專利名稱：CSFV、PRRSV、PCV2與SIV H9亞型多重SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光PCR引物及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種病毒的檢測方法，具體涉及CSFV、PRRSV、PCV2及SIV H9亞型多重 SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR引物及其檢測方法。
背景技術(shù)：
豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)都能夠不同程度的導(dǎo)致妊娠引起種豬不育，即公豬睪丸腫脹，精液質(zhì)量下降，失去種用能力； 母豬表現(xiàn)為不發(fā)情，返情，不孕；妊娠母豬發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊、弱仔及新生仔豬發(fā)病且導(dǎo)致大量死亡等，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。SIV能引起人獸共患病的發(fā)生和傳播，威脅人類安全。對(duì)這類傳染病的有效控制是保證人類公共安全和養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。目前，國內(nèi)外對(duì)以上三種病毒已經(jīng)有大量的相關(guān)研究，建立了病毒分離、ELISA檢測方法、免疫組化法、免疫熒光法等方法，以及以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的檢測方法，如PCR、套式PCR和競爭PCR等。但這些方法都存在這樣那樣的缺點(diǎn)病毒分離耗時(shí)、原位雜交操作繁瑣等，PCR雖然有較高的特異性和敏感性，但容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，而且不能定量，往往漏檢隱性感染的動(dòng)物，造成疾病的蔓延。TaqMan探針方法能夠定量，但成本較高，不利于推廣。 臨床上，這幾種病毒經(jīng)?；旌细腥?，靠分離病毒和抗體檢測來確診容易造成假陰性，而且操作繁瑣，對(duì)儀器的操作要求較高，所需時(shí)間長，亟需一種操作簡單、快速的檢測、準(zhǔn)確率高的鑒別診斷方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是CSFV、PRRSV, PCV2及SIV H9亞型這幾種病毒常常以混合感染的形式出現(xiàn)，靠分離病毒和抗體檢測來確診容易造成假陰性，而且操作繁瑣，提供一種CSFV、PRRSV, PCV2及SIV H9亞型多重STOR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR引物及其檢測方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是CSFV、PRRSV, PCV2及SIV H9亞型多重SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR引物CSFV引物的序列如下上游引物P1 5 ‘ -AAACGGAGGGACTAGCCGT-3 ‘；下游引物P2 5 ‘ -TGCCATGTACAGCAGAGA-3 ‘；PRRSV引物的序列如下上游引物P3:5' -AAACCAGTCCAGAGGCAAG-3 ‘；下游引物P4:5' -CCACAGTGTAACTTATCCTC-3 ‘；PCV2引物的序列如下上游引物P5 5 ‘ -GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3 ‘；
下游引物P6:5' -CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3‘；SIV H9亞型引物的序列如下上游引物P7 5 ‘ -GGAACAACGCTTACCCTG-3 ‘；下游引物P8 5 ‘ -GAGACCATTGACAAGAGGC-3 ‘。所述引物檢測CSFV、PRRSV, PCV2及SIV H9亞型的多重STOR Green I實(shí)時(shí)熒光 PCR檢測方法，包括提取病毒的DNA后，按如下STOR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件對(duì)病毒進(jìn)行檢測，所述STOR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系，在25 μ 1體系中加入
以下成份
SYBR PreMix(5U/uL)16 μL
P1/P3/P5/P70.5+ 0.5+0.5+0.5μ
Ρ2^4/Ρ6/Ρ80.5+0.5+0.5+0.5μ
DNA1+ 1+1+1 μ
ddH201 μL
25 μL所述反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性60s ；進(jìn)入循環(huán)，95°C變性15s ；58°C退火20s ；72°C 延伸20s，40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后先加熱至95°C，然后再降至65°C，開始以0. 5°C /sec遞增至95°C檢測熒光信號(hào)得出擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亞型的特異性引物，通過四重STOR Green I實(shí)時(shí)定量PCR檢測方法，能夠同時(shí)檢測CSFV、PRRSV、 PCV2、SIV H9亞型。利用TM值來區(qū)分不同的核酸片段，核酸片段的TM值主要與GC含量、 序列長度和結(jié)構(gòu)有關(guān)(Ririe K M et al，1997)。CSFV的擴(kuò)增片段基因序列長252bp，其TM 值在89°C左右；PRRSV的擴(kuò)增片段基因序列長208bp，其TM值在86. 5°C左右；PCV2擴(kuò)增片段長171bp，TM值在85°C以下；SIV H9亞型的擴(kuò)增片段為209bp，GC含量相對(duì)最高，TM值達(dá)到92°C以上，CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亞型的TM值可以很好的區(qū)分。在本發(fā)明中，CSFV擴(kuò)增片段的TM值、PCV2擴(kuò)增片段的TM值和PRV擴(kuò)增片段的TM 值會(huì)在一定的溫度范圍變動(dòng)，CSFV的TM值變化范圍為89. 