專利名稱：光敏離子透過性分子的制作方法
光敏離子透過性分子相關專利文獻本專利文件根據美國法典第35篇第119條(e)款要求2010年3月17日提交的標題為 “Light-Sensitive Ion-Passing Molecules” 的美國臨時專利申請第 61/314, 969號的權益，此專利文獻和基礎臨時申請中提交的附錄均以引用的方式全部并入本文。總覽和概述本公開的各個方面整體涉及用于刺激靶細胞的系統(tǒng)和方法，并且更具體地涉及使用光學裝置刺激靶細胞。對身體各種細胞的刺激已被用于產生多種有益效果。一種刺激方法涉及使用電極將外部產生的信號引入細胞?；陔姌O的腦刺激技術面臨的一個問題是負責既定精神過程的神經元的分布性質。相反地，不同類型的神經元彼此靠近駐留，使得在進行特定任務時只有在腦部給定區(qū)域中的某些細胞被激活。換句話說，不僅異種神經束通過 緊密的空間范圍平行移動，而且細胞體本身也可以混合、稀疏嵌入的構型存在。這種分配的處理方式似乎違背了要理解CNS內規(guī)范順序的最大努力，并且使神經調節(jié)難以實現(xiàn)治療目的。腦的這種構造為基于電極的刺激帶來一個問題，因為電極在其所刺激的神經元的基本生理學方面是相對沒有選擇性的。相反，電極桿與神經元的物理接近度往往是哪些神經元將被刺激的唯一的最具有決定性的因素。因此，使用電極對單一種類的神經元進行絕對限制性的刺激通常是不可行的。使用電極進行刺激的另一個問題是因為電極布置決定哪些神經元將被刺激，并且機械穩(wěn)定性經常不足，所以導致電極導線從目標區(qū)域遷移。此外，在體內一段時間以后，電極導線經常被膠質細胞包裹，使電極的有效電阻升高，進而使達到靶細胞所需的電功率輸送增力卩。然而，對電壓、頻率或脈沖寬度的補償性增加可使電流擴散并且增加對其它細胞的不希望的刺激。另一種刺激方法使用光敏生物分子結構來刺激響應于光的靶細胞。例如，可以使用光激活蛋白控制通過細胞膜的離子流動。通過促進或抑制通過細胞膜的正離子或負離子的流動，可以使細胞暫時去極化、去極化并保持該狀態(tài)或超極化。神經元是一類使用由去極化產生的電流來產生通信信號(即神經脈沖)的細胞的實例。其它電激發(fā)細胞包括骨骼肌、心肌和內分泌細胞。神經元使用迅速去極化以在全身傳輸信號并且用于達到各種目的，如運動控制(例如肌肉收縮)、感覺響應(例如觸覺、聽覺和其它感覺)和計算功能(例如腦功能)。因此，細胞去極化的控制可有益于多種不同的目的，包括(但不限于)心理療法、肌肉控制和感覺功能。本發(fā)明的各個方面針對能夠抑制神經活動的藍光感應視蛋白。所述視蛋白來自隱芽植物藍隱藻(G. theta)。所研究的視蛋白是從藍隱藻中分離的第三視蛋白，簡寫為GtR3。當用光照射時，GtR3能夠調節(jié)超極化電流。對GtR3的作用光譜的表征顯示最大吸收是約490nm,并且GtR3不被黃光激活。本發(fā)明的各個方面涉及能夠激發(fā)神經活動的藍光感應光敏感通道。所述光敏感通道來源于杜氏鹽藻(Dunaliella salina)。所研究的光敏感通道簡寫為DChR。DChR可以在哺乳動物神經元中異源表達并且當用藍光照射時可以調節(jié)強的去極化電流。DChR的作用最大值是約500nm。按照本公開的實施方案，通過工程化來源于藍隱藻的蛋白產生抑制電流流動，所述蛋白通過產生抑制電流來阻止神經元的去極化而對光響應。將所述蛋白遞送給目標神經兀并且暴露在光下。按照本公開的另一個實施方案，對表達GtR3質子泵的細胞進行光刺激的方法包括對所述細胞提供一系列刺激，各刺激使得在所述細胞中發(fā)生去極化事件的可能性增加。對所述細胞提供光以激活GtR3質子泵的表達，從而降低在所述細胞中發(fā)生去極化事件的可能性。在某些特定實施方案中，提供的光在藍光光譜中。按照本公開的另一個實施方案，公開了用于體內控制神經元或其它細胞的動作電位的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)包括向所述神經元或細胞引入響應于藍光的蛋白的遞送裝置。響應于藍光的蛋白對藍光響應而產生抑制電流。所述系統(tǒng)包括產生用于刺激藍光響應蛋白的光的藍光源和控制光源產生光的控制裝置。 按照本公開的另一個實施方案，公開了提供用于哺乳動物表達的光響應蛋白的方法。光響應蛋白從藍隱藻中分離。所述分離的蛋白具有C末端和N末端。向所述分離的蛋白的C末端添加內質網(ER)輸出信號以產生增強的光響應蛋白。將所述增強的蛋白放入空病毒載體中以向目標細胞遞送。隨后將攜帶所述增強的蛋白的病毒載體遞送給目標細胞。按照本公開的實施方案，提供一種動物細胞。所述動物細胞包括響應藍光表達質子泵的整合的外源分子。所述外源分子來源于藍隱藻。在某些實施方案中，所述動物細胞是神經細胞。所述動物細胞還可以是例如肌細胞或細胞系。本公開的以上論述并不旨在描述本發(fā)明的每種說明的實施方案或每種實施方式。下文的附圖和詳細描述更具體地舉例闡述這些實施方案。附圖簡述結合以下附圖來考察隨后本發(fā)明的各種實施方案的詳細描述，可以更透徹地理解本發(fā)明圖IA展示細胞器膜中的離子泵；圖IB展示細胞膜中的離子泵；圖2A展示表達光響應蛋白組合的細胞群體；圖2B展示用于某些實施方案的刺激模式，其中將兩種或兩種以上光響應蛋白引入相同的細胞群體；圖3展示根據本發(fā)明的示例實施方案的用于刺激靶細胞的系統(tǒng)的框圖；圖4展示根據本發(fā)明的示例實施方案的用于刺激靶細胞的植入裝置的框圖；圖5展示根據本發(fā)明的示例實施方案的植入裝置的框圖；圖6A展示根據本發(fā)明的示例實施方案的植入裝置的框圖；圖6B展示根據本發(fā)明的示例實施方案的對應于圖6A的框圖的電路圖；圖7A和圖7B展示根據本發(fā)明的示例實施方案的用于容納光敏生物分子的篩孔的圖形；圖8A和圖8B展示根據本發(fā)明的示例實施方案的病毒基質的圖形；圖9展示根據本發(fā)明的示例實施方案的響應于磁場產生光的電路的電路圖；

圖10A、10B和IOC展示根據本發(fā)明的示例實施方案的用于產生響應于RF信號的光的框圖和電路；圖IIA和圖IlB各自展示根據本發(fā)明的示例實施方案的光纖裝置的圖形；圖12A、12B、12C和12D描繪根據本發(fā)明的示例實施方案的在產生光敏生物部分中的各個階段；以及圖13展示根據本發(fā)明的示例實施方案的植入裝置；圖14A和圖14B展示根據本發(fā)明的示例實施方案的另一個植入裝置的圖形；圖15描繪根據本發(fā)明的示例實施方案的具有多個光源的裝置；圖16展示根據本發(fā)明的示例實施方案的用于體內控制一種或多種細胞電性質的系統(tǒng)； 圖17展示根據本發(fā)明的示例實施方案的用于體內控制一種或多種細胞電性質的系統(tǒng)；圖18A展示根據本發(fā)明的示例實施方案的用于光學藥物篩選的系統(tǒng)的框圖；圖18B展示根據本發(fā)明的示例實施方案的用于根據本發(fā)明方法篩選藥物的大型、準自動化系統(tǒng)的特定系統(tǒng)圖；圖19展示根據本發(fā)明的示例實施方案的根據本發(fā)明方法操作的小型、全自動化藥物篩選系統(tǒng)的系統(tǒng)圖；圖20A描繪根據本發(fā)明的示例實施方案的發(fā)射器/檢測器單元的實例的運行；圖20B描繪根據本發(fā)明的示例實施方案的發(fā)射器/檢測器單元的另一個實施方案的運行；圖21A和21B描繪根據本發(fā)明的示例實施方案的用于激活在發(fā)射器/檢測器單元內使用的LED發(fā)射器的電子電路機構；圖22展示根據本發(fā)明的示例實施方案的示例篩選過程的環(huán)境中的一系列事件的時間線；圖23示出根據本發(fā)明的示例實施方案的在孔板的孔內的細胞和藥物樣品的布局的實例；以及圖24示出根據本發(fā)明的示例實施方案的可以在促進高通量藥物篩選的較大系統(tǒng)內使用的所公開發(fā)明的環(huán)境。圖2 展示在用eNpHR3. O轉導的細胞和用eNpHR2. O轉導的細胞中顯示的代表性光電流跡線及其匯總圖線；圖25E展示在用eNpHR3. O轉導的細胞和用eNpHR2. O轉導的細胞中顯示的代表性超極化電壓跡線及其匯總圖線；圖26B展示被WGA-Cre融合激活的跨突觸基因的模型。所述該示意圖描繪出兩個注射位點(一個具有WGA-Cre融合基因，另一個具有Cre依賴性視蛋白病毒)和長范圍的投射；Cre可以從轉導的細胞中跨突觸釋放從而只在接收Cre依賴性病毒的突觸連接神經元中激活遠緣基因表達。