封閉殼位于藻類封閉殼內(nèi)而由此通過流體-和氣體-可滲透而細(xì)菌不可滲透的屏障與之隔離。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，細(xì)菌封閉殼是透析袋。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述細(xì)菌封閉殼遠(yuǎn)離藻類封閉殼而經(jīng)由流體連接裝置與其流體連接并由此通過流體-和氣體-可滲透而細(xì)菌不可滲透的屏障與之隔離。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式,細(xì)菌封閉殼進(jìn)一步包含碳源。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，共培養(yǎng)基中的藻類體積比所述細(xì)菌的體積大約5 50倍。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，步驟(b)中的藻類體積比所述細(xì)菌的體積大約20倍。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述共培養(yǎng)物包含約IO3至約IO8個藻類細(xì)胞/mL。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述共培養(yǎng)物包含約IO4至約IO7個藻類細(xì)胞/mL。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述共培養(yǎng)物包含約IO5 IO6個藻類細(xì)胞/mL。 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述共培養(yǎng)物包含約3-6 X IO6個或約3-6 X IO7個藻類細(xì)胞/mL。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，在(b)和(C)中的所述培養(yǎng)進(jìn)行約4至約60h。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，在(b)和(C)中的所述培養(yǎng)進(jìn)行約10至約40h。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，在(b)和(C)中的所述培養(yǎng)進(jìn)行約30h。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，在(b )和(c )中培養(yǎng)所述藻類約30h之后所述氫氣產(chǎn)·量就可檢測到。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述藻類包括綠藻。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述藻類包括單細(xì)胞的光合藻類。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述藻類包括含有Fe-氫酶的藻類。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述藻類選自由海洋綠藻，紫細(xì)菌和萊茵衣藻組成的組。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述細(xì)菌包括耗氧細(xì)菌。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述細(xì)菌包括專性好氧細(xì)菌。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述細(xì)菌是熒光假單胞菌。除非另有定義，本文所用所有的技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語都具有本發(fā)明涉及的技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。盡管類似或等同于本發(fā)明中描述的方法和材料能夠用于本發(fā)明實(shí)施方式的實(shí)踐或測試，但是示例性的方法和/或材料描述以下進(jìn)行介紹。在發(fā)生沖突的情況下，將會由專利說明書，包括定義，決定。另外，材料、方法和實(shí)施例僅是說明性的，而預(yù)想并非是進(jìn)行必要的限制。


本發(fā)明一些實(shí)施方式在本文中僅作為示例的方式參照附圖進(jìn)行了描述?，F(xiàn)在具體詳細(xì)地參照附圖，需要強(qiáng)調(diào)的是所示的詳情是通過舉例的方式和對本發(fā)明實(shí)施方式舉例說明性討論之目的。在這方面，采用數(shù)字的描述，使本領(lǐng)域中技術(shù)人員清楚地知曉如何能夠?qū)嵤┍景l(fā)明的實(shí)施方式。在附圖中
圖I是舉例說明當(dāng)與細(xì)菌共培養(yǎng)時提高藻類培養(yǎng)物光生氫氣初始產(chǎn)量的直方圖。萊茵衣藻連同裝于透析袋中的熒光假單胞菌一起培養(yǎng)于帶攪拌的密封Roux培養(yǎng)燒瓶中的無硫TAP培養(yǎng)基中。密封7. 5h后除去細(xì)菌，重新密封培養(yǎng)基，并在達(dá)到微氧/厭氧條件之后，檢測氣體的變化，在觀察到氣體產(chǎn)生之后第一個14h內(nèi)收集氣體，分析并定量氣體。氫產(chǎn)量表示為每升培養(yǎng)基的毫升體積。左柱型——藻菌共培養(yǎng)。右柱型——未加細(xì)菌的藻類培養(yǎng)物中的氫產(chǎn)量；圖2是一個直方圖，圖示說明當(dāng)與細(xì)菌共培養(yǎng)時提高藻類培養(yǎng)物光生氫氣總產(chǎn)量的直方圖。萊茵衣藻連同裝于透析袋中的熒光假單胞菌一起培養(yǎng)于帶攪拌的密封Roux培養(yǎng)燒瓶中的無硫TAP培養(yǎng)基中。密封7. 5h后除去細(xì)菌，重新密封培養(yǎng)基，并在達(dá)到微氧/厭氧條件之后，檢測氣體的變化，在氣體產(chǎn)生之后收集氣體，分析并定量直至氣體產(chǎn)生停止。氫產(chǎn)量表示為每升培養(yǎng)基的毫升體積。左柱型——藻菌共培養(yǎng)。右柱型——未加細(xì)菌的藻類培養(yǎng)物中的氫產(chǎn)量；圖3是相比于未加入細(xì)菌的相同藻類培養(yǎng)物中的氣體產(chǎn)量,米用于細(xì)菌共培養(yǎng)的藻類培養(yǎng)物中氣體產(chǎn)生快速和增強(qiáng)的圖形演示。萊茵衣藻連同裝于透析袋中的熒光假單胞·菌一起培養(yǎng)于帶攪拌的密封Roux培養(yǎng)燒瓶中的無硫TAP培養(yǎng)基中。密封7. 5h后除去細(xì)菌，重新密封培養(yǎng)基，并在達(dá)到微氧/厭氧條件之后，檢測氣體的變化，通過排水法收集于量筒中的氣體從密封之時起進(jìn)行72h分析和定量，而在第一個12h期間頻繁檢測。氣體產(chǎn)量表示為隨時間(h，X軸)變化的mL體積(Y-軸)。陰影菱形( )藻菌共培養(yǎng)。開放菱形(O)不加細(xì)菌的藻類培養(yǎng)物中的氣體產(chǎn)量。請注意，第一個36h期間內(nèi)藻菌共培養(yǎng)基中氣體產(chǎn)生的快速動力學(xué)，而在僅僅藻類的培養(yǎng)基內(nèi)沒有顯著的氣體產(chǎn)生。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明，在其一些實(shí)施方式中，涉及藻類中產(chǎn)生氫氣的光催化方法，而更具體而言，而非唯一地，涉及藻菌共培養(yǎng)增強(qiáng)動力學(xué)和提高藻菌光生產(chǎn)生氫的產(chǎn)率。在詳細(xì)解釋說明本發(fā)明至少一個實(shí)施方式之前，應(yīng)該理解到，本發(fā)明并不僅限于其隨后的描述中提及或通過實(shí)施例舉例說明的細(xì)節(jié)之應(yīng)用。本發(fā)明能夠是其他實(shí)施方式或按照其他方式實(shí)踐或?qū)嵤?。此外，?yīng)該理解到，本文中采用的措辭和術(shù)語是出于描述之目的，而不應(yīng)該被視為限制。分子氫是取代或補(bǔ)充化石燃料作為清潔能源的候選能源。天然生物法產(chǎn)生氫是以存在于某些綠藻和能夠接收來自光系統(tǒng)I (PSI)的電子及其轉(zhuǎn)化成氫氣的光合細(xì)菌中的氫酶之存在為基礎(chǔ)的。然而，F(xiàn)E-氫酶對氧的極端敏感性對于這種途徑需要光生產(chǎn)生氫的厭氧條件。采用這種途徑藻類的分子氫產(chǎn)量由于許多原因是很有限的，其中之一是對于生物體光照的同時啟動微氧/厭氧條件的剝硫延長的嚴(yán)重后果。本發(fā)明的發(fā)明人曾試圖通過在剝硫的早期階段的期間向藻類培養(yǎng)物中加入細(xì)菌解決這個問題。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，盡管細(xì)菌共培養(yǎng)具有潛在毒性，但是向光合藻類的培養(yǎng)基中加入細(xì)菌培養(yǎng)物，在剝硫期間，能夠能夠顯著縮短潛伏性進(jìn)行厭氧培養(yǎng)條件建立的正常長度的時間，這反過來允許所培養(yǎng)的藻類光生產(chǎn)氫相比于未加入細(xì)菌培養(yǎng)的類似藻類培養(yǎng)物更加快速(參見實(shí)施例I，圖I和圖3)。與細(xì)菌共培養(yǎng)之后的藻菌光生產(chǎn)氫比未加細(xì)菌的培養(yǎng)基中的記錄情況也更加強(qiáng)烈(參見實(shí)施例I和圖3)。
