專利名稱：低分化的甲狀腺癌細胞系pdtc-1及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種低分化的甲狀腺癌細胞系roTC-ι及其應用。
背景技術：
甲狀腺未分化癌是致死率較高的腫瘤，雖然占甲狀腺惡性腫瘤的1% _5%，但甲狀腺未分化癌死亡患者卻占甲狀腺癌死亡患者的一半以上，即使采用包括手術、放療、化療的綜合治療，中位生存期僅2.9-10月，I年生存率在9.7 % -37.8 %，3年生存率在
11.7%-31.2%。低分化的甲狀腺癌是甲狀腺未分化癌的一種特殊類型，是分化好的甲狀腺癌向未分化的甲狀腺癌演化的一個階段，因此對于研究甲狀腺癌的生物學特點有重要的價值。由于甲狀腺未分化 癌發(fā)病率低、死亡率高，進行大樣本的隨機對照研究較困難，文獻報道多為回顧性總結，缺乏可信度較高的循證醫(yī)學證據(jù)，因而建立動物的移植瘤模型便成為進行實驗研究的理想方法。1962年英國人Grist首先發(fā)現(xiàn)裸小鼠(nude mice)，之后研究表明這是由于小鼠染色體等位基因突變而引起，表現(xiàn)為先天性胸腺發(fā)育不良，皮膚無毛，T淋巴細胞免疫缺陷。1969年Rygaard和Povlesev首先將人類結腸腺癌移植裸小鼠成功，為腫瘤的研究開創(chuàng)了新局面。目前尚無有關甲狀腺低分化癌的細胞株及腫瘤模型報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種低分化的甲狀腺癌細胞株及其培養(yǎng)方法和應用。本發(fā)明所提供的低分化的甲狀腺癌細胞株，其保藏編號為CGMCC N0.4939。本發(fā)明的培養(yǎng)上述細胞株的方法，包括如下步驟:將上述細胞株接種于細胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，得到增殖的權利要求1所述細胞株；所述細胞培養(yǎng)基的含10%胎牛血清的PRM 1640培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)方法中，所述培養(yǎng)的溫度為37°C，所述培養(yǎng)的二氧化碳體積濃度為5%。上述細胞株在構建用于開發(fā)具有抑制甲狀腺癌功能的藥物的模型中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述細胞株在開發(fā)具有抑制甲狀腺癌功能的藥物中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述細胞株在構建甲狀腺癌移植瘤模型中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述任一所述應用中，所述甲狀腺癌為分化好的甲狀腺癌、低分化的甲狀腺癌和/或未分化的甲狀腺癌。上述任一所述應用中，所述模型為鼠模型。本發(fā)明建立了甲狀腺低分化癌的細胞系，并且利用其成功地建立了裸鼠移植瘤模型，為研究甲狀腺癌細胞學提供可篩選的細胞系，可用于構建篩選甲狀腺癌敏感化療藥物的重要模型。在本發(fā)明的基礎上，可以從基因水平、從蛋白質(zhì)水平研究甲狀腺分化好、低分化及未分化癌的差異，對于闡述甲狀腺癌的發(fā)生機制、發(fā)現(xiàn)治療靶點有重要意義。本發(fā)明為研究甲狀腺癌的演化及低分化癌的生物學特性提供平臺，利于對甲狀腺癌的發(fā)生機制、轉(zhuǎn)移復發(fā)進行深入研究。


圖1為裸鼠甲狀腺癌移植瘤生長曲線。圖2為裸鼠移植瘤(接種后第20天)。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、低分化的甲狀腺癌細胞株及其制備與應用一、制備及驗證本發(fā)明通過下述方法建立低分化的甲狀腺癌細胞系roTC-ι:細胞分離篩選:腫瘤標本為低分化甲狀腺癌的離體標本，取新鮮的手術標本，選擇非壞死區(qū)域“魚肉狀”的腫瘤組織，進行細胞分離和篩選，得到目的細胞株，記作TOTC-1。將細胞株roTC-ι接種于含10%胎牛血清的PRM 1640培養(yǎng)基，在37°C 5% C02孵箱條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為2周，得到第一代培養(yǎng)細胞；將第一代培養(yǎng)細胞再接種于10%胎牛血清的PRM 1640培養(yǎng)基，在37°C 5%的CO2孵箱條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為2周，得到第二代培養(yǎng)細胞；如此培養(yǎng)10代。觀察每代細胞的生長情況。每代細胞的生長曲線基本一致，說明該細胞株I3DTC-1的增殖能力穩(wěn)定。