圖26C展示用哺乳動物密碼子優(yōu)化的WGA-Cre和Cre依賴性AAV載體的構建體設計；圖27A展示630納米的光在用eNpHR3. O轉導的神經元中激起強光電流(代表性的電壓鉗跡線在左側)。比較表達eNpHR2. O和eNpHR3. O的神經元的匯總圖線(在右側)；eNpHR2. 0,42. 7±4· 5pA ；eNpHR3. 0,239. 4±28. 7pA ;未配對的 t 檢驗，p = 0. 00004 ；n =10)。圖27B展示630納米光照激起強的超極化(代表性電壓鉗跡線在左側)。比較表達eNpHR2. O 和 eNpHR3. O 的神經元的匯總圖線(右側)；eNpHR2. O 為 15. 6±3. 2mV, eNpHR3. O為 43. 3±6· ImV ;未配對的 t 檢驗，p = O. 00116 ；n = 10)。圖27C展示由不同波長的紅外線和遠紅外線邊緣照射激起的外向光電流的匯總630mn，239. 4±28. 7pA(左側，η = 10) ；660nm, 120. 5±16. 7pA(中間，η = 4);以及 680nm 76. 3±9. IpA (右偵|J, η = 4)。功率密度3. 5mff/mm2 (630nm)和 7mff/mm2 (660nm>680nm)。圖27D展示用紅外線和遠紅外線邊緣光照射抑制了由表達eNpHR3. O的神經元中的電流注入誘導的峰值。典型的電流鉗跡線顯示在630nm(左上)、660nm(右上)和680nm(下部)的光抑制。功率密度3. 5mW/mm2 (630nm)和 7mW/mm2 (660nm、680nm)。
圖27G展示藍光(445nm，5ms脈沖)在20Hz (左側)和IOHz (右側)激起脈沖，而同時施加黃光(590nm)抑制峰值。圖27F 展示 eNPAC、ChR2 (H134R)和 eNpHR3. O 單獨的激發(fā)光譜；圖28B展示560納米的光誘導eBR細胞中的外向光電流，以及在電壓鉗中的相應樣品跡線；圖28C展示560納米的光誘導eBR細胞中的超極化，以及在電流鉗中的相應樣品跡線；圖29A展示用于使微生物視蛋白基因與后生動物完整系統(tǒng)生物學相匹配的一般的亞細胞靶向策略；圖29B展示在組織和亞細胞水平的靶向的概括；圖30A展示當暴露于間隔2. 5秒、5秒、10秒和20秒的10秒時長的黃光脈沖對時，在表達eNpHR3. O的細胞中的有效光電流的穩(wěn)定和恢復；圖30B展示長期連續(xù)光暴露的eNpHR3. O標準化的光電流的時程；圖30C展示超過10分鐘以上的eNpHR3. O的外向電流的穩(wěn)定；以及圖31C展示在472nm光下的GtR3功能的樣品電流鉗和電壓鉗跡線及匯總圖線數(shù)據。雖然本發(fā)明可具有多種改良和替代形式，但其實施例已在附圖中通過舉例來展示并且將對其進行詳細描述。然而，應理解的是，不希望將本發(fā)明限制于所展示和/或描述的特定實施方案。相反，希望覆蓋落入本發(fā)明的精神和范圍之內的所有改良、等價和替代形式。詳細描述本發(fā)明被認為可用于促進多種光敏生物分子結構的實際應用，并且已經發(fā)現(xiàn)本發(fā)明特別適于在處理細胞膜電壓控制和刺激的裝置和方法中使用。雖然本發(fā)明不一定局限于這些應用，但通過使用上下文論述各種實施例可以領會本發(fā)明的各個方面。如本文所用，靶細胞的刺激通常用于描述細胞性質的改變。例如，刺激靶細胞可引起細胞膜性質的變化，該變化可以導致靶細胞的去極化或極化。在一種特定情況下，所述靶細胞是神經元，并且所述刺激通過促進或抑制神經元產生脈沖來影響脈沖的傳輸。按照本發(fā)明的一個示例實施方案，在細胞中將光響應蛋白工程化。所述蛋白響應于光而影響穿過細胞膜的離子(陰離子、陽離子或質子)流動。離子流中的這種變化在所述細胞的電性質(包括例如流經所述細胞膜的電壓和電流)中產生相應的變化。在一種情況下，所述蛋白使用內源性輔因子調節(jié)穿過所述細胞膜的離子流而在體內起作用。在另一種情況下，所述蛋白改變穿過所述細胞膜的電壓從而阻止或促進所述細胞中的動作電位的觸發(fā)。在又一種情況下，所述蛋白在引入光的幾毫秒內就能夠改變所述細胞的電性質。抑制蛋白通過使所述細胞的電位遠離細胞的動作電位出發(fā)水平來阻止動作電位的觸發(fā)。在許多神經元中，這意味著所述蛋白增加穿過所述細胞膜所觀察到的負電壓。在一種特定情況下，所述蛋白作為主動將質子轉移出細胞的質子泵。以這種方式，所述蛋白產生穿過所述細胞膜的抑制電流。更具體地講，所述蛋白通過降低穿過所述細胞的電壓對光響應，從而降低發(fā)生動作電位或去極化的概率。本發(fā)明的某些方面基于起質子泵作用的分子/蛋白的識別和開發(fā)。該質子泵來源于隱芽植物藍隱藻并且已經被開發(fā)用于在靶細胞中表達。在某些更特定的實施方案中， 所述細胞是神經元。工程化的蛋白(GtR3)通過產生抑制電流來阻止細胞的去極化而對藍光響應。當在神經細胞中表達時，所述質子泵(GtR3)可以響應藍光刺激而用于抑制神經活動。GtR3泵通過產生穿過所述神經膜的抑制電流對光刺激響應。當修飾的細胞暴露于(藍)光時，該電流就抑制動作電位。本公開還提供在細胞中表達的光激活蛋白的修飾，所述修飾通過添加一個或多個增強向哺乳動物細胞質膜轉運的氨基酸序列基序來實現(xiàn)。來源于進化上更簡單的有機體的光激活蛋白可能不被哺乳動物細胞表達或耐受，或在哺乳動物細胞中以高水平表達時可能顯示受損的亞細胞部位。因此，在一些實施方案中，將在細胞中表達的光激活蛋白與選自由信號肽、內質網(ER)輸出信號、膜運輸信號和N末端高爾基輸出信號組成的組的一個或多個氨基酸序列基序融合。可以將一個或多個增強向哺乳動物細胞質膜的光激活蛋白轉運的氨基酸序列基序與所述光激活蛋白的N末端、C末端或N末端和C末端兩者融合。所述光激活蛋白和一個或多個氨基酸序列基序可以任選由接頭間隔。可以增強向細胞質膜的光激活蛋白轉運的其它蛋白質基序在美國專利申請第12/041，628號中描述，所述申請全部并入本文。本公開還提供在天然光激活蛋白(例如但不限于天然GtR3、NpHR, DChR和BR)的氨基酸序列中含有氨基酸置換、缺失和插入的光激活蛋白。光激活蛋白包括那些其中一個或多個氨基酸殘基已進行氨基酸置換而仍保留對光響應的能力以及控制質膜極化狀態(tài)的能力的蛋白。例如，可以通過將一種或多種氨基酸置換到所述蛋白的天然或野生型氨基酸序列中來制備光激活蛋白。在一些實施方案中，本發(fā)明包括含有與天然氨基酸序列相比氨基酸序列改變的蛋白，其中所述改變的光激活蛋白仍保留特有的光激活性質和/或調節(jié)穿過前體蛋白質膜的離子流的能力，但是在一些特定方面可能具有改變的性質(例如，與天然蛋白質相比，對光敏感性的增加或降低、對特定波長的光的敏感性增加或降低和/或調節(jié)哺乳動物細胞質膜極化狀態(tài)的能力增加或降低)。天然蛋白序列中的氨基酸置換可以是保守性或非保守性置換，并且這些置換的氨基酸殘基可以是或不是由遺傳密碼統(tǒng)一編碼的。根據其側鏈的化學性質，將標準的二十種氨基酸“字母”分成化學家族。這些家族包括具有以下側鏈的氨基酸堿性側鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如甘氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支鏈側鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳基的側鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)?！氨Ｊ匦园被嶂脫Q”是其中的氨基酸殘基被化學上相似的側鏈置換的氨基酸置換(即，用具有堿性側鏈的另一種氨基酸置換具有堿性側鏈的氨基酸)?！胺潜Ｊ匦园被嶂脫Q”是其中的氨基酸殘基被化學上不同的側鏈置換的氨基酸置換(即，用具有芳族側鏈的氨基酸置換具有堿性側鏈的氨基酸)。本發(fā)明的某些方面涉及表達GtR3分子的動物細胞。以這種方式，所述動物細胞包括表達響應藍光的質子泵的整合外源分子。在某些非限制性實施方案中，所述動物細胞可以是神經細胞、肌細胞、桿狀或錐狀細胞或細胞系。在一些實施方案中，所述動物細胞是哺乳動物細胞。本文中提供一種動物細胞,所述動物細胞包含在所述細胞膜上表達的光激活蛋白，其中所述蛋白對藍光敏感并且來源于藍隱藻，其中當用光照射所述細胞時所述蛋白能夠調節(jié)所述細胞中的超極化電流。