2-89. 5°C,PRRSV的TM值變化范圍為86. 6-86. 8°C, PCV2的TM值變化范圍為84. 5-84. 7°C，SIV H9亞型的TM值變化范圍為92. 2-92. 3°C，4種病毒的TM值相差較大，借此可以利用熔解曲線的4個(gè)特異性的峰對(duì)這 4種病毒進(jìn)行鑒別與診斷。本發(fā)明的敏感性表明，CSFV、PRRSV、PCV2和SIV H9亞型同時(shí)檢出的極限拷貝數(shù)分別為173拷貝/ μ L，196拷貝/ μ L，203拷貝/ μ L，211拷貝/ μ L。本發(fā)明的特異性試驗(yàn)結(jié)果良好，只出現(xiàn)4個(gè)特異性的峰值，重復(fù)性試驗(yàn)具有很好的穩(wěn)定性并且本試驗(yàn)的最大優(yōu)勢在于能夠同時(shí)檢測CSFV、SIV H9亞型、PCV2和PRRSV 4種DNA病毒，有利于妊娠母豬繁殖障礙性病毒的鑒別與診斷。本發(fā)明建立了檢測CSFV、PRRSV、PCV2和SIV H9亞型多重SYBR Green I熒光定量 PCR方法，具有較好的特異性、重復(fù)性和敏感性，為CSFV、PRRSV、PCV2和SIV H9亞型的檢測提供了一種新的方法，可作為規(guī)?；i場CSFV、PRRSV、PCV2和SIV H9亞型的凈化檢測方法，建立無CSFV、I3RRSV、PCV2和SIV H9亞型的豬群，同時(shí)也為CSFV、I3RRSV、PCV2和SIV H9 亞型感染的分子流行病學(xué)調(diào)查，研究CSFV、PRRSV、PCV2和SIV H9亞型分子發(fā)病機(jī)理，CSFV、 PRRSV、PCV2和SIV H9亞型早期診斷，診斷試劑盒的研制與開發(fā)，藥物或疫苗的免疫機(jī)制提供了試驗(yàn)依據(jù)和技術(shù)手段。


圖1是CSFV部分基因質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果，M. DL 2000Marker, 1.陰性對(duì)照，2.目的片段；圖2是PRRSV部分基因質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果，M. DL 2000Marker, 1.陰性對(duì)照，2.目的片段；圖3是PCV2部分基因質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果，M. DL 2000Marker, 1.陰性對(duì)照，2.目的片段；圖4是SIV H9亞型部分基因質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果；圖5是復(fù)合STOR Green I熒光定量PCR反應(yīng)溶解曲線分析；圖6是多重STOR Green I熒光定量PCR反應(yīng)特異性試驗(yàn)熔解曲線分析；圖7是復(fù)合STOR Green I熒光定量PCR反應(yīng)同濃度重復(fù)性試驗(yàn)熔解曲線分析；圖8是不同濃度重復(fù)性試驗(yàn)熔解曲線分析；圖9是不同濃度重復(fù)性試驗(yàn)熔解曲線分析；圖10是不同濃度重復(fù)性試驗(yàn)熔解曲線分析。
具體實(shí)施例方式CSFV、PRRSV、PCV2 及 SIV H9 亞型多重 SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光 PCR 引物CSFV引物的序列如下上游引物P1 5 ‘ -AAACGGAGGGACTAGCCGT-3 ‘；下游引物P2 5 ‘ -TGCCATGTACAGCAGAGA-3 ‘；PRRSV引物的序列如下上游引物P3 5 ‘ -AAACCAGTCCAGAGGCAAG-3 ‘；下游引物P4:5' -CCACAGTGTAACTTATCCTC-3 ‘；PCV2引物的序列如下上游引物P5 5 ‘ -GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3 ‘；下游引物P6 5 ‘ -CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3 ‘；SIV H9亞型引物的序列如下上游引物P7 5 ‘ -GGAACAACGCTTACCCTG-3 ‘；下游引物P8 5 ‘ -GAGACCATTGACAAGAGGC-3 ‘。所述引物檢測CSFV、PRRSV, PCV2及SIV H9亞型的多重STOR Green I實(shí)時(shí)熒光 PCR檢測方法，包括提取病毒的DNA后，按如下STOR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件對(duì)病毒進(jìn)行檢測，所述STOR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系，在25 μ 1體系中加入SYBR PreMix(5U/uL) P1/P3/P5/P7
16 μL
以下成份，
P2/P4/P6/P8
ddH20
0.5+ 0.5+0.5+0.5μΙ> 0.5+0.5+0.5+0.5μ 1+ 1+1+1 μ 1 \iL 25 μL所述反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性60s ；進(jìn)入循環(huán)，95°C變性15s ；58°C退火20s ；72°C 延伸20s，40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后先加熱至95°C，然后再降至65°C，開始以0. 5°C /sec遞增至95°C檢測熒光信號(hào)得出擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線。具體實(shí)驗(yàn)操作如下1材料與方法1. 1 材料1.1.1毒株、菌株P(guān)RV、PPV標(biāo)準(zhǔn)毒株購自中國獸藥監(jiān)察所；CSFV、SIV H9亞型、PRRSV、PCV2購自河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；DH5ci感受態(tài)細(xì)胞購自寶生物工程有限公司。1. 1. 2常用溶液及培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基；氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)貯存液，100mg/mL ；IPTG液，濃度為lOOmg/mL ；X_gal，濃度為20mg/mL，保存于棕色瓶內(nèi)或用鋁箔包裹的瓶內(nèi)，以上溶液均貯存于-20°C備用。