專利名稱：一種抗凋亡高效表達(dá)hVEGF₁₆₅細(xì)胞模型及其建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗凋亡高效表達(dá)hVEGF165細(xì)胞模型及其建立方法。屬于生物醫(yī)學(xué)研究技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
研究表明VEGF的血管生成作用部分是通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中BCL-2的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。VEGF誘導(dǎo)BCL-2的高表達(dá)有助于提高血管內(nèi)皮細(xì)胞在低氧、中毒等條件下的存活 [18]。Xu等的實(shí)驗(yàn)表明BMSCs移植改善心梗后的心功能主要是通過旁分泌一些諸如VEGF等的細(xì)胞因子進(jìn)而上調(diào)心肌細(xì)胞的BCL-2的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)心臟保護(hù)作用的[19]。BCL-2還能抑制由NO誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)血管的形成_]。腫瘤細(xì)胞中BCL-2的過表達(dá)促進(jìn)了 VEGF的表達(dá)及腫瘤的血管生成[21]?？梢娫诙喾N細(xì)胞中VEGF和BCL-2之間存在著互相上調(diào)的級(jí)聯(lián)關(guān)系，生物學(xué)功能上形成協(xié)同作用。BCL-2和VEGF共表達(dá)聯(lián)合應(yīng)用于基因治療上，可能產(chǎn)生較單個(gè)治療基因更為理想的治療效果。腺病毒載體宿主范圍廣、轉(zhuǎn)染效率和基因表達(dá)水平高、安全性較好，是基因治療的優(yōu)良載體，是心肌梗死基因治療較為理想的載體。目前心肌梗死的基因治療或?qū)Ω杉?xì)胞基因修飾后移植治療心肌梗死采用的大多為抗凋亡或促血管生成等單基因的治療方法，少有應(yīng)用雙基因治療的報(bào)道，更罕見應(yīng)用雙基因共表達(dá)載體。目前尚未見同時(shí)應(yīng)用人BCL-2和人VEGF165基因治療心肌梗死或?qū)Ω杉?xì)胞基因修飾后移植治療心肌梗死的報(bào)道。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在骨髓中含量低，它的分離純化問題一直是BMSCs研究中的一個(gè)重要但至今還沒完全解決的問題。目前分離純化BMSCs的方法有2種1)密度梯度離心法，BMSCs與其他細(xì)胞密度不同，根據(jù)沉降作用原理，將其置于某一梯度的介質(zhì)中離心以除去其他細(xì)胞。這種密度梯度離心法可獲得相對(duì)較高純度的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (BMSCs)，但對(duì)細(xì)胞活性的干擾較大。2)表面標(biāo)志物篩選法，根據(jù)細(xì)胞表面的一些特殊表面標(biāo)志物，用各種單克隆抗體進(jìn)行陽性或陰性篩選，因BMSCs無特殊的表面標(biāo)記物，只好采用多種標(biāo)記物聯(lián)合篩選的方法進(jìn)行，目前有流式細(xì)胞儀分選法、免疫溶解法、平面粘附分離法、免疫磁珠分離法。上述方法對(duì)BMSCs的細(xì)胞活性同樣有影響，而且需要用到特殊抗體或者分離液，比較費(fèi)時(shí)且花費(fèi)較多。腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞最重要的一個(gè)步驟是細(xì)胞表面有受體與其結(jié)合，且轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞表面的腺病毒受體密度及數(shù)量密切相關(guān)。而許多細(xì)胞表面上腺病毒受體通常是低水平表達(dá)或者不表達(dá)，包括許多腫瘤細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、纖維細(xì)胞、造血干細(xì)胞。而且腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞有毒性作用，可導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。因此，想讓重組腺病毒能夠表達(dá)所攜帶的基因并提高轉(zhuǎn)染的效率，首先就得選擇合適的腺病毒轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞，而BMSCs往往作為第一選擇，但是普通BMSCs在體外培養(yǎng)壽命較短，不能持續(xù)高效表達(dá)hVEGF165。因此， 如何構(gòu)建一種使BMSCs凋亡比例降低、壽命延長(zhǎng)、持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)、高效表達(dá)hVEGF165的細(xì)胞模型是本發(fā)明的主要任務(wù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的，是為了解決現(xiàn)有技術(shù)BMSCs在體外培養(yǎng)壽命較短，不能持續(xù)高效表達(dá)hVEGF165的問題，提供一種活力良好的抗凋亡高效表達(dá)hVEGF165的細(xì)胞模型。本發(fā)明的第二個(gè)目的，是為了提供一種簡(jiǎn)單方便、經(jīng)濟(jì)有效的抗凋亡高效表達(dá) hVEGF165的細(xì)胞模型的建立方法。本發(fā)明的第一個(gè)目的可以通過以下技術(shù)方案達(dá)到一種抗凋亡高效表達(dá)hVEGF165的細(xì)胞模型，其特征是以純化的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs作為轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以hBCL-2和hVEGF165雙基因共表達(dá)重組腺病毒，將hBCL_2和 hVEGF165雙基因共表達(dá)重組腺病毒轉(zhuǎn)染純化的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs，構(gòu)成抗凋亡且高效表達(dá)hVEGF165的細(xì)胞模型。本發(fā)明的第二個(gè)目的可以通過以下技術(shù)方案達(dá)到一種抗凋亡高效表達(dá)hVEGF165的細(xì)胞模型的建立方法，其特征在于包括以下步驟1)取得純化的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs取大鼠股骨，在無菌條件下剔除肌肉組織，剪去兩端干骺端，抽取含20%胎牛血清 FBS的DMEM培養(yǎng)基，反復(fù)沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞懸液于離心管中進(jìn)行離心后棄去上清，加入 DMEM培養(yǎng)基后放于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶置于35°C 39°C、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；經(jīng)過20-30小時(shí)后部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，棄去上清液，然后每2-3天換液1次，直到細(xì)胞達(dá)到85%-90%融合時(shí)，以1 2或1 