因此，根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施方式的一個方面，提供了一種產(chǎn)生氫氣的方法，所述方法按序包括(a)在繁殖培養(yǎng)基中繁殖光合藻類，所述繁殖培養(yǎng)基含有硫；(b)在培養(yǎng)基中將所述藻類與細(xì)菌共培養(yǎng)足夠長的一段時間而確保氧降低的培養(yǎng)條件，其中相比于所述繁殖培養(yǎng)基所述培養(yǎng)基包含的硫含量降低；(c)在這種培養(yǎng)基中耗損至少一些細(xì)菌而產(chǎn)生細(xì)菌減少的培養(yǎng)基；(d)在這種培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述藻類足夠長的一段 時間而確保厭氧培養(yǎng)條件；Ce)在這種培養(yǎng)基中于厭氧培養(yǎng)條件下培養(yǎng)所述藻類，由此產(chǎn)生氫氣；和(f)收集所述氫氣。正如本文中所用的術(shù)語藻類，水藻等，是指屬于原生植物門的藻類亞門的植物。這種藻類是單細(xì)胞光合藻類并屬于無更、無莖或葉的非寄生植物；它們包含葉綠素，而所具有的尺寸從顯微尺寸至大型海藻有很大差異。在本發(fā)明一些實(shí)施方式中，使用了綠藻，其屬于真核生物一綠色植物界一綠藻門一綠藻綱。綠藻綱非限制性的實(shí)例包括杜氏藻目(Dunaliellales)、團(tuán)藻目、綠球藻目、鞘藻目、環(huán)藻目、膠毛藻目、微孢藻目和四胞藻目。在一些具體的實(shí)施方式中，這種藻類選自由海洋綠藻，類球紅菌和萊茵衣藻組成的組。在一些具體的實(shí)施方式，使用了萊茵衣藻，其屬于團(tuán)藻目一衣藻科。在其他具體實(shí)施方式
中，使用了菌株萊茵衣藻CC125。然而,在本發(fā)明中有用的藻類也可能是藍(lán)綠色,紅色或棕色的，只要這種藻類能夠產(chǎn)生氫即可。這種光生產(chǎn)氫能力，在自然界中，是由能夠?qū)㈦娮觽鬟f至氫而產(chǎn)生分子氫的Fe-氫酶存在所賦予的。因此，在一個具體實(shí)施方式
中，這種藻類包括具有Fe-氫酶的藻類。適用于本發(fā)明的藻類包括，但不限于，天然存在的藻類(野生型)，栽培藻類菌株，由雜交和選擇工藝過程和遺傳改性藻類產(chǎn)生而具有專門增強(qiáng)性狀的藻類菌株。例如，梅利斯等已公開了硫攝取降低的突變藻類(US20050014239)，而Yacobi等已經(jīng)公開了含遺傳改性的鐵氧化還原蛋白和氫酶的藻類(參見,例如，US20100203609,US20090263846 )。具有專屬特性的藻類也可用于本發(fā)明一些實(shí)施方式的一些方面，例如，具有改性光敏性或光合作用組件的突變藻類(參見，例如，Grossman et al, Photosynth Res2010 ;106:3-17)。突變體藻類及其生產(chǎn)和篩選的方法，等等由Plummer等(US20100273149)和 Hankamer 等(US20090221052)公開。根據(jù)一些實(shí)施方式，這種藻類按照獨(dú)立的、純化的藻類培養(yǎng)物提供。在其他實(shí)施方式中，這種藻類繁殖培養(yǎng)基基本上沒有細(xì)菌封閉殼內(nèi)所包含的細(xì)菌。衣藻培養(yǎng)的通用方法在本領(lǐng)域是公知的，而詳細(xì)描述于《衣藻手冊》(Chlamydomonas Handbook) (Harris, San Diego CA, Academic Press, 2009,其內(nèi)容結(jié)合于本文中作為參考)。藻類中光生產(chǎn)氫的一般方法詳細(xì)描述于Hemschemeir等的論文(Photosynth Res 2009 ;102:523_40)中，其內(nèi)容結(jié)合于本文中作為參考。正如本文所用的詞“培養(yǎng)”是指在有利于其保持生命力的培養(yǎng)基中維持活體細(xì)胞。許多培養(yǎng)基不僅有助于生命力，而且也有助于在合適環(huán)境條件下生長。正如本文所用的術(shù)語“生長”則定義為培養(yǎng)基的擴(kuò)展，即在規(guī)定的一段時間培養(yǎng)基中的生物數(shù)量增加。最常見的生長培養(yǎng)基包括肉湯，明膠和瓊脂，所有這些都包括作為一個組分的硫。這種培養(yǎng)基可能是固體或液體。培養(yǎng)可以按照商業(yè)規(guī)模上進(jìn)行，或者在單個陪替氏培養(yǎng)皿中進(jìn)行。正如本文所用的術(shù)語“繁殖培養(yǎng)基”是指有利于合適環(huán)境條件下藻類生長的培養(yǎng)基。繁殖培養(yǎng)基，正如在本文中所用，通常含有硫化合物，其量足以維持光合藻類的光合作用。適用于本發(fā)明一些實(shí)施方式中的繁殖培養(yǎng)基一個非限制性例子是包含硫化合物的TAP，Tris-醋酸鹽-磷酸鹽。在一些實(shí)施方式中，這種繁殖培養(yǎng)基包含約O. 05至約O. 25mmol作為MgS04、FeS04、ZnSO4和/或CuSO4的硫。在一個具體實(shí)施方式
，這種繁殖培養(yǎng)基包含約
O.I至約O. 15mmol的硫。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式，這種繁殖培養(yǎng)基沒有細(xì)菌封閉殼內(nèi)所含的細(xì)菌。正如本文中所用的術(shù)語“培養(yǎng)基”是指維持藻類處于有極少或沒有生長的活體狀態(tài)下一段持續(xù)培養(yǎng)時間的培養(yǎng)基。在一個實(shí)施方式，這種培養(yǎng)基相比于繁殖培養(yǎng)基所具有的硫含量降低，以至于在這種硫含量降低的培養(yǎng)基中培養(yǎng)光合藻類導(dǎo)致光合作用途徑的放氧功能受到抑制，產(chǎn)生微氧或，表觀上厭氧的條件。適用于本發(fā)明的培養(yǎng)培養(yǎng)基包括，但不限于，TAP培養(yǎng)基，其中的硫化合物(如硫酸鹽)由等摩爾當(dāng)量的含氯化合物代替。在水藻封閉殼內(nèi)的好氧狀態(tài)可以通過測定培養(yǎng)培養(yǎng)基中或培養(yǎng)培養(yǎng)基樣品中的溶解氧進(jìn)行監(jiān)控。例 如，溶解氧能夠采用克拉克電極進(jìn)行測定。在一些實(shí)施方式中，這種培養(yǎng)培養(yǎng)基的硫含量(摩爾當(dāng)量/升)為繁殖培養(yǎng)基硫含量(摩爾當(dāng)量/升)的約50%，約40%，約20%，約10%，約08%，約05%，約01%或更低。在另一具體實(shí)施方式
中，這種培養(yǎng)培養(yǎng)基基本上沒有硫化合物。應(yīng)該理解到，藻類從繁殖培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入貧硫培養(yǎng)培養(yǎng)基必須進(jìn)行藻類沖洗，才能出去痕量的硫。藻類能夠通過溫和離心(例如，室溫下以3，500-5000g離心2 3min)收獲，在所需的培養(yǎng)基中溫和再懸浮進(jìn)行沖洗。這可以按照必要情況進(jìn)行重復(fù)而除去硫化合物。正如本文中所用的術(shù)語“共培養(yǎng)”，是指在相同培養(yǎng)系統(tǒng)中同時培養(yǎng)兩種或多種生物。水藻共培養(yǎng)的一個非限制性實(shí)例是在足夠維持藻類和所加生物的生命力，和/或一種生物或另一種或這兩種生物生長的條件下向藻類培養(yǎng)物中簡單加入第二生物(例如，細(xì)菌)。應(yīng)該理解到，本文中所用的“共培養(yǎng)”，是指至少依據(jù)細(xì)菌/藻類類型或組分和/或其濃度在自然界不存在的人造培養(yǎng)基。在本發(fā)明一些實(shí)施方式中，藻類與細(xì)菌一起進(jìn)行共培養(yǎng)，才能縮短剝硫和建立藻類產(chǎn)氫的微氧和/或厭氧條件之間的潛伏期。在一個具體實(shí)施方式
中，細(xì)菌是耗氧細(xì)菌，如專性好氧或兼性厭氧細(xì)菌。微需氧細(xì)菌，厭氧細(xì)菌和耐氧細(xì)菌并不消耗顯著大量的氧，但如果發(fā)現(xiàn)這種細(xì)菌在降硫培養(yǎng)基中與光合藻類共培養(yǎng)時有助于降低溶解氧，也能夠適用于本發(fā)明。本發(fā)明中中適用于的好氧細(xì)菌的非限制性列表包括芽孢桿菌屬，諾卡氏菌屬，Myco細(xì)菌，假單胞菌屬等。在一個具體實(shí)施方式
