專利名稱：水稻胡麻葉斑病原菌的分子鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻胡麻葉斑病原菌的分子鑒定方法，具體地說(shuō)，是將胡麻葉斑病原菌從染病的水稻材料上分離和培養(yǎng)后提取DNA，利用分子生物學(xué)的方法進(jìn)行鑒定，屬于病原真菌鑒定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
水稻胡麻葉斑病是由半知菌的平臍蠕孢屬引起的一種真菌病害。從秧苗期到收獲期都可發(fā)病，稻株上各部位均易受害。葉片及葉鞘上的病斑多為芝麻粒狀，病斑中央為褐色至灰白色，邊緣褐色，周圍有深淺不同的黃色暈圈，嚴(yán)重時(shí)能相互結(jié)成不規(guī)則的大病斑。谷粒感病受害，病斑呈灰黑色，可擴(kuò)大及全粒，造成秕谷，嚴(yán)重的谷粒質(zhì)脆易碎，俗稱“茶米”。 該病分布于世界各稻區(qū)，我國(guó)南北稻區(qū)均有發(fā)生。感病田塊，一般減產(chǎn)10-30%，嚴(yán)重者減產(chǎn) 50%以上甚至絕收。孟加拉國(guó)曾因本病流行，稻谷失收而造成饑荒。通常認(rèn)為該病是由于缺乏肥、水等原因引起的。在我國(guó)，此病以前發(fā)生普遍而嚴(yán)重，成為國(guó)內(nèi)水稻三大病害之一。 后來(lái)隨著水稻生產(chǎn)管理和施肥水平的不斷提高，其為害日益減輕。因此，近年來(lái)對(duì)該病很少有研究，研究資料比較缺乏。由于耕作方法和氣候的改變，該病在我國(guó)南北多個(gè)稻區(qū)近幾年又嚴(yán)重發(fā)生。因此，必需重新重視對(duì)胡麻葉斑病的研究。但目前還缺乏水稻胡麻葉斑病原菌的分離和鑒定方法，無(wú)法有效地開展對(duì)水稻胡麻葉斑病的研究。同時(shí)，由于胡麻葉斑病和稻瘟病在病癥上非常相像，從發(fā)病形態(tài)上容易混淆這兩種病害，嚴(yán)重影響了該病害的防控。真核生物的核糖體包括大亞基60S與小亞基40S，大亞基60S由25_28SrRNA、5. 8S rRNA和5S rRNA及核糖體蛋白構(gòu)成；小亞基40S則由18S rRNA與相關(guān)核糖體蛋白構(gòu)成。 5.8S、25S、18S之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄基因間隔序列為基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔序列(ITS)。因此，18S rDNA 是真核生物核糖體小亞基40S rRNA基因群的一個(gè)轉(zhuǎn)錄原件，它既有保守區(qū)又有可變區(qū)，應(yīng)用分類范圍為界、門、綱、目、科、屬、種間，是系統(tǒng)發(fā)育中，種級(jí)以上的良好標(biāo)記，一般適應(yīng)于較高水平類群間的系統(tǒng)分析。ITS應(yīng)用分類范圍為屬、種間、種內(nèi)，廣泛適應(yīng)于較低分類階元。不同的真菌，其18S rDNA和ITS序列和長(zhǎng)度都是不同的，如果能對(duì)胡麻葉斑病原菌的 18S rDNA和ITS進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增并測(cè)序，就可以通過(guò)比較待測(cè)真菌與胡麻葉斑病原菌 18S rDNA和ITS長(zhǎng)度和序列來(lái)判斷待測(cè)真菌是否屬于胡麻葉斑病原菌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決胡麻葉斑病原菌的鑒定問(wèn)題，提供一種用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定胡麻葉斑病原菌的方法。為達(dá)到本發(fā)明的目的，本發(fā)明人多次從發(fā)病田塊取樣感染胡麻葉斑病的水稻葉片，樣品均經(jīng)過(guò)植物病理學(xué)專家鑒定確認(rèn)。采用本發(fā)明的方法，從病原菌中提取DNA，用設(shè)計(jì)的18S rDNA和ITS引物通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增提取到的DNA模板，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，18S rDNA區(qū)序列長(zhǎng)度為1^9bp，ITS區(qū)序列長(zhǎng)度為586bp，如圖1所示，具體序列見 SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2。
