專利名稱：鮑魚腸弧菌作為飼料添加劑在鮑魚養(yǎng)殖中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鮑魚腸弧菌(KiArio Aa7io(ico7i)的新用途,尤其是一種鮑魚腸弧菌作為飼料添加劑在鮑魚養(yǎng)殖中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
皺紋盤鮑(Wiodi discus Aa/wai)是我國重要的海洋生物資源，自然分布于渤海、黃海和日本海水域，素有海洋軟黃金之稱，位居海產(chǎn)八珍之首，具有很高的營養(yǎng)及藥用價值。但是鮑魚生長慢是鮑魚養(yǎng)殖業(yè)面臨的主要問題之一，盡管通過人工飼喂配合餌料能夠加快鮑魚的生長速度，但仍需要:T4年才能達(dá)到80 mm的市場標(biāo)準(zhǔn)；高度集約化人工養(yǎng)殖在應(yīng)用配合餌料的同時還會帶來水質(zhì)惡化快、飼料系數(shù)偏低及病害發(fā)生嚴(yán)重等問題。為了進(jìn)一步提高鮑魚的生長速度及保證成品鮑魚的質(zhì)量，人們對鮑魚苗種品質(zhì)的關(guān)注度越來越高，當(dāng)育苗場在11月份出苗時，生長速度快的幼鮑，由于其規(guī)格大于市場標(biāo)準(zhǔn)(2cm)，更受顧客青睞。鮑魚腸弧菌(Vibrio halioticoli )是皺紋盤鮑腸道優(yōu)勢菌，其16S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中已有記載，相關(guān)弧菌登陸號如下表
菌株I登陸號
Vibrio breoganiiEF599161
Vibrio comitansDQ922915
Vibrio ezuraeAY426980
Vibrio halioticoliAB000390
Vibrio IiarveyiAY750575
Vibrio neonatusAY426979
但是，迄今為止，尚未有關(guān)于鮑魚腸弧菌作為鮑魚養(yǎng)殖飼料添加劑(混合在飼料中或播灑在水池中)的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述問題，提供一種鮑魚腸弧菌作為飼料添加劑在鮑魚養(yǎng)殖中的應(yīng)用。所述鮑魚腸弧菌是WA51菌株，WA51菌株16S rDNA的基因片段序列長度是1456bp，序列信息如下
GCTTGGGCGCAGACTACCATGCAAGTCGAGCGGAACGAGTTATCTGAACCTTCGGGGAACGATAACGGCGTC
GAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTGGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACC
GCATAACGTCTACGGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCTTCAGGATATGCCCAGGTGGGATTAGCTAGTT
GGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACAC
GGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGT
ATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTCGTGAGGAAGGCGTTAAAGTTAATAGCTTTATCGTTTGACG
TTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAAT
TACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAACCGCATTTGAAACTGGCAGGCTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCAGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAGATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAATTTAGCAGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCCAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGGGCAGCCAACCAGCGATGGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCAAAAGAAGTGGGTAGTTTAACCTTCGGGAGGACGCTCAAGAGCTGTACGCCGGCC本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了鮑魚腸弧菌(WA51菌株)具有很強(qiáng)的褐藻酸酶活力，能夠?qū)暳现泻Ｔ逯饕煞趾衷逅峤到鉃橐子跈C(jī)體吸收的寡糖和短鏈脂肪酸，發(fā)明了鮑魚腸弧菌作為飼料添加劑在鮑魚養(yǎng)殖中的應(yīng)用。作為幼鮑飼料添加劑利于幼鮑同病原菌競爭黏附位點，維持腸道正常微生態(tài)平衡并能夠在鮑魚腸道中長期定植，促進(jìn)營養(yǎng)吸收、提高免疫力進(jìn)而提高皺紋盤鮑生長速度和抗病能力，可替代化學(xué)藥物進(jìn)行疾病防治，不破壞生態(tài)環(huán)境；鮑魚腸弧菌(WA51菌株)作為噴灑在水體中的幼鮑飼料添加劑，除具有上述功能外，因其在水體中能夠存活并且對藻類無殺滅作用，鮑魚腸弧菌(WA51菌株)的大量增殖，可同水體中病原菌競爭營養(yǎng)以及分解水體中的有機(jī)質(zhì)，起到凈化水質(zhì)的作用。


圖1是依據(jù)16SrDNA序列構(gòu)建的鮑魚腸弧菌WA51菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹圖。
具體實施例方式一.鮑魚腸弧菌WA51菌株的分離篩選 I.鮑魚來源
采自大連海域。2.鮑魚腸弧菌WA51菌株的分離