在一些實施方案中，所述光具有介于約450nm和495nm之間的波長。在一些實施方案中，所述光具有約490nm的波長。在一些實施方案中，所述光激 活蛋白包含與SEQ ID NO :I中所示序列至少95%相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述光激活蛋白包含與SEQ ID NO :1中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述光激活蛋白包含引入天然氨基酸序列以增加或降低對光的敏感性、增加或降低對特定波長的光的敏感性和/或增加或降低光激活蛋白調節(jié)細胞質膜極化狀態(tài)的能力的置換、缺失和/或插入。在一些實施方案中，所述光激活蛋白含有一個或多個保守性氨基酸置換。在一些實施方案中，所述光激活蛋白含有一個或多個非保守性氨基酸置換。包含引入所述天然氨基酸序列的置換、缺失和/或插入的光激活蛋白適當?shù)乇Ａ舫瑯O化響應于光的神經細胞質膜的能力。本文中還提供一種動物細胞,所述動物細胞包含在所述細胞膜上表達的光激活蛋白，其中所述蛋白包含與SEQ ID NO :1中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核心氨基酸序列和內質網(ER)輸出信號。所述ER輸出信號可以融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些實施方案中，所述ER輸出信號通過接頭與所述核心氨基酸序列連接。所述接頭可具有 5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400 或 500 個氨基酸中的任一長度。接頭可以進一步包含熒光蛋白，例如但不限于黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白或青色熒光蛋白。在一些實施方案中，所述ER輸出信號包含氨基酸序列FXYENE，其中X可以是任一氨基酸。在一些實施方案中，所述ER輸出信號包含氨基酸序列VXXSL，其中X可以是任一氨基酸。在一些實施方案中，所述ER輸出信號包含氨基酸序列FCYENEVο本文中還提供一種動物細胞,所述動物細胞包含在所述細胞膜上表達的光激活蛋白，其中所述蛋白包含與SEQ ID NO :1中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %相同的核心氨基酸序列和信號肽(例如，增強向質膜轉運的信號肽)。信號肽可以融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些實施方案中，所述信號肽通過接頭與所述核心氨基酸序列連接。所述接頭可具有 5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400 或 500 個氨基酸中的任一長度。接頭可以進一步包含熒光蛋白，例如但不限于黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白或青色熒光蛋白。在一些實施方案中，所述信號肽包含氨基酸序列MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNG。在一些實施方案中，可以使用其它信號肽(如來自其它視蛋白的信號肽)。本文中還提供一種動物細胞,所述動物細胞包含在所述細胞膜上表達的光激活蛋白，其中所述蛋白包含與SEQ ID NO :1中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核心氨基酸序列和運輸信號(例如，增強向質膜轉運的運輸信號)。信號肽可以融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些實施方案中，所述信號肽通過接頭與所述核心氨基酸序列連接。所述接頭可具有 5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400 或 500個氨基酸中的任一長度。接頭可以進一步包含熒光蛋白，例如但不限于黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白或青色熒光蛋白。在一些實施方案中，所述運輸信號來源于人內向整流鉀通道Kir2. I的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述運輸信號包含氨基酸序列K SRITSEGEYIPLDQIDINV。
本文中還提供一種動物細胞,所述動物細胞包含在所述細胞膜上表達的光激活蛋白，其中所述蛋白包含與SEQ ID NO :1中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、
96%、97 %、98 %、99 %或100 %相同的核心氨基酸序列和增強向哺乳動物細胞質膜轉運的兩個或兩個以上氨基酸序列基序，其選自由信號肽、ER輸出信號和膜運輸信號組成的組。在一些實施方案中，所述光激活蛋白包含N末端信號肽和C末端ER輸出信號。在一些實施方案中，所述光激活蛋白包含N末端信號肽和C末端運輸信號。在一些實施方案中，所述光激活蛋白包含N末端信號肽、C末端ER輸出信號和C末端運輸信號。在一些實施方案中，所述光激活蛋白包含C末端ER輸出信號和C末端運輸信號。在一些實施方案中,所述C末端ER輸出信號和所述C末端運輸信號通過接頭連接。所述接頭可具有5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500個氨基酸中的任一長度。接頭可以進一步包含熒光蛋白，例如但不限于黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白或青色熒光蛋白。在一些實施方案中，所述ER輸出信號比所述運輸信號更靠近C末端。在一些實施方案中，所述運輸信號比所述ER輸出信號更靠近C末端。本文中還提供編碼本文中描述的任何蛋白的分離的多核苷酸，所述蛋白如包含與SEQ ID NO :1 中所示序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100 %相同的核心氨基酸序列。本文中還提供包含編碼本文中描述的任何蛋白的表達載體(如本文中描述的病毒載體)，所述蛋白如包含與SEQ ID NO :1中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核心氨基酸序列。所述多核苷酸可以用于表達動物細胞中的光激活蛋白。本文中提供一種動物細胞,所述動物細胞包含在所述細胞膜上表達的光激活蛋白，其中所述蛋白對藍光響應并且來源于杜氏鹽藻，其中當用光照射所述細胞時所述蛋白能夠調節(jié)所述細胞中的去極化電流。在一些實施方案中，所述光具有介于約450nm和495nm之間的波長。在一些實施方案中，所述光具有約490nm的波長。在一些實施方案中，所述光激活蛋白包含與 SEQ ID NO 2 的殘基 25-365、24-365、23-365、22-365、21-365、20-365、
19-365、18-365、17-365、16-365、15-365、14-365、13-365、13-365、12-365、11-365、10-365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365或 1-365 中所示序列至少 95%相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述光激活蛋白包含與SEQ ID NO :2的殘基25-365、24-365、23-365、22-365、21-365、20-365、19-365、18-365、17-365、16-365、15-365、14-365、13-365、13-365、12-365、11-365、10-365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365 或 1-365 中所示序列至少 90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100 %相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述光激活蛋白包含引入天然氨基酸序列以增加或降低對光的敏感性、增加或降低對特定波長的光的敏感性和/或增加或降低光激活蛋白調節(jié)細胞質膜的極化狀態(tài)的能力的置換、缺失和/或插入。在一些實施方案中，所述光激活蛋白含有一個或多個保守性氨基酸置換。在一些實施方案中，所述光激活蛋白含有一個或多個非保守性氨基酸置換。包含引入所述天然氨基酸序列的置換、缺失和/或插入的光激活蛋白適當?shù)乇Ａ羧O化響應于光的神經細胞質膜的能力。本文中還提供一種動物細胞,所述動物細胞包含在所述細胞膜上表達的光激活蛋白，其中所述蛋白包含與 SEQ ID NO :2 的殘基 25-365、24-365、23-365、22-365、21-365、 20-365、19-365、18-365、17-365、16-365、15-365、14-365、13-365、13-365、12-365、11-365、