中，好氧細(xì)菌是假單胞菌屬細(xì)菌。在一些具體的實(shí)施方式，好氧細(xì)菌是熒光假單胞菌，而藻類是萊茵衣藻。藻類封閉殼能夠包含以一定數(shù)量的細(xì)胞密度培養(yǎng)的藻類。培養(yǎng)基中或共培養(yǎng)基中的藻類密度包括約IO3至約IO8個藻類細(xì)胞/mL，約IO4至約IO7個藻類細(xì)胞/mL，約IO5至約IO6個藻類細(xì)胞/mL。在一個具體的實(shí)施方式中，共培養(yǎng)基中的藻類密度包括(3飛)X106個細(xì)胞/mL。在另一個具體實(shí)施方式
中，共培養(yǎng)基中的藻類密度包含(3飛)X IO7個細(xì)胞/mL。細(xì)菌細(xì)胞通常由新鮮的中等對數(shù)期細(xì)菌培養(yǎng)物，在建立微氧/厭氧條件之前可稀釋高達(dá)1:10或更多倍使用。在一個具體的實(shí)施方式，對于每升的共培養(yǎng)基，來自IL細(xì)菌培養(yǎng)物的中等對數(shù)期細(xì)菌細(xì)胞被制成小球，在培養(yǎng)基中按照約1:10稀釋，而將一定體積的稀釋細(xì)菌培養(yǎng)物按照本文中詳述的比率引入到細(xì)菌封閉殼中。
這種藻菌共培養(yǎng)基能夠包含從約1:1藻類/細(xì)菌比，至約1:2，約1:3，約1:4，約 1:5，約 1:10，約 1:20，約 1:30，約 1:40，約 1:50，約 1:60，約 1:70，約 1:80，約 1:90，約1:100，約1:150，約1:200，約1:400，約1:500,1:1000的藻類/細(xì)菌比，或更大的不同藻類
/細(xì)菌比生物比率。藻菌共培養(yǎng)基中的藻類/細(xì)菌比率也能夠按照體積表示一因此,根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式，共培養(yǎng)基的藻類和細(xì)菌組分是分開的，由此這種共培養(yǎng)基包含藻類封閉殼和細(xì)菌封閉殼，而共培養(yǎng)基中的藻類培養(yǎng)物體積比細(xì)菌封閉殼中細(xì)菌體積大約fioo倍，比細(xì)菌封閉殼中細(xì)菌體積大約5 50倍，比細(xì)菌封閉殼中細(xì)菌體積大約1(Γ40倍，比細(xì)菌封閉殼中細(xì)菌體積大約2(Γ30倍而比細(xì)菌封閉殼中細(xì)菌體積大約2(Γ25倍。在具體實(shí)施方式
中，共培養(yǎng)基中的藻類培養(yǎng)物體積比細(xì)菌封閉殼中細(xì)菌體積大約20倍，例如，在細(xì)菌封閉殼中約50mL細(xì)菌培養(yǎng)物而在藻類封閉殼內(nèi)約IL藻類培養(yǎng)物。
根據(jù)一些實(shí)施方式,這種細(xì)菌和藻類共培養(yǎng)于獨(dú)立封閉殼內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，這種封閉殼的分離是為了改善藻類培養(yǎng)物的光照效率。在其他實(shí)施方式中，分開操作使細(xì)菌封閉殼能夠很簡單地將細(xì)菌封閉殼引入和移出系統(tǒng)，例如，在剝硫后接近微氧/厭氧條件之后減少和/或除去細(xì)菌培養(yǎng)物，或在收集氫氣之前從藻類培養(yǎng)物中減少或除去細(xì)菌培養(yǎng)物。根據(jù)本發(fā)明的一些方面，藻類和細(xì)菌的封閉殼流體連接而通過流體和氣體可滲透而細(xì)菌不可滲透的屏障相互分離。正如本文中所用的術(shù)語“流體連接”是指流體能夠在藻類和細(xì)菌的封閉殼之間移動的能力。這種流體連接能夠弓I導(dǎo)流體連接，例如，其中細(xì)菌封閉殼浸沒于藻類封閉殼的培養(yǎng)基中，或遠(yuǎn)離而間接進(jìn)行流體連接，例如，通過流體連接器如管道、管道系統(tǒng)、通道、導(dǎo)管等方式連接。在一個實(shí)施方式中，遠(yuǎn)離而間接流體連接包括藻類封閉殼的容器和細(xì)菌封閉殼的獨(dú)立遠(yuǎn)程容器，通過合適的管道系統(tǒng)(例如，塑料，玻璃，橡膠，不銹鋼)連接，可選地進(jìn)一步包括泵送設(shè)備，過濾設(shè)備和控制設(shè)備(例如，閥門)而將培養(yǎng)基在兩種封閉殼之間循環(huán)通過。藻類和細(xì)菌的封閉殼可以處于燒瓶、槽、池、套管、反向流設(shè)備，中空纖維等中，或?qū)ｉT設(shè)計(jì)的生物反應(yīng)器中。例如，藻類和細(xì)菌的封閉殼能夠是任何尺寸的，而能夠容納的體積范圍為約O. riL, IL 約10L, 10升 約1000L, 1000 約10，000L,50，000L或更大。在大型池子或生物反應(yīng)器的情況下，可以設(shè)想1(Γ100，1000和更多立方米的體積。在一個具體實(shí)施方式
中，藻類封閉殼是一個I. IL的Roux培養(yǎng)瓶而細(xì)菌封閉殼是50mL的透析袋。藻類和細(xì)菌共培養(yǎng)的方法和生物反應(yīng)器在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的，而例如詳細(xì)描述于《衣藻手冊》(Chlamydomonas Handbook) (Harris, San Diego CA, AcademicPress，2009，其內(nèi)容結(jié)合于本文中作為參考)。為其用途的專用光生物反應(yīng)器和方法由Eriksen進(jìn)行了詳細(xì)描述(Biotechnol Letters, 2008 ; 1525-36，其內(nèi)容結(jié)合于本文中作為參考)。在一些實(shí)施方式中，這種細(xì)菌封閉殼進(jìn)一步包括碳源，例如葡萄糖、淀粉，脂質(zhì)，蛋白
坐寸ο產(chǎn)氫是在“微氧條件”下進(jìn)行的，這種微氧條件是指保持最小氧濃度而使之避免氫酶失活，并且一般是指基本上厭氧的環(huán)境。為了建立微氧/厭氧條件，藻類或藻菌培養(yǎng)基在引入貧硫培養(yǎng)基之后進(jìn)行密封。密封可以通過任何排除曝露空氣或周圍環(huán)境氣體的工具，如柔性橡膠或氯丁橡膠密封件，玻璃，塑料或橡膠塞，蠟，等，或通過能夠設(shè)置排出氣體的兩通或三通或多通閥完成。任選培養(yǎng)基能夠在引入貧硫培養(yǎng)基之后用惰性氣體(例如，氬)沖洗。
根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的一個方面，藻類和細(xì)菌封閉殼通過氣體和流體可滲透而細(xì)菌不可滲透的屏障相互隔離。這種屏障通常包括多孔過濾器，和/或具有孔小足以排阻細(xì)菌細(xì)胞而大至足以容許流體和培養(yǎng)基小分子組分自由通過的孔道的膜。這種屏障可以包括Micropore 或Millipore 過濾器，而可滲透性小于50nm孔徑，坐落于插入藻類和細(xì)菌的封閉殼之間的流體連接器中的合適過濾器外殼中。在另一實(shí)施方式中，這種屏障是藻類和細(xì)菌的封閉殼之間隔膜和隔離壁的整體部件。在本發(fā)明一個具體實(shí)施方式
中，這種細(xì)菌封閉殼和藻類封閉殼是直接流體連接的，細(xì)菌封閉殼浸沒于藻類封閉殼的培養(yǎng)基中。在這樣一個實(shí)施方式中，屏障可能包括大部分，或甚至整個細(xì)菌封閉殼表面。在一個非限制性實(shí)例中，這種細(xì)菌封閉殼包括由氣體和流體可滲透而細(xì)菌不可滲透的屏障制成的袋子或套管，如透析袋。在一個具體實(shí)施方式
中，細(xì)菌封閉殼是密封的透析袋，而這種屏障是纖維素或類纖維素滲透膜，可滲透高達(dá)6kD的分子，由此容許流體和小分子(例如，鹽和有機(jī)溶質(zhì))組分在細(xì)菌和藻類封閉殼之間循環(huán)通過，但是排阻活的和死亡藻類和細(xì)菌細(xì)胞，以及大分子碎片。這種細(xì)菌封閉殼容許從藻類封閉·殼的培養(yǎng)基中輕松引入和移出。因此，根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式，在于藻類共培養(yǎng)之后，這種培養(yǎng)培養(yǎng)基中的細(xì)菌被消耗而產(chǎn)生細(xì)菌減少的培養(yǎng)基。細(xì)菌消耗和產(chǎn)生細(xì)菌減少的培養(yǎng)基能夠通過從細(xì)菌封閉殼中除去部分(例如，1%，5%，10%, 20%, 40%, 50%, 75%或更多)細(xì)菌，有效減少這種培養(yǎng)培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)目而完成。在一些實(shí)施方式中，消耗了約100%的細(xì)菌，產(chǎn)生基本無細(xì)菌的培養(yǎng)基培養(yǎng)基。在細(xì)菌和藻類封閉殼間接流體連接的情況下，這很容易通過如同閥門或塞子一樣中斷這些封閉殼之間的流體連接而實(shí)現(xiàn)。在采用直接流體連接的情況下，如同細(xì)菌封閉殼直接浸沒于藻類封閉殼內(nèi)一樣的情況，細(xì)菌封閉殼能夠通過簡單機(jī)械移出(例如，移出透析袋)而從藻類封閉殼中移出藻類封閉殼，在藻類封閉殼中獲得基本無細(xì)菌的培養(yǎng)基培養(yǎng)基。根據(jù)一些實(shí)施方式，藻類和細(xì)菌持續(xù)共培養(yǎng)，直至耗盡細(xì)菌的持續(xù)時間為，約O. 5，約1，約I. 5，約2，約2. 5，約3，約3. 5，約4，約4. 5，約5，約5. 5，約6，約6. 5，約7，約7. 5，約8，約