上述鑒定方法中，待鑒定真菌的基因組DNA提取采用氯化芐提取純化的方法，其步驟為取真菌材料加入無(wú)菌研缽中，同時(shí)加入用PH9. 0的0. 15mol/L三羥氨基甲烷溶液 7ml與pH8. 0的0. 05mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液8mL混合后定容至IOOmL配制而成的提取緩沖液，迅速?gòu)氐籽心セ靹?，取研磨后的液體加入無(wú)菌離心管中，再依次加入質(zhì)量百分比濃度為10%的十二烷基磺酸鈉溶液和氯化芐試劑，混勻，50°C水浴處理，加入等體積的pH5. 2 的3mol/L醋酸鈉溶液混勻，加入70-75%的乙醇洗滌沉淀，離心棄去乙醇，揮發(fā)干乙醇后用無(wú)菌水溶解，瓊脂糖凝膠電泳分析得到基因組DNA樣品。上述擴(kuò)增18S rDNA和ITS片段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件是。擴(kuò)增體系單核苷酸加 1μ 1 ；緩沖液加6. 25 μ 1 ；引物加10 μ 1 ；模板基因組DNA加1.5μ 1 ；聚合酶加2. 5μ 1 ；加雙蒸水補(bǔ)足至50 μ 1。擴(kuò)增條件95°C變性5分鐘；94°C 40秒，45°C 40秒，72°C 90秒，33個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘。4°C終止反應(yīng)并保存。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有如下有益效果通過(guò)測(cè)定胡麻葉斑病原菌的18S rDNA和ITS序列，建立了一套利用分子生物學(xué)手段鑒別胡麻葉斑病原菌的方法。發(fā)明人從胡麻葉斑病原菌中提取DNA，用設(shè)計(jì)的18S rDNA 和ITS引物經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增提取到的DNA模板，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)測(cè)序，胡麻葉斑病原菌 18S rDNA區(qū)序列長(zhǎng)度為1829bp, ITS區(qū)序列長(zhǎng)度為586bp，具體序列見SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2。利用本發(fā)明的鑒定方法，通過(guò)直接測(cè)定待測(cè)菌的18S rDNA和ITS區(qū)序列，準(zhǔn)確判斷水稻生產(chǎn)上發(fā)生的疑似病害是否是胡麻葉斑病，從而采取及時(shí)有效的防控措施。


圖1是水稻胡麻葉斑病原菌分子特征。其中18S rDNA擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為1800bp， ITS區(qū)序列長(zhǎng)度約為580bp。
具體實(shí)施例方式
1.菌株的分離取有胡麻葉斑病典型癥狀的大田水稻葉片，在病健交界處剪取小塊發(fā)病組織，用 75%的乙醇浸泡30秒、0. 升汞浸泡2分鐘、無(wú)菌水換洗5次，將帶病組織放在培養(yǎng)皿內(nèi)的無(wú)菌濕潤(rùn)濾紙上，用封口膜封好，25°C光照培養(yǎng)2天，挑取組織樣品邊緣的單個(gè)菌絲，轉(zhuǎn)移到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。為保證分離到的菌的純度，連續(xù)多次重復(fù)挑取每次分離培養(yǎng)的菌絲。2.分子鑒定(1)真菌DNA的提取挑取菌絲，接到PDA上活化2_3天，然后將菌餅接到PDA液體培養(yǎng)基中，28°C、120轉(zhuǎn)/min搖床搖動(dòng)黑暗培養(yǎng)2天，漏斗過(guò)濾培養(yǎng)物得到菌絲體。菌絲體用液氮研磨后，改良CTAB法提取菌株DNA。(2)以上述提取的基因組DNA為模板，分別采用如下的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序擴(kuò)增18SrDNA和ITS核酸片段。18SrDNA引物P1 (5' -GTA GTC ATA TGC TTG TCTC-3‘ ) ；P2(5' -TCC GCA GGT TCA CCT ACGGA-3‘ ) ；ITS 引物 P3(5' -TCC GTA GGT GAA CCT GCGC-3‘ ) ；P4(5' -TCC TCC GCT TAT TGA TATGC-3‘)。 擴(kuò)增體系單核苷酸加1μ 1 ；緩沖液加6. 25 μ 1 ；引物Ρ1/Ρ2或者引物Ρ3/Ρ4加10 μ 1 ；模板基因組DNA1. 5 μ 1 ；聚合酶加2. 5 μ 1 ；加雙蒸水補(bǔ)足至50 μ 1。