10-365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365或 1-365 中所示序列至少90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%相同的核心氨基酸序列和內質網(ER)輸出信號。所述ER輸出信號可融合到融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些實施方案中，所述ER輸出信號通過接頭與所述核心氨基酸序列連接。所述接頭可具有5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500個氨基酸中的任一長度。接頭可以進一步包含熒光蛋白，例如但不限于黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白或青色熒光蛋白。在一些實施方案中，所述ER輸出信號包含氨基酸序列FXYENE，其中X可以是任一氨基酸。在一些實施方案中，所述ER輸出信號包含氨基酸序列VXXSL，其中X可以是任一氨基酸。在一些實施方案中，所述ER輸出信號包含氨基酸序列FCYENEV。本文中還提供一種動物細胞,所述動物細胞包含在所述細胞膜上表達的光激活蛋白，其中所述蛋白包含與 SEQ ID NO :2 的殘基 25-365、24-365、23-365、22-365、21-365、20-365、19-365、18-365、17-365、16-365、15-365、14-365、13-365、13-365、12-365、11-365、10-365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365 或 1-365 中所示序列至少90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%相同的核心氨基酸序列和信號肽(例如，增強向質膜轉運的信號肽)。信號肽可以融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些實施方案中，所述信號肽通過接頭與所述核心氨基酸序列連接。所述接頭可具有5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500個氨基酸中的任一長度。接頭可以進一步包含熒光蛋白，例如但不限于黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白或青色熒光蛋白。在一些實施方案中，所述信號肽包含氨基酸序列 MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNG。在一些實施方案中，可以使用其它信號肽(如來自其它視蛋白的信號肽)。本文中還提供一種動物細胞,所述動物細胞包含在所述細胞膜上表達的光激活蛋白，其中所述蛋白包含與 SEQ ID NO :2 的殘基 25-365、24-365、23-365、22-365、21-365、20-365、19-365、18-365、17-365、16-365、15-365、14-365、13-365、13-365、12-365、11-365、10-365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365 或 1-365 中所示序列至少90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%相同的核心氨基酸序列和運輸信號(例如，增強向質膜轉運的運輸信號)。信號肽可以融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些實施方案中，所述信號肽通過接頭與所述核心氨基酸序列連接。所述接頭可具有5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500個氨基酸中的任一長度。接頭可以進一步包含熒光蛋白，例如但不限于黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白或青色熒光蛋白。在一些實施方案中，所述運輸信號來源于人內向整流鉀通道Kir2. I的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述運輸信號包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV。本文中還提供一種動物細胞,所述動物細胞包含在所述細胞膜上表達的光激活蛋白，其中所述蛋白包含與 SEQ ID NO :2 的殘基 25-365、24-365、23-365、22-365、21-365、20-365、19-365、18-365、17-365、16-365、15-365、14-365、13-365、13-365、12-365、11-365、10-365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365 或 1-365 中所示序列至少90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%相同的核心氨基酸序列 和增強向哺乳動物細胞質膜轉運的兩個或兩個以上氨基酸序列基序，其選自由信號肽、ER輸出信號和膜運輸信號組成的組。在一些實施方案中，所述光激活蛋白包含N末端信號肽和C末端ER輸出信號。在一些實施方案中,所述光激活蛋白包含N末端信號肽和C末端運輸信號。在一些實施方案中，所述光激活蛋白包含N末端信號肽、C末端ER輸出信號和C末端運輸信號。在一些實施方案中，所述光激活蛋白包含C末端ER輸出信號和C末端運輸信號。在一些實施方案中，所述C末端ER輸出信號和所述C末端運輸信號通過接頭連接。所述接頭可具有 5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400 或 500個氨基酸中的任一長度。接頭可以進一步包含熒光蛋白，例如但不限于黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白或青色熒光蛋白。在一些實施方案中，所述ER輸出信號比所述運輸信號更靠近C末端。在一些實施方案中，所述運輸信號比所述ER輸出信號更靠近C末端。本文中還提供編碼本文中描述的任何蛋白的分離的多核苷酸，所述蛋白如包含與 SEQ ID NO 2 的殘基 25-365、24-365、23-365、22-365、21-365、20-365、19-365、18-365、17-365、16-365、15-365、14-365、13-365、13-365、12-365、11-365、10-365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365 或 1-365 中所示序列至少 90% ,91 % ,92% ,93%,94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核心氨基酸序列。本文中還提供包含編碼本文中描述的任何蛋白的表達載體(如本文中描述的病毒載體)，所述蛋白如包含與 SEQ ID NO :2 的殘基25-365、24-365、23-365、22-365、21-365、