8.5，約9，約10，約11，約12，約13，約15，約17，約20，約25，約30，約35，約40h或更長時間。在一些實(shí)施方式中，藻類和細(xì)菌共培養(yǎng)持續(xù)時間為約30h。在其他實(shí)施方式中，藻類和細(xì)菌共培養(yǎng)持續(xù)時間為約15h。在其他實(shí)施方式中，藻類和細(xì)菌共培養(yǎng)持續(xù)時間為約7. 5h。在其他實(shí)施方式中，藻類和細(xì)菌共培養(yǎng)持續(xù)時間為約4h。在一些實(shí)施方式中，藻類和細(xì)菌共培養(yǎng)持續(xù)時間直至在高強(qiáng)度光照下光合放氧和細(xì)胞呼吸氧氣消耗之間達(dá)到平衡，例如，藻類細(xì)胞呼吸耗氧大于或等于藻類通過光合作用放氧。藻類培養(yǎng)物的氧耗量通過在一段預(yù)定的時間(例如，5分鐘)內(nèi)在培養(yǎng)基樣品中，或整個培養(yǎng)基中，例如，用克拉克(Clark)電極(有和無碳酸氫鈉)，或氣相色譜儀測量溶解氧而進(jìn)行測定，而同時培養(yǎng)基或樣品無足夠光照進(jìn)行光合作用。在一些實(shí)施方式中，藻類和細(xì)菌共培養(yǎng)在將藻類培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入剝硫培養(yǎng)基中之后立即開始，而細(xì)菌部分或完全從共培養(yǎng)基中消耗，此時測量值指示藻類培養(yǎng)物消耗的氧量等于，或大于，藻類光合作用產(chǎn)氧量，這都在高強(qiáng)度光照下進(jìn)行測量。在一些實(shí)施方式中，平衡在約1，約I. 5，約2，約2. 5，約3，約3. 5，約4，約4. 5，約5，約5. 5，約6，約6. 5，約7，約7. 5，約8，約8. 5，約9，約10，約11，約12，約13，約15，約17，約20，約25，約30，約35，約40，約45，約50，約55h或更長時間達(dá)到。在一些實(shí)施方式中，光合放氧和細(xì)胞呼吸氧氣消耗之間的平衡在約30h內(nèi)達(dá)到。在其他實(shí)施方式中，光合放氧和細(xì)胞呼吸氧氣消耗之間的平衡在約15h內(nèi)達(dá)到。在其他實(shí)施方式中，光合放氧和細(xì)胞呼吸氧氣消耗之間的平衡在約7. 5h內(nèi)達(dá)到。在其他實(shí)施方式中，光合放氧和細(xì)胞呼吸氧氣消耗之間的平衡在約4h內(nèi)達(dá)到。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的另一方面，在從這種培養(yǎng)基中將消耗細(xì)菌之后，密封藻類封閉殼，并將這種藻類培養(yǎng)于這種培養(yǎng)基中足夠長的一段時間而確保微氧/厭氧條件，這對于光合藻類中的光生產(chǎn)氫是至關(guān)重要的。根據(jù)一些實(shí)施方式，培養(yǎng)的持續(xù)時間，從藻菌共培養(yǎng)開始，直至建立微氧/厭氧條件，為約1，約I. 5，約2，約2. 5，約3，約3. 5，約4，約4. 5，約5，約5. 5，約6，約6. 5，約7，約7. 5，約8，約8. 5，約9，約10，約11，約12，約13，約15，約17，約20，約25，約30，約35，約40，約45，約50，約55，約60h或更長時間。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)，從藻菌共培養(yǎng)開始，直至建立微氧/厭氧條件，進(jìn)行約Γ約60h，約10 約40h，和約30h。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的另一方面，在密封的藻類培養(yǎng)物中建立微氧/厭氧條件之后，藻類進(jìn)一步在微氧/厭氧條件下培養(yǎng)而產(chǎn)生氫氣。根據(jù)一些實(shí)施方式，微氧/厭氧 條件下的培養(yǎng)持續(xù)時間為約1，約I. 5，約2，約2. 5，約3，約3. 5，約4，約4. 5，約5，約5. 5，約6，約6. 5，約7，約7. 5，約8，約8. 5，約9，約10，約11，約12，約13，約15，約17，約20，約25，約 30，約 35，約 40，約 45，約 50，約 55，約 60，約 75，約 80，約 90，約 100，約 110，約 120h,約6，約7，約8，約9約10或更多天。在一些實(shí)施方式中，微氧/厭氧條件下的培養(yǎng)持續(xù)時間直至不再檢測到放氫為止。藻類培養(yǎng)物能夠在光生產(chǎn)氫效率停止或效率顯著損失之后進(jìn)行再利用。這種藻類能夠通過在好氧條件下返回至繁殖培養(yǎng)基(在經(jīng)過足夠沖洗和再懸浮之后)，并對藻類光照足夠長的一段時間重新建立強(qiáng)有力的光合作用和生長而“復(fù)原”，接著根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行另一周期的光生產(chǎn)氫培養(yǎng)。藻類培養(yǎng)物的再利用通過將藻類粘附至三維半固體或固體載體、基質(zhì)或凝膠組件，如藻酸鹽、塑料珠、纖維、氈墊、薄板等上而能夠進(jìn)一步變得方便，因?yàn)檫@些能夠能方便地從培養(yǎng)基或繁殖培養(yǎng)基中移出，沖洗并轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基中。收集，檢測，純化和計(jì)算藻類培養(yǎng)物的氫氣產(chǎn)率在本領(lǐng)域中是總所周知的，而詳細(xì)描述于，例如，《衣藻手冊》(Chlamydomonas Handbook) (Harris, San Diego CA, AcademicPress, 2009,其內(nèi)容在此引用作為參考)和Hemschemeir等的論文(Hemschemeir et al,Photosynth Res 2009 ;102:523_40)，其內(nèi)容在此引用作為參考。根據(jù)一個具體實(shí)施方式
，藻類培養(yǎng)物產(chǎn)生的氣體經(jīng)由管道排出，通過排水法收集，記錄體積并通過，例如，克拉克電極，和/或色譜儀，如氣相色譜分析氣體組分。正如本文所示，根據(jù)本發(fā)明的方法與所加細(xì)菌共培養(yǎng)的藻類培養(yǎng)物比未加細(xì)菌的相同培養(yǎng)基產(chǎn)生氫氣更迅速，而產(chǎn)生的氫氣量更大(參見實(shí)施例I，和附圖1，2和3)?？s短藻類開始在減硫培養(yǎng)基中培養(yǎng)而建立能夠光生產(chǎn)氫的微氧/厭氧培養(yǎng)條件的時間長度，無論是根據(jù)培養(yǎng)基中藻類的存活力還是根據(jù)藻菌光生產(chǎn)氫的商業(yè)價值，相比于藻類生產(chǎn)的競爭方法，都極具重要意義。因此，根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的一些方面，提供了一種產(chǎn)生氫氣的方法，這種方法包括(a)在繁殖培養(yǎng)基中繁殖光合藻類，所述繁殖培養(yǎng)基含有硫；( b )在相比于所述繁殖培養(yǎng)基包含的硫含量降低的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述藻類足夠長的一段時間而建立厭氧培養(yǎng)條件，其中這個培養(yǎng)與所加細(xì)菌共培養(yǎng)至少一部分所述時間長度；(C)在這種培養(yǎng)基中于厭氧培養(yǎng)條件下培養(yǎng)所述藻類，由此產(chǎn)生氫氣；和(d)收集氫氣，其中相比于未與所加細(xì)菌共培養(yǎng)的藻類類似培養(yǎng)時間長度步驟(b)厭氧培養(yǎng)條件的時間長度減少。在一些實(shí)施方式中，厭氧條件的時間長度減少至未與所加細(xì)菌共培養(yǎng)的藻類相同培養(yǎng)基中好氧條件的時間長度的約90%，約80%，約75%，約70%，約60%，約50%，約40%，約30%,約25%,約20%,約15%,約10%或更短。在本發(fā)明一些實(shí)施方式中，這種培養(yǎng)，從藻菌共培養(yǎng)開始，直至 建立微氧/厭氧條件，進(jìn)行約4 約60h，約1(Γ約40h和約30h。在一些實(shí)施方式中，共培養(yǎng)的藻類培養(yǎng)物微氧/厭氧條件的時間長度為未共培養(yǎng)的藻類培養(yǎng)物微氧/厭氧條件的時間長度的約50%。因此，在一些實(shí)施方式中，足以建立微氧/厭氧條件的至少一部分時間長度為約1，約1.5，約2，約2. 5，約3，約3. 5，約4，約4. 5，約5，約5. 5，約6，約6. 5，約7，約7. 