擴(kuò)增條件95°C變性5分鐘后；94°C 40秒，45°C 40秒，72°C 90秒，進(jìn)行33個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘，4 °C保存。 (3)PCR產(chǎn)物電泳，用膠回收試劑盒純化回收目的片段。目的片段的克隆將回收的目的片段連接至PMDTM18-T載體，然后轉(zhuǎn)染至JM109感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)染的JM109感受態(tài)細(xì)胞涂布在含有X-Gal、IPTG、Amp的瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落。在37°C培養(yǎng)至少17 小時(shí)，置于4°C冰箱內(nèi)2小時(shí)。( 質(zhì)粒提取和測(cè)序挑取白色菌落，接入LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，送交生物公司測(cè)序。3.用該方法驗(yàn)證某種待測(cè)真菌是否為胡麻葉斑病原菌(1)提取待鑒定真菌的DNA，具體如下無(wú)菌收集培養(yǎng)待鑒定菌種的菌絲體0. Ig置于滅菌的研缽中，加入0. 5ml的提取緩沖液(pH9. 0的0. 15mol/L三羥氨基甲烷溶液7ml與pH8. 0的0. 05mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液8mL混合后定容至IOOmL配制)，迅速?gòu)氐籽心セ靹颍⊙心ズ蟮囊后w加入無(wú)菌離心管中，再依次加入質(zhì)量百分比濃度為10%的十二烷基磺酸鈉溶液0. 1-0. 2mL和氯化芐試劑 0. 3-0. 6mL,充分混勻，50°C保溫1-2小時(shí)。加入等體積的ρΗ5· 2的3mol/L醋酸鈉溶液混勻，冰水浴15-20分鐘，6000轉(zhuǎn)/分鐘室溫離心15-20分鐘；取上清加等體積無(wú)水乙醇室溫沉淀20-50分鐘，去上清，1 X IO4轉(zhuǎn)/分鐘室溫離心15分鐘，沉淀用70-75%的乙醇洗滌沉淀，離心棄去乙醇，風(fēng)干后無(wú)菌水溶解，瓊脂糖凝膠電泳分析得到基因組DNA樣品。提取過(guò)程中同時(shí)設(shè)置無(wú)菌水的空白對(duì)照，該對(duì)照也作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過(guò)程中的對(duì)照模板，以防止提取過(guò)程中外源DNA的污染。(2)以上述提取的基因組DNA為模板，分別采用如下的擴(kuò)增體系和程序擴(kuò)增 18SrDNA和ITS核酸片段。18SrDNA 引物Pl(5' -GTA GTC ATATGC TTG TCTC-3' ) ；P2(5' -TCC GCA GGT TCA CCT ACGGA-3‘)；ITS 引物:P3(5' -TCC GTA GGT GAA CCT GCGC-3‘ ) ；P4(5' -TCC TCC GCT TAT TGA TATGC-3‘)。擴(kuò)增體系單核苷酸加1μ 1 ；緩沖液加6. 25 μ 1 ；引物Ρ1/Ρ2或者引物Ρ3/Ρ4加 10 μ 1 ；模板基因組DNA1. 5μ 1 ；聚合酶加2. 5 μ 1 ；加雙蒸水補(bǔ)足至50 μ 1。擴(kuò)增程序95°C變性5分鐘后；94°C 40秒，45°C 40秒，72°C 90秒，進(jìn)行33個(gè)循環(huán)； 最后72°C延伸5分鐘，4°C保存。擴(kuò)增產(chǎn)物的回收、克隆和測(cè)序PCR產(chǎn)物電泳后，用膠回收試劑盒純化回收目的片段。將回收好的目的片段連接至PMDTM18-T載體，然后轉(zhuǎn)染至JM109感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)染的JM109感受態(tài)細(xì)胞涂布在含有X-Gal、IPTG、Amp的瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落。 在37°C培養(yǎng)至少17小時(shí)，挑取白色菌落，接入LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，送交生物公司測(cè)序。(3)測(cè)序結(jié)果的比較如果待測(cè)菌不能擴(kuò)增出圖1的片段，那么待測(cè)菌肯定不是胡麻葉斑病原菌；如果待測(cè)菌可以擴(kuò)增出圖1的片段，則需要進(jìn)一步比較擴(kuò)增出的待測(cè)菌ISSrDNA和ITS序列和真實(shí)的胡麻葉斑病原菌ISSrDNA和ITS序列差異，如果差異在15%以上，則待測(cè)菌也不是胡麻葉斑病原菌。