20-365、19-365、18-365、17-365、16-365、15-365、14-365、13-365、13-365、12-365、11-365、
10-365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365 或 1-365 中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%相同的核心氨基酸序列。所述多核苷酸可以用于表達動物細胞中的光激活蛋白。本文中提供一種動物細胞,所述動物細胞包含在所述細胞膜上表達的光激活蛋白，其中所述蛋白對黃光以及紅光響應并且來源于法老嗜鹽堿單胞菌(Natronomonaspharaon is),其中當用光照射所述細胞時所述蛋白能夠調節(jié)所述細胞中的超極化電流。在一些實施方案中，所述光具有介于約580nm和630nm之間的波長。在一些實施方案中，所述光具有約589nm的波長。在一些實施方案中，所述光具有大于約630nm(例如小于740nm)的波長。在一些實施方案中，所述光具有約630nm的波長。在一些實施方案中，所述光激活蛋白包含與SEQ ID NO 3中所示序列至少95%相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述光激活蛋白包含與SEQ ID NO :3中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、
97%、98 %、99 %或100 %相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述光激活蛋白包含引入天然氨基酸序列以增加或降低對光的敏感性、增加或降低對特定波長的光的敏感性和/或增加或降低光激活蛋白調節(jié)細胞質膜的極化狀態(tài)的能力的置換、缺失和/或插入。在一些實施方案中，所述光激活蛋白含有一個或多個保守性氨基酸置換。在一些實施方案中，所述光激活蛋白含有一個或多個非保守性氨基酸置換。包含引入所述天然氨基酸序列的置換、缺失和/或插入的光激活蛋白適當?shù)乇Ａ舫瑯O化響應于光的神經細胞質膜的能力。本文中還提供一種動物細胞,所述動物細胞包含在所述細胞膜上表達的光激活蛋白，其中所述蛋白包含與SEQ ID NO :3中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核心氨基酸序列和內質網(ER)輸出信號。所述ER 輸出信號可以融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些實施方案中，所述ER輸出信號通過接頭與所述核心氨基酸序列連接。所述接頭可具有 5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400 或 500 個氨基酸中的任一長度。接頭可以進一步包含熒光蛋白，例如但不限于黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白或青色熒光蛋白。在一些實施方案中，所述ER輸出信號包含氨基酸序列FXYENE，其中X可以是任一氨基酸。在一些實施方案中，所述ER輸出信號包含氨基酸序列VXXSL，其中X可以是任一氨基酸。在一些實施方案中，所述ER輸出信號包含氨基酸序列FCYENEVο本文中還提供一種動物細胞,所述動物細胞包含在所述細胞膜上表達的光激活蛋白，其中所述蛋白包含與SEQ ID NO :3中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核心氨基酸序列和運輸信號(例如，增強向質膜轉運的運輸信號)。信號肽可以融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些實施方案中，所述信號肽通過接頭與所述核心氨基酸序列連接。所述接頭可具有 5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400 或 500個氨基酸中的任一長度。接頭可以進一步包含熒光蛋白，例如但不限于黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白或青色熒光蛋白。在一些實施方案中，所述運輸信號來源于人內向整流鉀通道Kir2. I的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述運輸信號包含氨基酸序列K SRITSEGEYIPLDQIDINV。本文中還提供一種動物細胞,所述動物細胞包含在所述細胞膜上表達的光激活蛋白，其中所述蛋白包含與SEQ ID NO :3中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %相同的核心氨基酸序列和增強向哺乳動物細胞質膜轉運的兩個或兩個以上氨基酸序列基序，其選自由信號肽、ER輸出信號和膜運輸信號組成的組。在一些實施方案中，所述光激活蛋白包含C末端ER輸出信號和C末端運輸信號。在一些實施方案中，所述C末端ER輸出信號和所述C末端運輸信號通過接頭連接。所述接頭可具有5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400 或 500 個氨基酸中的任一長度。接頭可以進一步包含熒光蛋白，例如但不限于黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白或青色熒光蛋白。在一些實施方案中，所述ER輸出信號比所述運輸信號更靠近C末端。在一些實施方案中，所述運輸信號比所述ER輸出信號更靠近C末端。本文中還提供一種動物細胞,所述動物細胞包含在所述細胞膜上表達的光激活蛋白，其中所述蛋白包含與SEQ ID NO :3中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核心氨基酸序列，其中SEQ ID NO :3的N末端信號肽缺失或被置換。在一些實施方案中，所述光激活蛋白包含與SEQ ID NO: 3的殘基40-291、39-291、38-291、37-291、36-291、35-291、34-291、33-291、32-291、31-291、30-291、29-291、28-291、27-291、26-291、25-291、24-291、23-291、22-291、21-291、20-291、19-291、18-291、17-291、16-291、15-291、14-291、13-291、13-291、12-291、10-291、10-291、9-291、8-291、7-291、6-291、5-291、4-291、3-291、2-291或1-291中所示序列至少95%相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，可以使用其它信號肽(如來自其它視蛋白的信號肽)。所述光激活蛋白可以進一步包含本文中描述的ER轉運信號和膜運輸信號。
本文中還提供編碼本文中描述的任何蛋白的多核苷酸，所述蛋白如包含與SEQ IDNO 3 中所示序列至少 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%相同的核心氨基酸序列、ER輸出信號和膜運輸信號。所述多核苷酸可以在表達載體(如本文中描述的病毒載體)中。所述多核苷酸可以用于表達動物細胞中的光激活蛋白。本文中提供一種動物細胞,所述動物細胞包含在所述細胞膜上表達的光激活蛋白，其中所述蛋白對綠光敏感并且來源于極端嗜鹽古菌(Halobacterium salinarum),其中當用光照射所述細胞時所述蛋白能夠調節(jié)所述細胞中的超極化電流。在一些實施方案中，所述光具有介于約520nm和570nm之間的波長。在一些實施方案中，所述光具有約560nm的波長。在一些實施方案中，所述光激活蛋白包含與SEQ ID NO :4中所示序列至少95%相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述光激活蛋白包含與SEQ ID NO :4中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述光激活蛋白包含引入天然氨基酸序列以增加或降低對光的敏感性、增加或降低對特定波長的光的敏感性和/或增加或降低光激活蛋白調節(jié)細胞質膜的極化狀態(tài)的能力的置換、缺失和/或插入。