5，約8，約8. 5，約9，約10，約11，約12，約13，約15，約17，約20，約25，約30，約35，約40，約45，約50，約55，約 60h。藻類培養(yǎng)物光生產(chǎn)氫需要光照。在一些實(shí)施方式中，光照提供于微氧/厭氧條件下培養(yǎng)藻類的期間。在一些實(shí)施方式中，光照提供于整個該方法的任何或所有步驟。在其他實(shí)施方式中，暗適應(yīng)時間能夠可選地包括于建立微氧/厭氧條件的期間。在一些實(shí)施方式中，黑暗時間從這種藻類剝(消耗)硫開始延長1，約I. 5，約2，約2. 5，約3，約3. 5，約4，約4. 5，約5，約5. 5，約6，約6. 5，約7，約7. 5，約8，約8. 5，約9，約IOh或更長時間。在其他實(shí)施方式中，黑暗時間從剝硫開始延長5h。在一些實(shí)施方式中，光照強(qiáng)度在該方法的不同部分期間是不同的。例如，在藻類的繁殖期間光照強(qiáng)度的范圍可能出于10(Γ250μπιΟ1光子· m_2 · s—1的范圍，而在剝硫和建立微氧/厭氧條件期間光照強(qiáng)度可能較低，而隨后在微氧/厭氧培養(yǎng)條件下培養(yǎng)產(chǎn)氫和收集期間增大。確定光照強(qiáng)度要考慮的因素包括，但不限于，藻類培養(yǎng)中的光敏性，藻類培養(yǎng)物中的密度和藻類培養(yǎng)物的光可滲透性/不透明性，剝硫和微氧/厭氧條件下培養(yǎng)的代謝結(jié)果(例如，產(chǎn)生游離自由基，代謝廢物等)。光照通常外部提供。光照可以是自然光照，如陽光，或人工合成和提供的。對于陽光，本發(fā)明的方法通常戶外實(shí)施，利用白晝期間可供使用的太陽光。其他人工光照能夠在黑夜期間加入。如果需要，降低光照能夠通過容器、生物反應(yīng)器、槽罐、池子或其他藻類封閉殼遮光而實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方式中，光照可選地內(nèi)部提供，即從藻類封閉殼內(nèi)部，例如，通過浸沒于藻類或藻菌培養(yǎng)基中光照裝置提供。在另一實(shí)施方式中，藻類封閉殼圍繞光源設(shè)計(jì)。人造光照能夠通過白熾燈，熒光燈，LED或其他光源提供。在一些實(shí)施方式中，這種光照通過熒光或LED光照，以最小化強(qiáng)光照期間產(chǎn)生的熱量。在光照進(jìn)行光生產(chǎn)氫期間，光可能來自人造光源或自然陽光，并必須足以進(jìn)行光合作用。在一個實(shí)施方式中，這種光強(qiáng)度為15 3100 μ mo I光子· πΓ2 · s_1 (而所有的范圍為，如100 3000，1000 2000，1200 1800等)而光照持續(xù)高達(dá)120h (但可能進(jìn)行較短時間，如24，48，64或96h)。可選地，可以使用高強(qiáng)度光照的光源提供約1300μπιΟ1光子·πΓ2 · S-1的強(qiáng)度。在一些實(shí)施方式中，光生產(chǎn)生氫期間的光照為80 μ E。在一些實(shí)施方式中，光生產(chǎn)生氫期間的光照為200 μ Ε。由于藻類是海洋生物，對光合作用途徑中最有效的那些藻類優(yōu)化光照波長可能是有利的。在野生型藻類，以及許多改性的藻類中，光化光照(類似于通過水過濾陽光)是最有效的，而能夠通過照射通過1% w/v的CuSO4溶液實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明一些實(shí)施方式中，藻類培養(yǎng)物和/或與細(xì)菌共培養(yǎng)在環(huán)境溫度下實(shí)施。在其他實(shí)施方式中，溫度經(jīng)過控制，例如，保持培養(yǎng)基中約25°C。生物反應(yīng)器中溫度控制的方法在本領(lǐng)域中公知的。進(jìn)一步根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供了一種產(chǎn)生氫氣的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括
(a)密封培養(yǎng)容器(或多個容器)，包含在相比于藻類繁殖培養(yǎng)基硫含量降低的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)的光合藻類和細(xì)菌；(b)培養(yǎng)容器光照光源；和(c)從所述培養(yǎng)容器收集氫氣的裝置，其中所述細(xì)菌包含于流體連接于藻類封閉殼的細(xì)菌封閉殼內(nèi)，這種藻類封閉殼由此通過流體-和氣體-可滲透而細(xì)菌不可滲透的屏障與之隔離。本發(fā)明的系統(tǒng)能夠以進(jìn)一步包括用于在其各自的封閉殼內(nèi)攪拌細(xì)菌和/或藻類培養(yǎng)物的裝置，細(xì)菌和藻類封閉殼溫度控制裝置，用于從藻類和/或細(xì)菌封閉殼對培養(yǎng)基和氣體采樣的裝置或氣體收集裝置，和密封藻類封閉殼建立和維持微氧/厭氧培養(yǎng)條件的合適裝置。本發(fā)明的系統(tǒng)可以采用藻類和細(xì)菌封閉殼之間合適的常見流體連接裝置，泵送、循環(huán)和流量調(diào)節(jié)裝置，過濾裝置和常見的氫氣收集裝置連接多個系統(tǒng)。培養(yǎng)容器優(yōu)選由透明或半透明材料制成成形而讓光透過。光生物反應(yīng)器及其使用方法由Eriksen進(jìn)行了詳細(xì)描述(Biotechnol Letters, 2008 ;1525_36，其內(nèi)容完全結(jié)合于本文中作為參考)。通過本發(fā)明的方法和系統(tǒng)生成和收集的氫可以通過低溫貯藏而存儲為壓縮氣體，液化氣體，化學(xué)上作為遇熱釋放氫的化合物等。存儲的氫可用于氨生產(chǎn)，石油轉(zhuǎn)化成較輕燃料(加氫裂化)，燃料電池等。預(yù)期在由這種應(yīng)用成熟的專利壽命期間，將會開發(fā)出許多相關(guān)方法而術(shù)語光生產(chǎn)氫的范圍預(yù)想可推知涵蓋所有這種新技術(shù)。正如本文中所用的術(shù)語“約”是指±10%。術(shù)語“包含”，“含有”，“包括”，“含”，“具有”和其他詞法變化是指“包括但不限于”。術(shù)語“由…構(gòu)成”是指“包括而限于”。術(shù)語“基本由..構(gòu)成”是指只要其他成分、步驟和/或部件不會實(shí)質(zhì)性改變要求保護(hù)的組合物、方法或結(jié)構(gòu)的基本和新穎特性，組合物、方法或結(jié)構(gòu)可能包括其他成分，步驟和/或部件。正如本文中所用的單數(shù)形式“一個”，“一種”和“這種”包括復(fù)數(shù)引用，除非上下文另外明確指出。例如，術(shù)語“化合物”或“至少一種化合物”可能包括多種化合物，包括其混合物。在整個本申請中，本發(fā)明各種實(shí)施方式可能以范圍形式呈現(xiàn)。應(yīng)該理解到，按照范圍格式描述僅僅是為了方便和簡潔，而不應(yīng)該解釋為對本發(fā)明范圍的僵硬限制。因此，范圍的描述應(yīng)該當(dāng)作具體公開了所有可能的子范圍，以及在該范圍內(nèi)的各個數(shù)值。例如，描述的一個范圍，例如I飛應(yīng)該視為具體公開的子范圍，如f 3，Γ4, Γ5, 2 4，2飛，3飛等，以及在該范圍內(nèi)的各個數(shù)，例如，1，2，3，4，5和6。這無論范圍的寬度如何都適用。每當(dāng)本文中指示一個數(shù)值范圍時，這意味著包括指定范圍內(nèi)的任何引用數(shù)值(分?jǐn)?shù)或整數(shù))。短語“處于/介于”第一個指示數(shù)和第二個指示數(shù)之間和“介于從”第一個指示數(shù)“至”第二個指示數(shù)的范圍在本文中可以互換使用，而是指包括第一個和第二個指示數(shù)及其之間的所有分?jǐn)?shù)和整數(shù)。正如本文中所用的術(shù)語“方法”是指完成給定任務(wù)的方式，手段，技術(shù)和過程步驟，包括但不限于，用于實(shí)現(xiàn)一個給定的任務(wù)，包括，但不限于，化學(xué)，藥理，生物，生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的從業(yè)者已知的，或方便由已知的方式，手段，技術(shù)和過程步驟開發(fā)的那些方式，手段，技術(shù)和過程步驟。應(yīng)該理解到，本發(fā)明的某些功能特性，為清楚起見，描述于獨(dú)立實(shí)施方式的上下文中，也可以在單個實(shí)施方式中組合提供。相反，本發(fā)明的各種功能特性，為清楚起見，描述于單一實(shí)施方式的上下文中，也可以單獨(dú)提供或以任何合適的子組合或根據(jù)合適而在任何其他描述的本發(fā)明實(shí)施方式中提供。各種實(shí)施方式上下文中描述的某些功能特性不要當(dāng)作這 些實(shí)施方式至關(guān)重要的功能特性，除非這個實(shí)施方式在沒有這些元件就是無效的。