將細胞株roTC-ι于2011年6月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC N0.4939，分類命名為低分化甲狀腺癌細胞系-1，細胞株名稱為I3DTC-1。二、應用一建立甲狀腺癌移植瘤模型裸鼠購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所，實驗動物編號SCXK(京)2009-0004，均為雌性BALB/c nu小鼠，5周齡，體重(18±2)g。裸鼠飼養(yǎng)在光照充足，常溫，飲食不限的SPF級動物飼養(yǎng)室內(nèi)。模型構建方法:取健康裸鼠，選取IO6細胞注射至裸鼠右腋下，飼養(yǎng)4 6周，得到的裸鼠即為甲狀腺癌移植瘤模型。腫瘤檢測:接種細胞株roTC-Ι后(接種當天記作第O天)，接種2-3周后即可見皮下硬結，在腫瘤長徑達到0.5cm即可開始測量，隔天以游標卡尺測量腫瘤的長徑、短徑，按V=ab2/2計算腫瘤體積并繪制腫瘤生長曲線。待裸鼠體內(nèi)腫瘤生長至直徑達1.5cm時處死小鼠，在無菌條件下剝離腫瘤，生理鹽水清洗數(shù)次，剔除壞死的組織，將剩余的腫瘤組織標本進行免疫組化檢測，檢測指標見表I。表I中的各個分子均是低分化的甲狀腺癌的標志性物質(zhì)。免疫組化檢測中使用的一抗如下:免疫組化試劑均購自福州邁新公司，檢測E-cadherin:E_鈣粘附蛋白，鼠抗人單克隆抗體，MAB-0589 ；檢測β -catenin: β -1丐聯(lián)蛋白，鼠抗人單克隆抗體，ΜΑΒ-0259 ；
檢測TG:甲狀腺球蛋白，鼠抗人單克隆抗體，MAB-0161 ；檢測P53:P53,鼠抗人單克隆抗體，MAB-0142 ；檢測K1-67:K1-67,鼠抗人單克隆抗體，MAB-0129 ；檢測VEGFR-2:KDR/FIK_1，兔抗人多克隆抗體，RAB-0522 ；檢測PDGFR- β:兔抗人多克隆抗體，Labvision公司，RB-1692 ；檢測VEGF:血管內(nèi)皮生長因子，兔抗人多克隆抗體，RAB-0157 ；免疫組化檢測中使用的二抗為福州邁新公司的即用型非生物素免疫組化檢測試劑盒，產(chǎn)品編號Kit-9901，試劑盒包括增強劑和酶標羊抗鼠/兔聚合物兩種試劑。重復上述模型構建和腫瘤檢測的操作，重復20次，第一次操作得到的模型記作第I代模型，第二次操作得到的模型記作第2代模型，依次類推，第20次操作得到的模型記作第20代模型。每次觀察的時間為30-50天。模型中腫瘤的表型如圖2所示。第13代的腫瘤生長曲線如圖1所示，其它代的腫瘤生長曲線與其無顯著差異。由此得出的結論:該甲狀腺低分化癌細胞系成瘤穩(wěn)定，生物學特性完整，可作為以后研究甲狀腺癌藥物篩選的良好模型。每代的免疫組化檢測結果如表I所示。表I中免疫組化結果判斷根據(jù)福州邁新公司提供的參考標準，土表示較難判斷，++++表示強陽性，+++表示中陽性，++表示陽性，+表示弱陽性，-表示陰性。

表I裸鼠傳代過程中免疫組化指標變化
權利要求
1.低分化的甲狀腺癌細胞株，其保藏編號為CGMCCN0.4939。
2.一種培養(yǎng)權利要求1所述細胞株的方法，包括如下步驟:將權利要求1所述細胞株接種于細胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，得到增殖的權利要求1所述細胞株； 所述細胞培養(yǎng)基的含10%胎牛血清的PRM 1640培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)的溫度為37°C，所述培養(yǎng)的二氧化碳體積濃度為5%。
4.權利要求1所述細胞株在構建用于開發(fā)具有抑制甲狀腺癌功能的藥物的模型中的應用。
5.權利要求1所述細胞株在開發(fā)具有抑制甲狀腺癌功能的藥物中的應用。
6.權利要求1所述細胞株在構建甲狀腺癌移植瘤模型中的應用。
7.根據(jù)權利要求4-6中任一所述的應用，其特征在于:所述甲狀腺癌為分化好的甲狀腺癌、低分化的甲狀腺癌和/或未分化的甲狀腺癌。
8.根據(jù)權利要 求4-7中任一所述的應用，其特征在于:所述模型為鼠模型。
全文摘要
本發(fā)明公開了低分化的甲狀腺癌細胞系PDTC-1及其應用。該細胞株為低分化的甲狀腺癌細胞株，其保藏編號為CGMCC No.4939。本發(fā)明建立了甲狀腺低分化癌的細胞系，并且利用其成功地建立了裸鼠移植瘤模型，為研究甲狀腺癌細胞學提供可篩選的細胞系，可用于構建篩選甲狀腺癌敏感化療藥物的重要模型。在本發(fā)明的基礎上，可以從基因水平、從蛋白質(zhì)水平研究甲狀腺分化好、低分化及未分化癌的差異，對于闡述甲狀腺癌的發(fā)生機制、發(fā)現(xiàn)治療靶點有重要意義。本發(fā)明為研究甲狀腺癌的演化及低分化癌的生物學特性提供平臺，利于對甲狀腺癌的發(fā)生機制、轉(zhuǎn)移復發(fā)進行深入研究。
文檔編號C12R1/91GK103160467SQ20111041691
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月14日 優(yōu)先權日2011年12月14日
發(fā)明者馬潔, 安常明, 韓志楷, 王錚, 趙平 申請人:中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所