在一些實施方案中，所述光激活蛋白含有一個或多個保守性氨基酸置換。在一些實施方案中，所述光激活蛋白含有一個或多個非保守性氨基酸置換。包含引入所述天然氨基酸序列的置換、缺失和/或插入的光激活蛋白適當?shù)乇Ａ舫瑯O化響應于光的神經細胞質膜的能力。本文中還提供一種動物細胞,所述動物細胞包含在所述細胞膜上表達的光激活蛋白，其中所述蛋白包含與SEQ ID勵4中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核心氨基酸序列和內質網(ER)輸出信號。所述ER輸出信號可以到融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些實施方案中，所述ER輸出信號通過接頭與所述核心氨基酸序列連接。所述接頭可具有 5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400 或 500 個氨基酸中的任一長度。接頭可以進一步包含熒光蛋白，例如但不限于黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白或青色熒光蛋白。在一些實施方案中，所述ER輸出信號包含氨基酸序列FXYENE，其中X可以是任一氨基酸。在一些實施方案中，所述ER輸出信號包含氨基酸序列VXXSL，其中X可以是任一氨基酸。在一些實施方案中，所述ER輸出信號包含氨基酸序列FCYENEVο本文中還提供一種動物細胞,所述動物細胞包含在所述細胞膜上表達的光激活蛋白，其中所述蛋白包含與SEQ ID勵4中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核心氨基酸序列和運輸信號(例如，增強向質膜轉運的運輸信號)。信號肽可以融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些實施方案中，所述信號肽通過接頭與所述核心氨基酸序列連接。所述接頭可具有 5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400 或 500個氨基酸中的任一長度。接頭可以進一步包含熒光蛋白，例如但不限于黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白或青色熒光蛋白。在一些實施方案中，所述運輸信號來源于人內向整流鉀通道Kir2. I的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述運輸信號包含氨基酸序列K SRITSEGEYIPLDQIDINY。本文中還提供一種動物細胞,所述動物細胞包含在所述細胞膜上表達的光激活蛋 白，其中所述蛋白包含與SEQ ID勵4中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %相同的核心氨基酸序列和增強向哺乳動物細胞質膜轉運的兩個或兩個以上氨基酸序列基序，其選自由ER輸出信號和膜運輸信號組成的組。在一些實施方案中，所述光激活蛋白包含C末端ER輸出信號和C末端運輸信號。在一些實施方案中，所述C末端ER輸出信號和所述C末端運輸信號通過接頭連接。所述接頭可具有5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400 或 500 個氨基酸中的任一長度。接頭可以進一步包含熒光蛋白，例如但不限于黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白或青色熒光蛋白。在一些實施方案中，所述ER輸出信號比所述運輸信號更靠近C末端。在一些實施方案中，所述運輸信號比所述ER輸出信號更靠近C末端。本文中還提供一種動物細胞,所述動物細胞包含在所述細胞膜上表達的光激活蛋白，其中所述蛋白包含與SEQ ID勵4中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核心氨基酸序列，其中SEQ ID NO :4的N末端信號肽缺失或被置換。在一些實施方案中，所述光激活蛋白包含與SEQ ID NO :4的殘基40-262、39-262、38-262、37-262、36-262、35-262、34-262、33-262、32-262、31-262、30-262、29-262、28-262、27-262、26-262、25-262、24-262、23-262、22-262、21-262、20-262、19-262、18-262、17-262、16-262、15-262、14-262、13-262、13-262、12-262、10-262、10_262、9-262、8_262、7-262、6-262、5-262、4-262、3-262、2-262或1-262中所示序列至少95%相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，可以使用其它信號肽(如來自其它視蛋白的信號肽)。所述光激活蛋白可以進一步包含本文中描述的ER轉運信號和/或膜運輸信號。本文中還提供編碼本文中描述的任何蛋白的多核苷酸，所述蛋白如包含與SEQ IDNO 4 中所示序列至少 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%相同的核心氨基酸序列、ER輸出信號和膜運輸信號。所述多核苷酸可以在表達載體(如本文中描述的病毒載體)中。所述多核苷酸可以用于在動物細胞中表達光激活蛋白。在某些更特定的實施方案中，提供一種提供用于哺乳動物表達的光響應蛋白的方法。光響應蛋白是從藍隱藻(GtR3)中分離的。GtR3具有C末端和N末端。GtR3的C末端加入了啟動子。在某些實施方案中，所述啟動子是內質網(ER)輸出信號。關于優(yōu)化在哺乳動物細胞中表達的GtR3的更多說明，參見在所述基礎臨時申請且標題為“Molecular andCellular Approaches for Diversifying and Extending Optogenetics，，中提交的附錄A0激發(fā)蛋白通過使細胞的電位向所述細胞的動作電位觸發(fā)水平移動來促進動作電位的觸發(fā)。在許多神經元中，這意味著所述蛋白降低穿過所述細胞膜所觀察到的負電壓。在一種特定的情況下，所述蛋白作用于將陽離子轉移到細胞中的另外的離子通道。以這種方式，所述蛋白產生穿過所述細胞膜的激發(fā)電流。更具體地講，所述蛋白通過升高穿過所述細胞的電壓對光響應，從而增加發(fā)生動作電位或去極化的可能性。在某些情況下，可以將穿過細胞膜的電壓增加到動作電位出發(fā)水平或更高，從而引起所述細胞的去極化。本發(fā)明的某些方面基于來源于杜氏鹽藻的通道(DChR)的識別和開發(fā)。當用藍光照射時，光敏感通道DChR調節(jié)強的去極化電流。所述去極化電流可能使細胞響應于藍光照射而激發(fā)。在某些實施方案中，DChR在目標細胞中被表達為外源蛋白。對于神經細胞，當遞送給目標細胞時，DChR可以起利用內源性輔因子的激發(fā)蛋白的作用。