本文以上內(nèi)容描繪的和以下權(quán)利要求部分要求授權(quán)的本發(fā)明各種實(shí)施方式和方面，將在以下實(shí)施例中找到實(shí)驗(yàn)支持。實(shí)施例現(xiàn)在參考下面的實(shí)施例，這些實(shí)施例與前面的說明一起，以非限制的方式說明本發(fā)明的一些實(shí)施方式?？傮w上，在此使用的命名和在本發(fā)明中使用的實(shí)驗(yàn)室步驟包括分子技術(shù)，生物化學(xué)技術(shù)，微生物學(xué)技術(shù)以及重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中進(jìn)行了充分地說明。參見，例如，“Molecular Cloning: A laboratory Manual，，Sambrook 等人，(1989);“Current Protocols in Molecular Biology” 卷 I-III, Ausubel, R. M.編著(1994);Ausubel 等人，“Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989) ;Perbal,“A Practical Guide to Molecular Cloning”,Johnffiley&Sons, New York(1988) ;Watson 等人，“Recombinant DNA”，Scientific AmericanBooks, New York ；Birren 等人(編著)“Genome Analysis: A Laboratory ManualSeries”,卷 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998);在美國專利號 4，666，828,4, 683，202,4, 801，531,5, 192，659 以及 5，272，057 中提出的方法;“CellBiology:A Laboratory Handbook”,卷 I-III, Cellis, J. E.編著(1994) ；uCulture ofAnimal Cell-A Manual of Basic Technique”，F(xiàn)reshney, ffiley-Liss, N. Y. (1994),第三版；“Current Protocols in Immunology，，卷 I-III, Coligan, J. E.編著(1994) ；Stites等人(編著)，“Basic and Clinical Immunology”(第八版)，Appleton&Lange, Norwalk,CT (1994) ;Mishell 和 Shiigi (編著)，“Selected Methods in Cellular Immunology”,ff. H. Freeman and Co. , New York (1980);可供使用的免疫測定法廣泛描述于專利和科技文獻(xiàn)中，參見例如，美國專利號 3，791,932 ；3, 839, 153 ;3，850，752 ;3，850，578 ;3，853，987 ；3，867，517 ;3，879，262 ;3，901，654 ;3，935，074 ;3，984，533 ;3，996，345 ;4，034，074 ；4，098，876 ;4，879，219 ;5，011，771 以及 5，281，521 ,Oligonucleotide Synthesis”Gait，M. J.編著(1984) ;“Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D.和 Higgins S. J.編著(1985) -,uTranscription and Translation” Hames, B. D.和 Higgins S. J.編著(1984) ；^Animal Cell Culture”Freshney，R. I.編著(1986) Immobilized Cell andEnzymes^IRL Press,(1986) ;“A Practical Guide to Molecular Cloning^Perbal,B.編著(1984)和“Methods in Enzymology” 卷 1-317, Academic Press ;“PCR Protocols:AGuide to Methods And Applications，，，Academic Press, San Diego, CA(1990) ；Marshak等人，“Strategies for Protein Purification and Characterization-A LaboratoryCourse Manual” CSHL Press (1996);所有這些都通過引用結(jié)合在此，其程度就像在此完全地提出一樣。遍及本文件還提供了其他一般性參考文件。其中的步驟被認(rèn)為是本領(lǐng)域熟知的并且提供以方便讀者。其中包含的所有信息都通過引用結(jié)合在此。實(shí)施例I-在藻-菌共培養(yǎng)物中快速地并且增強(qiáng)地光生產(chǎn)分子氫為了確定需氧細(xì)菌的同時培養(yǎng)是否能夠促進(jìn)硫消耗(sulfur depletion)期間的厭氧生活以及增強(qiáng)光合藻類中光生產(chǎn)氫的效率，將細(xì)菌與綠藻共培養(yǎng)，并 且確定氫生產(chǎn)的動力學(xué)和體積。材料和方法藻類繁殖使萊茵衣藻菌株CC125生長于培養(yǎng)皿中的Tris-乙酸鹽-磷酸鹽固體培養(yǎng)基(pH 7. O)中。將藻類接種于6個40mL塑料燒瓶中，接種于各自含有硫化合物的20mL Tris-乙酸鹽-磷酸鹽(TAP)培養(yǎng)基(pH=7. O)中，并且在200 μ mo I光子·πι2 s—1冷白光連續(xù)照射強(qiáng)度下以及在25°C溫度下在振蕩(80RPM)下孵化持續(xù)48小時。在達(dá)到藻類對數(shù)生長期Γ . 2 X IO6個細(xì)胞/mL)的O. 2之后，將燒瓶中的培養(yǎng)物與2. 5L TAP培養(yǎng)基混合于2個I. IL-Roux中并且在連續(xù)攪拌以及用空氣中5%C02鼓泡下，在200 μ mo I光子· m2 · s—1連續(xù)冷白光照射強(qiáng)度下進(jìn)行生長，直至達(dá)到對數(shù)生長晚期Γ3Χ IO7個細(xì)胞/mL)。用血球計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)來測量培養(yǎng)密度。細(xì)菌培養(yǎng)在振蕩(200RPM)下將熒光假單胞菌種于補(bǔ)充有100 μ g/mL氨芐青霉素的I. OLLB培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移到2. OL愛倫美氏(Erlenmeyer)燒瓶中并且在30°C下孵化4小時直至達(dá)到對數(shù)生長中期。硫剝奪和光生產(chǎn)氫藻類培養(yǎng)物在對數(shù)生長晚期通過離心(6，000RPM離心10分鐘)進(jìn)行收獲并且用無硫化合物的TAP (pH 7.0)培養(yǎng)基(硫化合物用等摩爾的氯化合物替代)洗滌3次，并轉(zhuǎn)入2個各自裝有TAP-S (無硫TAP)溶液(pH 7. 0)的I. IL反應(yīng)器(Roux培養(yǎng)瓶)中。這些反應(yīng)器用200 μ mol光子· m2 · s—1的冷白光熒光照明進(jìn)行照射。在硫剝奪的第一個30小時期間，從反應(yīng)器中移開培養(yǎng)物樣品。在黑暗中測量樣品的氧呼吸率，緊接著在光照下測量光合作用氧生產(chǎn)量以及氧呼吸作用量。在30小時之后，當(dāng)光合作用氧生產(chǎn)量已經(jīng)降低到等于或小于氧呼吸作用時，用硅橡膠隔膜將反應(yīng)器密封。通過排水法將釋放的氣體收集在量筒中。在孵化結(jié)束時，對反應(yīng)器頂空的氣體取樣，并且確定產(chǎn)生的氫氣量(濃度X體積)。細(xì)菌共培養(yǎng)在離心機(jī)中將細(xì)菌培養(yǎng)物(IL)粒化，并分離上清液。然后將培養(yǎng)物洗滌，懸浮于50mL無硫TAP，pH 7. O中(也用于藻類)，并放入配合反應(yīng)器尺寸填裝的透析袋(6Kd截止值)中。加入O. 5%葡萄糖。在硫剝奪開始時將細(xì)菌培養(yǎng)物加入藻類培養(yǎng)物中。氫氣收集和測量如上所述，在產(chǎn)氫期間通過排水法將來自反應(yīng)器的氫氣收集到量筒中，或從反應(yīng)器頂空取樣。在50° C溫度下在T⑶檢測器(30m)柱中通過氣相色譜法測量I. OmL樣品中的氫，使用氮?dú)庾鳛檩d氣。根據(jù)純氫的標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算出氣體混合物中氫的體積。溶解氧的測定通過克拉克(Clark)型電極測量溶解氧。在具有和不具有碳酸氫鈉下，對從反應(yīng)器采集的3mL培養(yǎng)物樣品，進(jìn)行黑暗中氧呼吸率測量，緊接著進(jìn)行光照下光合作用氧生產(chǎn)率測量，減去氧呼吸率，每次測量持續(xù)5分鐘。在1，300 μ mol光子· m2 · s—1強(qiáng)度下通過幻燈機(jī)照射這些樣品。光通過填充有1.0%CuS04 (w/v)溶液的40mL塑料燒瓶進(jìn)行過濾。結(jié)果通過藻-菌共培養(yǎng)物快速缺氧以及光生產(chǎn)氫氣 萊茵衣藻菌株CC125與熒光假單胞菌一起培養(yǎng)。在第I個實(shí)驗(yàn)中，將IL 3-6X106個藻/mL與50mL熒光假單胞菌一起培養(yǎng)于