SEQ ID NO.1
agtgccaagcttgcatgcctgcaggtcgacgatttccgcaggttcacctacggagacctt60
gttacgacttttacttcctctaaatgaccgagtttgacgaactttccggcttggggtggt120
cgttgccaacctccccgagccagtccgaacgcctcactgagccattcaatcggtagtagc180
gacgggcggtgtgtacaaaggtcagggacgtaatcaacgcatgctgatgacacgcgctta240
ctaggcattcctcgttgaagagcaataattgcaatgctctatccccagcacgacagagtt300
taacaagattacccagacctttcggccaaggtgaagaactcgttggctctgtcagtgtag360
CgCgCgtgCggcccagaacatctaagggcatcacagacctgttattgcctcaaacttcca420
tcaacttgagttgatagtctctctaagaagccggcgaccagccaaagctagcctggctat480
ttagcagagtaaggtctcgctcgttatcgcaattaagcagacaagtcaccccacgaacta540
agaacggccatgcaccaccacctgaaaaatcaagaaagagctctcaatctgtcaatcctt600
atttcatctggacctggtgagtttccccgtgttgagtcaaattaagccgcaggctccacg660
cctggtggtgaccttccgtcaatttctttaagtttcagccttgcgaccataatcccccca720
gaacccaaaaactttgatttctcgtaaggtgccgagcgagtcagaaaaagaacatcgccc780
gatccctagtcggcatagtttacggttaagactacgacggtatctgatcgtcttcgatcc840
cctaactttcgttcactgattaatgaaaacatccttggcaaatgctttcgcagtagttag900
tcttcagtaaatccaagaatttcacctctgacaactgaatactgatgcccccgactgttc960
ctgttaatcattgcggcgtctctagaaaccaacaaatagaaacgcacgccctatttgata1020
ttccatgctacgtatcgagcaagcctgcttgacactctatttttcaagtaaagtcctgat1080
tccccaacacgcccagtaaagggcatgaggttcttcagaaggaaggcccggccggacgag1140
tgcacgcggtgaggcggacccgccagccagacccaagtttcaactacgagctttttaact1200
gcaacaactttaatatacgctattggagctggaattaccgcggctgctggcaccagactt1260
gccctccaattgttcctcgttaagaggtttaaattgtactcattccaattacaagaccca1320
aaagagccctgtatcagtatttattgtcactacctccccgtgtcgggattgggtaatttg1380
cgcgcctgctgccttccttggatgtggtagccgtttctcaggctccctctccggaatcga1440
accctaattccccgttacccgttgaaaccatggtaagccaataccttaccatcgaaagtt1500
gatagggcagaaatttgaatgaaccgtcgccagcgcaaggctatgcgatccgtaaagtta1560
tcatgaatcaccaaaaagccccgaagggcattggttttttcacatccctt1620
ccgaagtcgggattttcagcatgtattagctctagaattaccacggttatccaagtagta1680
aggtattatcaaataaacgataactgatttaatgagccattcgcagtttcacggtataat1740
tgcttatacttagacatgcatggcttaatctttgagacaagcatatgactacaatctcta1800
gaggatcccc gggtaccgag ctcgaatcg1829
SEQ ID NO. 2
gggtacctgcgcagggatcattacacaacaaaatatgaaggcctggctttCgCggCCggC60
tgaagtatttttttcacccatgtcttttgcgcacttgttgtttcctgggcgggttcgccc120