向光遺傳學領域引入GtR3和DChR為多種應用提供了可能。例如，GtR3和DChR可以與其它光遺傳學離子透過性分子如ChR2 (從萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中開發(fā))組合使用。GtR3和DChR相對于其它光響應分子具有不同的操作參數(shù)。這促進了對不同波長的光具有精確調整的響應的細胞或細胞群體的發(fā)展?？梢哉{整的參數(shù)包括但不限于電流密度、超極化水平、膜電導、刺激頻率、靜息電位、光波長和/或光強度。在另一個示例實施方案中，用于控制神經元的動作電位的方法包括以下步驟在所述神經元中工程化第一光響應蛋白；在所述神經元中且從第一光響應蛋白響應于光產生抑制電流；在所述神經元中工程化第二光響應蛋白；以及在所述神經元中從第二光響應蛋白響應于光產生激發(fā)電流。第一光響應蛋白和第二光響應蛋白可以對不同波長的光響應。在某些情況下，使用DChR或GtR3可以促進該激發(fā)或抑制電流的特定的電流密度和/或產生該電流的光波長。在另一個示例實施方案中，用于控制神經元的動作電位的方法包括以下步驟在所述神經元中工程化第一光響應蛋白；在所述神經元中且從第一光響應蛋白響應于光產生抑制電流；在所述神經元中工程化第二光響應蛋白；以及從第二光響應蛋白響應于光產生第二抑制電流，所述兩個電流的組合比單個光響應蛋白更強地抑制所述神經元。例如，第一光響應蛋白可以是NpHR且第二光響應蛋白可以是GtR3。用于控制穿過細胞的細胞膜的電壓水平的另一種方法包括測量所述細胞膜的電壓水平。工程化光響應蛋白且將所述光響應蛋白引入所述細胞中，并且在其中表達。提供特定波長的光，所述光通過所述光響應蛋白在所述細胞中產生反應。所述光響應蛋白的響應產生穿過所述細胞膜的電流。所述電流對測量的電壓水平響應。本發(fā)明的另一個方面涉及用于在體內控制神經元的動作電位的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)包括遞送裝置、光源和控制裝置。所述遞送裝置將光響應蛋白引入所述神經元中，所述光響應蛋白產生抑制電流。光源產生刺激光響應蛋白的光，控制裝置控制光源產生的光。在其他實施方案中，被引入神經元的光響應蛋白產生激發(fā)電流。在更詳細地實施方案中，將所述系統(tǒng)進一步修改以使得遞送裝置通過轉染、轉導和顯微注射之一引入光響應蛋白，和/或從而使光源通過植入光發(fā)生器和光纖之一將光引入神經元。關于基因遞送和表達方法的其它細節(jié)，參見PCT公布第W02010/019619A1號(PCT/US2009/053474),標題為“Method and Composition for Controlling GeneExpression”,將其以引用的方式全部并入本文。本公開的另一個方面涉及用于治療病癥的方法。所述方法靶向與所述病癥相關的一組神經元；并且在該組中，所述方法包括工程化抑制蛋白以響應于光，通過產生抑制電流阻止神經元的去極化，并且將所述神經元暴露于光下，從而阻止所述神經元的去極化。本公開的又一個方面針對用于治療病癥的又一種方法。所述方法靶向與所述病癥相關的一組神經元；并且在該組中，所述方法包括工程化激發(fā)蛋白以響應于光，通過產生激發(fā)電流促進神經元的去極化，并且將所述神經元暴露于光下，從而促進所述神經元的去極化。在本發(fā)明的其它方面中，將抑制蛋白和激發(fā)蛋白(響應于不同波長的光)兩者引入目標神經元組。所述神經元被交替地暴露于不同波長的光進行激發(fā)，并且抑制所述神經元的去極化。更詳細的實施方案詳細地說明這些技術。例如，本發(fā)明的另一個方面在物種(例 如小鼠和秀麗隱桿線蟲(C. elegans))中共表達具有其它已知視蛋白的GtR3和DChR，如NpHR和VChRl。此外，產生反極化電流并且具有不同顏色敏感性的視蛋白在靈敏的哺乳動物大腦切片中與鈣成像整合以用于雙向光調制和神經活動的讀取。同樣地，可以將耦合的視蛋白靶向秀麗隱桿線蟲肌肉和膽堿能運動神經元以雙向控制移動。可以將共同耦合的視蛋白用作帶電神經回路的多模式、高速、基因靶向、全光探查(all-opticalinterrogation)的完全和互補的光遺傳學系統(tǒng)。此外，可以用不同的視蛋白I禹合祀向一組以上細胞，允許精確控制多組相互獨立的細胞。除了 GtR3和DChR之外，還有可以工程化以光學調節(jié)離子流或在細胞內的第二信使的若干光敏感通道、氯視紫紅質蛋白和微生物視蛋白。本發(fā)明的各種實施方案包括優(yōu)化、突變、截短的密碼子、融合蛋白、靶向型或此外這些離子光學調節(jié)劑的改進型。例如，GtR3和DChR(例如在所述基礎臨時申請中提交的附錄B和C)。提到的視蛋白作為若干不同實施方案的代表使用。除非規(guī)定，否則不希望特定地識別GtR3和DChR的論述將本發(fā)明限制于光學調節(jié)劑的這些特定的實例。關于上述序列的更多細節(jié)，可以參考Feng Zhang等Nature (2007 年 4 月 5 日)446 卷633-639 的“Multimodal fast optical interrogationof neural circuitry”,將其以引用的方式全部并入本文。表I展示用于橫跨可見光譜抑制細胞活動的識別的視蛋白
權利要求
1.一種動物細胞，所述動物細胞包含在細胞膜上表達的光激活蛋白，其中所述蛋白對藍光響應并且來源于藍隱藻，其中當用光照射所述細胞時所述蛋白能夠調節(jié)所述細胞中的超極化電流。
2.根據權利要求I所述的動物細胞，其中所述蛋白包含與SEQID NO :1中所示序列至少95 %相同的核心氨基酸序列。
3.根據權利要求2所述的動物細胞，其中所述蛋白包含所述核心氨基酸序列和在所述核心氨基酸序列的C末端的內質網(ER)輸出信號。
4.根據權利要求3所述的動物細胞，其中所述核心氨基酸序列通過接頭與所述ER輸出信號連接。
5.根據權利要求3所述的動物細胞，其中所述ER輸出信號包含氨基酸序列FCEYENEV。
6.根據權利要求3所述的動物細胞，其中所述蛋白包含SEQID NO :5中所示氨基酸序列。
7.根據權利要求I所述的動物細胞，其中所述動物細胞是神經細胞、肌細胞或干細胞。
8.根據權利要求I所述的動物細胞，其進一步包含在所述細胞膜上表達的第二光激活蛋白。
9.根據權利要求8所述的動物細胞，其中所述第二光激活蛋白是當用光照射所述細胞時能夠調節(jié)所述細胞中的去極化電流的蛋白。
10.根據權利要求9所述的動物細胞，其中所述第二光激活蛋白選自由VChRl、DChR,SFO和ChR2組成的組。
11.一種細胞群體,所述細胞群體包含根據權利要求1-10中任一項所述的細胞。
12.—種分離的多核苷酸,所述多核苷酸包含編碼含有與SEQ ID NO :1中所不序列至少95 %相同的核心氨基酸序列的光激活蛋白的核苷酸序列。
13.一種表達載體，所述表達載體包含編碼含有與SEQ ID NO :1中所示序列至少95%相同的核心氨基酸序列的光激活蛋白的核苷酸序列。
14.根據權利要求13所述的表達載體，其中所述表達載體是病毒載體。
15.根據權利要求14所述的表達載體，其中所述病毒載體是AAV載體、逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、HSV載體或慢病毒載體。
16.一種使用根據權利要求1-7中任一項所述的細胞的方法，所述方法包括用光激活所述光激活蛋白。
17.一種使用根據權利要求8-10中任一項所述的細胞的方法，所述方法包括將所述光激活蛋白在其各自的波長激活。
18.一種非人動物，所述非人動物包含根據權利要求1-10中任一項所述的細胞。
19.一種動物細胞,所述動物細胞包含在所述細胞膜上表達的光激活蛋白，其中所述蛋白對藍光響應并且來源于杜氏鹽藻，其中當用光照射所述細胞時所述蛋白能夠調節(jié)所述細胞中的去極化電流。
20.根據權利要求19所述的動物細胞，其中所述蛋白包含與SEQID NO :2的殘基25-365中所不序列至少95%相同的核心氨基酸序列。
21.根據權利要求20所述的動物細胞，其中所述蛋白包含所述核心氨基酸序列和在所述核心氨基酸序列的C末端的內質網(ER)輸出信號。
22.根據權利要求21所述的動物細胞，其中所述核心氨基酸序列通過接頭與所述ER輸出信號連接。
23.根據權利要求22所述的動物細胞，其中所述ER輸出信號包含氨基酸序列FCEYENEVο
24.根據權利要求19所述的動物細胞,其中所述動物細胞是神經細胞、肌細胞或干細胞。
25.根據權利要求19所述的動物細胞，其進一步包含在所述細胞膜上表達的第二光激活蛋白。
26.根據權利要求25所述的動物細胞，其中所述第二光激活蛋白是當用光照射所述細胞時能夠調節(jié)所述細胞中的超極化電流的蛋白。
27.根據權利要求25所述的動物細胞，其中所述第二光激活蛋白選自由NpHR、BR、AR和GtR3組成的組。
28.—種細胞群體，所述細胞群體包含根據權利要求19-27中任一項所述的細胞。
29.—種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼含有與SEQ ID NO :2的殘基25-365中所示序列至少95%相同的核心氨基酸序列的光激活蛋白的核苷酸序列。
30.一種表達載體，所述表達載體包含編碼含有與SEQ ID NO :2的殘基25-365中所示序列至少95%相同的核心氨基酸序列的光激活蛋白的核苷酸序列。
31.根據權利要求29所述的表達載體，其中所述表達載體是病毒載體。