I.IL Roux瓶中。對細(xì)菌和藻類的濃度和氧呼吸作用進(jìn)行測量，并且光強(qiáng)為80微愛因斯坦·πΓ2 在7. 5小時之后，由于溶解氧水平下降，細(xì)菌的氧呼吸作用停止并且從反應(yīng)器中移出包含細(xì)菌的透析管。在無細(xì)菌的藻類培養(yǎng)物中，在200微愛因斯坦· πΓ2 · s—1光強(qiáng)度下，在硫剝奪期間，如果沒有添加碳酸氫鈉，則在40-42小時之后，在光照下藻類光合作用產(chǎn)氧速率等于或小于黑暗中的氧呼吸率。當(dāng)藻類在硫剝奪情況下與細(xì)菌共培養(yǎng)時，從孵化開始約18小時可以達(dá)到微氧/厭氧條件。一旦達(dá)到厭氧，培養(yǎng)物就開始產(chǎn)氫。(在沒有細(xì)菌的情況下，達(dá)到厭氧條件所花費(fèi)的時間為約40-50小時)。氫氣產(chǎn)量增加超過沒有細(xì)菌的對照培養(yǎng)物的水平，并且與I. 62mL/h/L不添加細(xì)菌的培養(yǎng)物相比較，確定為至少3. 48mL/h/L培養(yǎng)物。在這個實(shí)驗(yàn)中，共培養(yǎng)的藻類培養(yǎng)物產(chǎn)氫持續(xù)14小時。收集在量筒中(水下)的氣體為20mL，其中8mL確定為氫，而頂空中的氣體為260mL，其中44mL是氫。在第2個實(shí)例中，在更長的時間期間內(nèi)評價了缺氧以及光生產(chǎn)氫。使用野生型萊茵衣藻(菌株CC125)和突光假單胞菌。與第一個實(shí)驗(yàn)一樣,將藻類制備于I. IL Roux中,用200 μ mol光子/m2 · s的光強(qiáng)度進(jìn)行照射。將在30°C下生長至對數(shù)生長期O. 35的50mL細(xì)菌培養(yǎng)物粒化，并放入50mL透析袋中，硫剝奪開始之后進(jìn)行4小時并且黑暗時間為5小時。然后用硅橡膠隔膜密封培養(yǎng)物，并在80 μ E下照射。在第一個30小時期間測量光合作用氧生產(chǎn)量以及氧呼吸量。根據(jù)采樣培養(yǎng)基的測量，共培養(yǎng)培養(yǎng)物中的藻類(在3-6Χ107密度下)，在硫剝奪之后40小時達(dá)到缺氧，而對照花費(fèi)73小時。光生產(chǎn)氫期間光照為80 μ Ε。在硫剝奪之后45小時首次檢測到氫氣釋放，而對照是在78小時檢測到的。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時藻-菌共培養(yǎng)物的總體積為l，073mL。收集的氫的總體積為210mL。在共培養(yǎng)的培養(yǎng)物中氫氣釋放持續(xù)70小時，而對照為51小時。共培養(yǎng)的藻類平均氫氣釋放/h/L為2. 8，而對照為I. 6。收集在量筒中(在水下)的氣體為66mL，其中24mL確定為氫，而頂空氣體為225mL，其中187mL為氫。在對照中，收集在量筒中(在水下)的氣體為34mL，其中SmL確定為氫，而頂空氣體為239mL，其中112mL為氫。使用和不使用細(xì)菌共培養(yǎng)(對于第一個實(shí)驗(yàn))的藻類培養(yǎng)物的性能比較，清楚地表明添加細(xì)菌對于藻類產(chǎn)氫的優(yōu)點(diǎn)。在硫消耗之后56小時檢測到明顯的氫氣釋放(培養(yǎng)物中鼓泡)。在生產(chǎn)的第一個14小時內(nèi)藻-菌共培養(yǎng)系統(tǒng)(與孵育期的細(xì)菌共培養(yǎng)的藻類)的產(chǎn)氫速率為在3 X IO7個細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度下，11. 21mL/h/l. OL培養(yǎng)物(總計(jì)156mL氫/L)，而在生產(chǎn)的第一個14小時內(nèi)單獨(dú)藻類的對照培養(yǎng)物的產(chǎn)氫速率為在3-6X IO6個細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度下，4. 2mL/h/l. OL培養(yǎng)物(總計(jì)58. 8mL氫/L)(圖I)。因此，通過將需氧細(xì)菌培養(yǎng)物與光合藻類培養(yǎng)物混合，在生產(chǎn)的第一個14小時內(nèi)光生產(chǎn)氫提高了 2. 7倍。在第二個實(shí)驗(yàn)中,對于藻-菌共培養(yǎng)系統(tǒng)而言，光生產(chǎn)氫總量(結(jié)合頂空氫氣以及通過排水法收集的氫氣)(在硫剝奪之后140小時(從高強(qiáng)度光照開始135. 5小時)測量的)，為196mL，而單獨(dú)藻類的對照培養(yǎng)物生產(chǎn)總計(jì)11 ImL氫/L培養(yǎng)物(參見圖2)。藻-菌共培養(yǎng)系統(tǒng)和僅有藻類的對照的氣體釋放測量表明這兩種系統(tǒng)總氣體產(chǎn)量存在顯著差異。當(dāng)在密封之后在孵化期間以頻繁間隔監(jiān)測在量筒中通過排水法測量的氣體體積時，與僅有藻類的對照相比較，在藻-菌共培養(yǎng)系統(tǒng)中，觀察到顯著更快的氣體釋放動力學(xué)以及更大的氣體釋放能力。圖3顯示在僅有藻類的對照培養(yǎng)物中在顯著的氣體釋放之前潛伏期為>36小時，而在培養(yǎng)進(jìn)行6小時之前就已經(jīng)從藻-菌共培養(yǎng)物中收集到氣體 (圖3，陰影菱形)。雖然第一個18小時的快速動力學(xué)未向后延續(xù)，圖3清楚地顯示與在相同條件下僅有藻類的對照相比較，藻-菌共培養(yǎng)系統(tǒng)的優(yōu)異的氣體生產(chǎn)能力。例如，藻-菌共培養(yǎng)系統(tǒng)在不到24小時就實(shí)現(xiàn)收集35mL氣體，而相同氣體體積(35mL)代表了在僅有藻類的對照系統(tǒng)中通過排水法收集的最大氣體體積(參見圖3)。這些結(jié)果表明，使用光合綠藻(如萊茵衣藻)以及需氧細(xì)菌(如熒光假單胞菌(Pseudomonas f Iuorescens)),光生產(chǎn)氫的潛伏期得以顯著地縮短，并且在硫剝奪條件下使用藻-菌共培養(yǎng)系統(tǒng)，顯著地增強(qiáng)了氫氣生產(chǎn)的強(qiáng)度。雖然結(jié)合其具體實(shí)施方式
對本發(fā)明進(jìn)行了說明，應(yīng)當(dāng)清楚的是，許多替代方案，變更以及改變對于本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)是顯而易見的。因此，所希望的是涵蓋落在所附權(quán)利要求的精神和廣泛范圍內(nèi)的所有這些替代方案，變更以及改變。通過引用將本說明書中提到的所有出版物、專利以及專利申請整體結(jié)合在此，其程度就像每個單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾埫鞔_地并且個別地指出通過引用結(jié)合在此。此外，本申請中任何參考文件的引用或鑒別不應(yīng)解釋為承認(rèn)該參考文件可以作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。對于使用小節(jié)標(biāo)題的程度而言，它們不應(yīng)解釋為進(jìn)行必要的限制。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生氫氣的方法，所述方法連續(xù)地包括 Ca)在繁殖培養(yǎng)基中繁殖光合藻類，所述繁殖培養(yǎng)基包含硫； (b)在培養(yǎng)基中將所述藻類與細(xì)菌共培養(yǎng)持續(xù)足以確保減少氧的培養(yǎng)條件的時間長度，其中與所述繁殖培養(yǎng)基相比較，所述培養(yǎng)基包含降低數(shù)量的硫； (c)在所述培養(yǎng)基中消耗所述細(xì)菌中的至少一些，從而產(chǎn)生細(xì)菌減少的培養(yǎng)基； Cd)在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述藻類持續(xù)足以確保厭氧培養(yǎng)條件的時間長度； Ce)在厭氧培養(yǎng)條件下在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述藻類，由此產(chǎn)生氫氣；以及 (f)收集所述氫氣。