無菌條件下解剖健康皺紋盤鮑的腸道并勻漿，梯度稀釋后涂布到2216E固體培養(yǎng)基上，25°C恒溫培養(yǎng)72、6h ;挑取如表I形態(tài)的菌株分離純化后接種到2216E斜面培養(yǎng)基保藏待用；所述的2216E培養(yǎng)基的組分及配比為蛋白胨0. 5g，酵母膏0. lg，磷酸高鐵
0.OOlg，海水 IOOOmL, pH 7. 2 7. 4，121°C滅菌 20min。表I菌株的培養(yǎng)特征
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3.鮑魚腸弧菌WA51菌株的篩選
取實驗室保藏的上述步驟2分離得到的皺紋盤鮑腸道細(xì)菌株，重新接種活化24h后點種于APY固體培養(yǎng)基上，置恒溫培養(yǎng)箱25°C培養(yǎng)4天后，用1%的氯化鈣溶液處理點種的菌株，篩選出水解圈直徑同菌體直徑比值最大的菌株，即鮑魚腸弧菌WA51。所述APY培養(yǎng)基的組分及配比分別為蛋白胨0. 5%，海藻酸鈉0. 5%、酵母膏0. 1%、瓊脂I. 6% (固體)。二.鮑魚腸弧菌WA51菌株的鑒定
I.鮑魚腸弧菌WA51菌株生理生化特征 鮑魚腸弧菌WA51在光學(xué)顯微鏡下觀察有鞭毛，細(xì)胞革蘭氏染色陰性，產(chǎn)生吲哚，發(fā)酵葡萄糖、果糖、麥芽糖、甘露糖、淀粉產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能利用半乳糖、乳糖、蔗糖、棉籽糖、L-阿拉伯糖和幾丁質(zhì)，對弧菌抑制劑0/129敏感，接觸酶陽性，氧化酶陽性，無鹽條件下不生長，不具有運(yùn)動型，還原硝酸鹽。2. WA51菌株16S rDNA的基因片段序列測定
將WA51菌株純培養(yǎng)物接種于普通肉湯，28°C搖床培養(yǎng)48h，離心收集菌體，采用離心柱型細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA。擴(kuò)增WA51菌株16S rDNA的基因采用通用引物，正向引物為
5 ; - CAGGCCTAACACATGCAAGTC - 3 ;(對應(yīng)于萬.16S rDNA 5 ; 43_63f)，反向引物為3' - GGGCGGffGTGTACAAGGC - 5 ;(對應(yīng)于萬.16S rDNA 3 ; 1405-1387r),由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(50 iiL) :10XPCR Buffer5 u L, 25mmol/LMgCl2 4 u L, 2mmol/L dNTPs 4 y L，5U/y L 的 Taq DNA 聚合酶 0. 5 y L，
0.6mmol/L的引物各I U L，模板DNA 2 u L, ddH20 32. 5 u L0 PCR反應(yīng)條件在94°C預(yù)變性5min,進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段94°C變性Imin — 56°C復(fù)性Imin — 72°C延伸2min,循環(huán)35次，最后72°C延伸5min。結(jié)束反應(yīng)后，PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用凝膠回收試劑盒回收，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。WA51菌株16S rDNA的基因片段序列長度是1456bp。WA51菌株16S rDNA序列信息 GCTTGGGCGCAGACTACCATGCAAGTCGAGCGGAACGAGTTATCTGAACCTTCGGGGAACGATAACGGCGTC
GAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTGGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACC
GCATAACGTCTACGGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCTTCAGGATATGCCCAGGTGGGATTAGCTAGTT
GGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACAC
GGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGT
ATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTCGTGAGGAAGGCGTTAAAGTTAATAGCTTTATCGTTTGACG
TTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAAT
TACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAACCGCATTT
GAAACTGGCAGGCTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGA
ATACCAGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAGATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGA
TACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCG
TTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGA
GCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAATTTAGCAGAGATGGTTTG
GTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGC
AACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCCAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGA
GGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGGGCAGCCAACCAGCGATGGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCAAAAGAAGTGGGTAGTTTAACCTTCGGGAGGACGCTCAAGAGCTGTACGCCGGCC3. WA51菌株序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建
將測定的WA51菌株16S rDNA序列，與GenBank數(shù)據(jù)庫中的所有已測定的原核生物16S rDNA進(jìn)行比對，其中WA51同鮑魚腸弧菌{Vibrio halioticoli)的相似率達(dá)到99. 3%。利用Blast程序從GenBank數(shù)據(jù)庫中調(diào)出相關(guān)弧菌模式菌株的16S rDNA序列(相關(guān)弧菌菌株的登陸號如背景技術(shù)圖表所示)，通過Clustal X I. 83軟件進(jìn)行多序列比對，并采用Neighbour-joining法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建(如圖I所示)，分析表明WA51菌株與鮑魚腸弧菌(m_rio Aa7io(ico7i)之間 的進(jìn)化距離相隔較近。再結(jié)合WA51菌株的形態(tài)特征、和生理生化特征，認(rèn)為WA51菌株屬于鮑魚腸弧菌{Vibrio halioticoli)。該菌株WA51經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和16S rDNA序列同源性分析，鑒定為鮑魚腸弧菌(Vibrio halioticoli、。三.鮑魚腸弧菌WA51菌株對海藻的作用
I.培養(yǎng)基采用海帶粉作為營養(yǎng)源。2.接種與培養(yǎng)從斜面挑取篩選的鮑魚腸弧菌WA51菌株接種到150ml的
APY液體培養(yǎng)基中，25°C培養(yǎng)48h作為發(fā)酵液的種子液，按照10%的接種量吸取25ml種子液加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，25°C培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)速120rpm/min。培養(yǎng)結(jié)束后測定發(fā)酵液中總酸度、多糖和總蛋白含量，取樣均在無菌條件下操作。測定結(jié)果見表2。表I鮑魚腸弧菌WA51發(fā)酵海帶粉營養(yǎng)物質(zhì)含量變化
權(quán)利要求
1.一種鮑魚腸弧菌作為飼料添加劑在鮑魚養(yǎng)殖中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述鮑魚腸弧菌作為飼料添加劑在鮑魚養(yǎng)殖中的應(yīng)用，其特征在于所述鮑魚腸弧菌是WA51菌株，WA51菌株16S rDNA的基因片段序列長度是1456bp，序列信息如下GCTTGGGCGCAGACTACCATGCAAGTCGAGCGGAACGAGTTATCTGAACCTTCGGGGAACGATAACGGCGTCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTGGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAACGTCTACGGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCTTCAGGATATGCCCAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTCGTGAGGAAGGCGTTAAAGTTAATAGCTTTATCGTTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAACCGCATTTGAAACTGGCAGGCTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCAGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAGATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAATTTAGCAGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCCAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGGGCAGCCAACCAGCGATGGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCAAAAGAAGTGGGTAGTTTAACCTTCGGGAGGACGCTCAAGAGCTGTACGCCGGCC o
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鮑魚腸弧菌作為飼料添加劑在鮑魚養(yǎng)殖中的應(yīng)用，鮑魚腸弧菌(WA51菌株)具有很強(qiáng)的褐藻酸酶活力，能夠?qū)暳现泻Ｔ逯饕煞趾衷逅峤到鉃橐子跈C(jī)體吸收的寡糖和短鏈脂肪酸，發(fā)明了鮑魚腸弧菌作為飼料添加劑在鮑魚養(yǎng)殖中的應(yīng)用。作為幼鮑飼料添加劑利于幼鮑同病原菌競爭黏附位點，維持腸道正常微生態(tài)平衡并能夠在鮑魚腸道中長期定植，促進(jìn)營養(yǎng)吸收、提高免疫力進(jìn)而提高皺紋盤鮑生長速度和抗病能力，可替代化學(xué)藥物進(jìn)行疾病防治，不破壞生態(tài)環(huán)境。
文檔編號C12N1/20GK102613394SQ20111044661
公開日2012年8月1日 申請日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月28日
發(fā)明者冷曉飛, 劉小林, 劉明泰, 姜海峰, 常亞青, 張艷, 李旭光, 王高學(xué), 許淑芬, 鄒闖, 陳丹, 高洪濤 申請人:大連海寶漁業(yè)有限公司