gccaccaggaccaaaccataaacctttttttcttatgcagtttccatcagcgtcagtaaa180
aacaatgtaattattacaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaa240
cgcagcgaaatgcgatacgtagtgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttga300
acgcacattgcgccctttgg tattccaaag ggcatgcctg ttcgagcgtc atttgtacct360tcaagctttgcttggtgttg ggcgtttttt tgtctccctc tttctgggag actcgcctta420aaacgattggcagccggcct actggtttcg gagcgcagca cattttttgc gctttgtatc480aggagaaaaggacggtactc catcaagact ctacattttt cacttttgac ctcggatcag540gtagggatacccgctgaact taagcatatc aaaaaccggg aggaaa58權(quán)利要求
1. 一種利用18S rDNA和ITS長(zhǎng)度和序列特征鑒別胡麻葉斑病原菌的方法，包括如下步驟(1)從待鑒定的真菌樣品中提取基因組DNA。(2)以步驟(1)提取到的DNA樣品為模板，用針對(duì)胡麻葉斑病原菌18SrDNA和ITS的專用引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增得到待鑒定真菌的18S rDNA和ITS片段產(chǎn)物。擴(kuò)增18S rDNA 的正向引物 Pl 為5' -GTA GTC ATA TGC TTG TCTC-3‘，反向引物 P2 為5' -TCC GCA GGT TCA CCT ACGGA-3‘。擴(kuò)增 ITS 的正向引物 P3 為5' -TCC GTA GGT GAA CCT GCGC-3‘，反向引物 P4:5' -TCC TCC GCTTAT TGA TATGC-3‘。在 50 μ L 的反應(yīng)體系中完成擴(kuò)增反應(yīng)，以雙蒸水代替模板DNA作空白對(duì)照。(3)如果步驟( 能獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，將擴(kuò)增反應(yīng)得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。純化含有擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶。(4)將步驟C3)純化后的18SrDNA和ITS產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序，得到待鑒定的真菌樣品的18S rDNA和ITS的核苷酸序列。(5)將步驟(4)獲得的核苷酸序列與SEQID NO. 1和SEQ ID NO. 2中的核苷酸序列進(jìn)行對(duì)比，如果吻合，則待鑒定真菌判斷為胡麻葉斑病原菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及水稻胡麻葉斑病原菌的一種分子鑒定方法。所說(shuō)的分子鑒定包括擴(kuò)增到的ITS區(qū)、18S rDNA核苷酸序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.1及SEQID NO.2所示。分子鑒定時(shí)，先提取待測(cè)菌的DNA，用文中胡麻葉斑病原菌的18S rDNA和ITS引物通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增挑取到的DNA。如果有擴(kuò)增產(chǎn)物，測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列，交其與SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2分別進(jìn)行比較。在上述分析基礎(chǔ)上，判斷待測(cè)病原菌是否是胡麻葉斑病原菌。用本發(fā)明的方法可以為胡麻葉斑病的有效診斷和防治提供可靠依據(jù)。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102399888SQ20111038373
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月28日
發(fā)明者彭陳, 郭士偉, 陳洪亮 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院