2.—種產(chǎn)生氫氣的方法，所述方法連續(xù)地包括 Ca)在繁殖培養(yǎng)基中繁殖光合藻類，所述繁殖培養(yǎng)基包含硫； (b)在包含比所述繁殖培養(yǎng)基降低數(shù)量的硫的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述藻類持續(xù)足以建立厭氧培養(yǎng)條件的時間長度，其中所述培養(yǎng)是與加入的細(xì)菌共培養(yǎng)持續(xù)所述時間長度的至少一部分； (c)在厭氧培養(yǎng)條件下在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述藻類，由此產(chǎn)生氫氣；以及 (d)收集所述氫氣， 其中與未與加入的細(xì)菌共培養(yǎng)的藻類的類似培養(yǎng)的時間長度相比較，步驟(b)的厭氧培養(yǎng)條件的所述時間長度減少。
3.一種用于產(chǎn)生氫氣的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括 (a)包括在與藻類繁殖培養(yǎng)基相比較包含降低量的硫的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)的光合藻類和細(xì)菌的密封培養(yǎng)容器； (b)所述培養(yǎng)容器的光照光源；和 (c)從所述培養(yǎng)容器中收集氫氣的裝置， 其中所述細(xì)菌包含于流體連接于藻類封閉殼的細(xì)菌封閉殼，所述藻類封閉殼由此通過流體-和氣體-可滲透而細(xì)菌不可滲透的屏障與之隔離。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其中所述細(xì)菌包含耗氧細(xì)菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，進(jìn)一步包括步驟(b)之后而步驟(c)之前、或期間在所述培養(yǎng)基中耗損至少一些細(xì)菌而產(chǎn)生細(xì)菌減少的培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中在實(shí)施所述耗損之中所述藻類培養(yǎng)物的氧耗量等于或大于所述藻類培養(yǎng)物的光合產(chǎn)氧量，如在高強(qiáng)度光照下測量的。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或5所述的方法，其中所述細(xì)菌減少的培養(yǎng)基基本上沒有所述細(xì)菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中所述繁殖培養(yǎng)基基本上沒有所述細(xì)菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其中所述培養(yǎng)基基本上沒有硫。
10.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中在厭氧條件下所述藻類的培養(yǎng)在光照射條件下實(shí)施。
11.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，進(jìn)一步包括在光照射條件下在厭氧條件下培養(yǎng)所述藻類之前實(shí)施任何這些步驟。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中在厭氧條件下培養(yǎng)所述藻類的步驟期間的光照強(qiáng)度要大于在厭氧條件下所述藻類的培養(yǎng)之前的任何所述步驟期間的光照強(qiáng)度。
13.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中所有步驟在光照射條件下實(shí)施。
14.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中所述細(xì)菌包含于流體連接于藻類封閉殼的細(xì)菌封閉殼內(nèi)，所述藻類封閉殼通過流體-和氣體-可滲透而細(xì)菌不可滲透的屏障與所述細(xì)菌封閉殼隔離。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其中所述細(xì)菌封閉殼位于所述藻類封閉殼之內(nèi)而由此通過所述流體-和氣體-可滲透而細(xì)菌不可滲透的屏障被隔離。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其中所述細(xì)菌封閉殼是透析袋。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其中所述細(xì)菌封閉殼遠(yuǎn)離所述藻類封閉殼而經(jīng)由流體連接裝置與其流體連接，由此通過流體-和氣體-可滲透而細(xì)菌不可滲透的屏障與之隔離。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其中所述細(xì)菌封閉殼進(jìn)一步包含碳源。
19.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其中所述共培養(yǎng)物中的所述藻類體積比所述細(xì)菌的體積大約5 50倍。
20.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其中所述步驟(b)中的所述藻類的體積比所述細(xì)菌的體積大約20倍。
21.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其中所述共培養(yǎng)物包含約IO3至約IO8個藻類細(xì)胞/mL。
22.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其中所述共培養(yǎng)物包含約IO4至約IO7個藻類細(xì)胞/mL。
23.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其中所述共培養(yǎng)物包含約IO5至IO6個藻類細(xì)胞/mL。
24.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中在(b)和(c)中的所述培養(yǎng)進(jìn)行約4至約60h。
25.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中在(b)和(c)中的所述培養(yǎng)進(jìn)行約10至約40h。
26.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中在(b)和(c)中的所述培養(yǎng)進(jìn)行約30h。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法或系統(tǒng),其中所述氫氣產(chǎn)量在(b)和(c)中培養(yǎng)所述藻類約30h之后是可檢測的。
28.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其中所述藻類包含綠藻。
29.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其中所述藻類包含單細(xì)胞的光合藻類。
30.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其中所述藻類包括含有Fe-氫酶的藻類。
31.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其中所述藻類選自由海洋綠藻(Platymonas subcordiformis),紫細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroide)和萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii )組成的組。
32.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其中所述細(xì)菌包含耗氧細(xì)菌。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述細(xì)菌包含專性好氧細(xì)菌。
34.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其中所述細(xì)菌是熒光假單胞菌。
全文摘要
本發(fā)明，在其一些實(shí)施方式中，涉及在藻類中產(chǎn)生氫氣的光催化方法，并且更具體地，而不是排他地，涉及用于增強(qiáng)動力學(xué)以及提高藻類氫光生產(chǎn)產(chǎn)量的藻類-細(xì)菌共培養(yǎng)物。
文檔編號C12P39/00GK102918159SQ201180022520
公開日2013年2月6日 申請日期2011年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月11日
發(fā)明者雅各布·埃德爾 申請人:雅各布·埃德爾