32.根據權利要求30所述的表達載體，其中所述病毒載體是AAV載體、逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、HSV載體或慢病毒載體。
33.一種使用根據權利要求19-24中任一項所述的細胞的方法，所述方法包括用光激活所述光激活蛋白。
34.一種使用根據權利要求24-27中任一項所述的細胞的方法，所述方法包括將所述光激活蛋白在其各自的波長激活。
35.一種非人動物，所述非人動物包含根據權利要求19-27中任一項所述的細胞。
36.一種動物細胞，所述動物細胞包含在所述細胞膜上表達的光激活蛋白，其中所述蛋白包含與SEQ ID NO :3中所示序列至少95%相同的核心氨基酸序列、ER輸出信號和膜運輸信號。
37.根據權利要求36所述的動物細胞，其中所述光激活蛋白從所述N末端至所述C末端包含所述核心氨基酸序列、所述ER輸出信號和所述膜運輸信號。
38.根據權利要求36所述的動物細胞，其中所述光激活蛋白從所述N末端至所述C末端包含所述核心氨基酸序列、所述膜運輸信號和所述ER輸出信號。
39.根據權利要求36所述的動物細胞，其中所述ER輸出信號包含氨基酸序列FCEYENEVο
40.根據權利要求36所述的動物細胞，其中所述膜運輸信號包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV。
41.根據權利要求36所述的動物細胞,其中所述動物細胞是神經細胞、肌細胞或干細胞。
42.根據權利要求36所述的動物細胞，其進一步包含在所述細胞膜上表達的第二光激活蛋白。
43.根據權利要求42所述的動物細胞，其中所述第二光激活蛋白是當用光照射所述細胞時能夠調節(jié)所述細胞中的去極化電流的蛋白。
44.根據權利要求42所述的動物細胞，其中所述第二光激活蛋白選自由VChRl、DChR,SFO和ChR2組成的組。
45.一種細胞群體，所述細胞群體包含根據權利要求36-44中任一項所述的細胞。
46.—種用于制備根據權利要求36-44中任一項所述的細胞或根據權利要求45所述的細胞群體的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼含有與SEQ ID NO :3中所示序列至少95%相同的核心氨基酸序列的光激活蛋白的核苷酸序列、ER輸出信號和膜運輸信號。
47.根據權利要求46所述的多核苷酸,其中所述多核苷酸在表達載體中。
48.根據權利要求47所述的多核苷酸，其中所述表達載體是病毒載體。
49.根據權利要求48所述的多核苷酸，其中所述病毒載體是AAV載體、逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、HSV載體或慢病毒載體。
50.一種使用根據權利要求36-41中任一項所述的細胞的方法,所述方法包括用具有介于約580nm和約630nm之間的波長的光激活所述光激活蛋白。
51.一種使用根據權利要求42-44中任一項所述的細胞的方法，所述方法包括將所述光激活蛋白在其各自的波長激活。
52.—種非人動物，所述非人動物包含根據權利要求36-44中任一項所述的細胞。
53.一種動物細胞，所述動物細胞包含在所述細胞膜上表達的光激活蛋白，其中所述蛋白包含與SEQ ID NO :4中所示序列至少95%相同的核心氨基酸序列、ER輸出信號和膜運輸信號。
54.根據權利要求53所述的動物細胞，其中所述光激活蛋白從所述N末端至所述C末端包含所述核心氨基酸序列、所述ER輸出信號和所述膜運輸信號。
55.根據權利要求53所述的動物細胞，其中所述光激活蛋白從所述N末端至所述C末端包含所述核心氨基酸序列、所述膜運輸信號和所述ER輸出信號。
56.根據權利要求53所述的動物細胞，其中所述ER輸出信號包含氨基酸序列FCEYENEVο
57.根據權利要求53所述的動物細胞，其中所述膜運輸信號包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV。
58.根據權利要求53所述的動物細胞,其中所述動物細胞是神經細胞、肌細胞或干細胞。
59.根據權利要求53所述的動物細胞，其進一步包含在所述細胞膜上表達的第二光激活蛋白。
60.根據權利要求59所述的動物細胞，其中所述第二光激活蛋白是當用光照射所述細胞時能夠調節(jié)所述細胞中的去極化電流的蛋白。
61.根據權利要求59所述的動物細胞，其中所述第二光激活蛋白選自由VChRl、DChR,SFO和ChR2組成的組。
62.—種細胞群體，所述細胞群體包含根據權利要求53-61中任一項所述的細胞。
63.一種用于制備根據權利要求53-61中任一項所述的細胞或根據權利要求62所述的細胞群體的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼含有與SEQ ID NO :4中所示序列至少95%相同的核心氨基酸序列的光激活蛋白的核苷酸序列、ER輸出信號和膜運輸信號。
64.根據權利要求63所述的多核苷酸,其中所述多核苷酸在表達載體中。
65.根據權利要求64所述的多核苷酸,其中所述表達載體是病毒載體。
66.根據權利要求65所述的多核苷酸，其中所述病毒載體是AAV載體、逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、HSV載體或慢病毒載體。
67.一種使用根據權利要求53-58中任一項所述的細胞的方法，所述方法包括用光激活所述光激活蛋白。
68.一種使用根據權利要求59-61中任一項所述的細胞的方法，所述方法包括將所述光激活蛋白在其各自的波長激活。
69.一種非人動物，所述非人動物包含根據權利要求59-61中任一項所述的細胞。
70.一種識別動物或組織中的神經細胞之間的跨突觸連接的方法，所述方法包括a)對所述動物或組織的區(qū)域A中的神經細胞施用編碼融合到跨細胞示蹤蛋白的Cre重組酶的第一病毒載體山)對所述動物或組織的區(qū)域B中的神經細胞施用編碼光激活蛋白的第二病毒載體，其中所述光激活蛋白的表達取決于所述Cre重組酶的存在；以及c)識別在區(qū)域B中表達所述光激活蛋白的神經細胞，其中在所述神經細胞中的光激活蛋白的表達指示所述細胞與區(qū)域A中的所述細胞跨突觸連接。
71.—種產生動物或組織中的靶標神經細胞的光控制的方法，所述方法包括a)對所述動物或組織的區(qū)域A施用表達融合到跨細胞示蹤蛋白的第一病毒載體；b)對所述動物或組織的區(qū)域B施用編碼光激活蛋白的第二病毒載體，其中所述光激活蛋白的表達取決于所述Cre重組酶的存在，并且其中在區(qū)域A和區(qū)域B中的神經細胞跨突觸連接；以及c)用激活所述蛋白的光控制區(qū)域B中的神經細胞的動作電位。
72.—種控制動物中的神經元的動作電位的方法，所述方法包括用光激活所述神經元中的光激活蛋白以產生動作電位的改變，其中所述神經元中的光激活蛋白的表達通過以下步驟產生a)對所述動物的區(qū)域A施用表達融合到跨細胞示蹤蛋白的Cre重組酶的第一病毒載體，b)對含有所述神經元的動物的區(qū)域B施用編碼光激活蛋白的第二病毒載體，其中所述光激活蛋白的表達取決于所述Cre重組酶的存在，其中在區(qū)域A和區(qū)域B中的所述神經元跨突觸連接。
73.根據權利要求70-72中任一項所述的方法，其中所述病毒載體是選自由AAV、HSV和慢病毒組成的組的病毒載體。
74.根據權利要求70-72中任一項所述的方法，其中所述跨細胞示蹤蛋白是麥胚凝集素(WGA)或破傷風毒素-片段C(TTC)。
75.一種動物細胞，所述動物細胞包含表達對藍光響應的質子泵的整合外源分子，所述外源分子來源于藍隱藻。
76.根據權利要求75所述的動物細胞,其中所述動物細胞是神經細胞、肌細胞或細胞系O
77.根據權利要求75所述的動物細胞，其中所述外源分子含有表3中所示GtR3氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供多核苷酸和用于在動物細胞中表達光激活蛋白以及通過光刺激改變所述細胞的動作電位的方法。本發(fā)明還提供動物細胞和包含表達所述光激活蛋白的細胞的非人動物。
文檔編號C12N5/071GK102844427SQ201180014303
公開日2012年12月26日 申請日期2011年3月17日 優(yōu)先權日2010年3月17日
發(fā)明者K·戴塞魯斯, 張峰, V·格拉蒂納魯 申請人:小利蘭·斯坦福大學托管委員會