1. 1. 3主要儀器及試劑紫外凝膠成像系統(tǒng)購自美國ALPHA INN0TECH公司；Agilent Mx3005P型實(shí)時(shí)定量 PCR擴(kuò)增儀購自美國安捷倫Mratagene公司、PTC-200型PCR儀購自美國MJ公司等。SYBR Premix Ex Taq II,EX TaqDNA 聚合酶、DNA marker DL2000 均購自大連寶生物工程有限公司；Protein K購自華美生物工程公司；T4 DNA連接酶、PGEM-T fesy質(zhì)粒載體均購自!Iomega公司；DNA凝膠回收試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自北京博大泰克生物公司；RNA提取試劑盒購自上海捷瑞生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國MBI公司。1. 2 方法1.2. 1引物的設(shè)計(jì)和合成以 GenBank 公布 PRRSV 0RF7 基因?yàn)閰⒄招蛄?GQ183803)，SIV (EF055887) H9 基因序列，PCV20RF2基因?yàn)閰⒄招蛄?AF027217)，CSFV 5'端保守序列用Primer Premier 6.0 生物軟件分別設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，引物的序列如表1所示。表1熒光PCR引物序列
權(quán)利要求
1.CSFV, PRRSV, PCV2及SIV H9亞型多重SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR引物，其特征在于CSFV引物的序列如下上游引物 P1 5 ‘ -AAACGGAGGGACTAGCCGT-3 ‘； 下游引物 P2 5 ‘ -TGCCATGTACAGCAGAGA-3 ‘； PRRSV引物的序列如下 上游引物 P3 5 ‘ -AAACCAGTCCAGAGGCAAG-3 ‘； 下游引物 P4 5 ‘ -CCACAGTGTAACTTATCCTC-3 ‘； PCV2引物的序列如下上游引物 P5 5 ‘ -GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3 ‘； 下游引物 P6 5 ‘ -CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3 ‘； SIV H9亞型引物的序列如下 上游引物 P7 5 ‘ -GGAACAACGCTTACCCTG-3 ‘； 下游引物 P8 5 ‘ -GAGACCATTGACAAGAGGC-3 ‘。
2.利用權(quán)利要求1所述引物檢測CSFV、PRRSV,PCV2及SIV H9亞型的多重STOR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，包括提取病毒的DNA后，按如下STOR Green I實(shí)時(shí)熒光 PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件對(duì)病毒進(jìn)行檢測，其特征在于所述STOR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系，在25 μ 1體系中加入以下成份 SYBR PreMix(5U/uL)16 μιΡ1/Ρ3/Ρ5/Ρ70.5+0.5+0.5+0.5μ Ρ2^4/Ρ6/Ρ80.5+0.5+0.5+0.5μΕDNA1+ 1+1+1 μLddH201 pL25 μ ,所述反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性60s ；進(jìn)入循環(huán)，95°C變性15s ；58°C退火20s ；72°C延伸 20s,40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后先加熱至95°C，然后再降至65°C，開始以0. 5°C /sec遞增至 95°C檢測熒光信號(hào)得出擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種CSFV、PRRSV、PCV2及SIV H9亞型多重SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR引物及其檢測方法，CSFV引物的序列如下上游引物P15′-AAACGGAGGGACTAGCCGT-3′；下游引物P25′-TGCCATGTACAGCAGAGA-3′；PRRSV引物的序列如下上游引物P35′-AAACCAGTCCAGAGGCAAG-3′；下游引物P45′-CCACAGTGTAACTTATCCTC-3′；PCV2引物的序列如下上游引物P55′-GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3′；下游引物P65′-CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3′；SIV H9亞型引物的序列如下上游引物P75′-GGAACAACGCTTACCCTG-3′；下游引物P85′-GAGACCATTGACAAGAGGC-3′。本發(fā)明分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亞型的特異性引物，通過四重SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)定量PCR檢測方法，能夠同時(shí)檢測CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亞型。有較好的特異性、重復(fù)性和敏感性，為CSFV、PRRSV、PCV2和SIV H9亞型的檢測提供了一種新的方法，可作為規(guī)?；i場CSFV、PRRSV、PCV2和SIVH9亞型的凈化檢測方法，建立無CSFV、PRRSV、PCV2和SIV H9亞型的豬群。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102373298SQ201110221749
公開日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2011年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月4日
發(fā)明者崔保安, 彭新然, 王亞賓, 胡慧, 韓志濤, 魏戰(zhàn)勇 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)