3傳代培養(yǎng)，再以DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直到獲得純化的的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs ；2)重組腺病毒轉(zhuǎn)染純化的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs調(diào)整純化的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs的細(xì)胞懸液密度，以5X104/ml密度接種在多孔板上，每孔加入DMEM培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)箱以35°C 39°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)； 經(jīng)過40-50小時(shí)后，吸除舊培養(yǎng)液，再次每孔加入DMEM培養(yǎng)基，按病毒感染復(fù)數(shù)MOI = 0、 10、50、100、200、400分別加入相應(yīng)體積的重組腺病毒液Ad-EGFP-VEGF165-BCL_2 ；對(duì)所述大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染、經(jīng)過20-30小時(shí)后，棄去舊培養(yǎng)液，換為更低含量FBS 的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)對(duì)所述大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染，在此次轉(zhuǎn)染過程中的不同時(shí)間段分別觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白的表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)60-80小時(shí)后，然后消化多孔板細(xì)胞，每孔加入0. 25%胰酶0. 5ml，操作同前；將每孔的細(xì)胞消化后重懸于含0. 5ml的0. OlM PBS的流式細(xì)胞儀專用檢測(cè)管中，用吸管輕輕吹打?yàn)閱蝹€(gè)細(xì)胞懸液，在流式細(xì)胞儀上逐管檢測(cè)綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞的比例，測(cè)得轉(zhuǎn)染效率最高的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs ；3)然后，采用轉(zhuǎn)染效率最高的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs建立的細(xì)胞模型，抗凋亡且高效表達(dá)hVEGF165的細(xì)胞模型。本發(fā)明的第二個(gè)目的還可以通過以下技術(shù)方案達(dá)到步驟1)對(duì)大鼠BMSCs分離純化過程可以為如下所述將大鼠用3%戊巴比妥鈉aiil/kg腹腔注射麻醉后置于75%酒精中浸泡lOmin， 剪去其皮毛；取大鼠股骨，在無菌條件下剔除肌肉組織，剪去兩端干骺端，用IOml注射器抽取含20%胎牛血清FBS的DMEM培養(yǎng)基，反復(fù)沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞懸液于離心管中，以1200rpm/min離心lOmin，棄去上清，加入含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，吹勻后放于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶置于35°C 39°C、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；經(jīng)過24h后，部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，棄去上清液，然后每2-3天換液1次，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到85%-90%融合時(shí)，以1 2或 1 3傳代培養(yǎng)，以10% FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，從而獲得大量純化的BMSCs ；步驟2)重組腺病毒轉(zhuǎn)染BMSCs過程可以如下所述用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀調(diào)整BMSCs細(xì)胞懸液的密度，以5X 104/ml密度接種在6孔板上， 每孔加入1. 5ml含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)箱以35°C 39°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)；經(jīng)過4 后，吸除舊培養(yǎng)液，每孔加入1.5ml的DMEM，按病毒感染復(fù)數(shù)MOI = O、 10、50、100、200、400分別加入相應(yīng)體積的重組腺病毒液Ad-EGFP-VEGF165-BCL_2 (滴度為 5X109pfu/ml)；轉(zhuǎn)染24h后，棄去舊培養(yǎng)液，換為含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液，經(jīng)過24h、48h、 7 分別在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白的表達(dá)，結(jié)果得出7 時(shí)表達(dá)最強(qiáng)；繼續(xù)培養(yǎng)72h，然后消化6孔板細(xì)胞，每孔加入0. 25%胰酶0. 5ml，操作同前；將每孔的細(xì)胞消化后重懸于含0. 5ml的0. OlM PBS的流式細(xì)胞儀專用檢測(cè)管中，用吸管輕輕吹打?yàn)閱蝹€(gè)細(xì)胞懸液，在流式細(xì)胞儀上逐管檢測(cè)綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞的比例，從而測(cè)得MOI = 400時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高；然后，采用MOI = 400轉(zhuǎn)染72h的BMSCs建立細(xì)胞模型。步驟1)步中所述大鼠可以為SD大鼠，重100_150g。步驟1)步中所述細(xì)胞培養(yǎng)瓶可以為2個(gè)T-25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶。步驟2~)步中所述觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白的表達(dá)可以通過普通光鏡或熒光顯微鏡觀察。本發(fā)明所述抗凋亡且高效表達(dá)hVEGF165細(xì)胞模型的用途，1)用于治療心肌梗死等疾病；2)用于移植至受體器官。本發(fā)明具有如下突出的有益效果1、本發(fā)明篩選出BMSCs作為hBCL_2和hVEGF165雙基因共表達(dá)重組腺病毒理想的轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞，測(cè)定出轉(zhuǎn)染重組腺病毒后BMSCs高效分泌hVEGF165并且在模擬血清剝奪環(huán)境下轉(zhuǎn)染后的BMSCs凋亡比例降低；解決了 hBCL-2和hVEGF165雙基因共表達(dá)重組腺病毒不易轉(zhuǎn)染細(xì)胞及在目標(biāo)細(xì)胞里面表達(dá)的問題，也解決了普通BMSCs移植到缺氧心臟后壽命較短，不能持續(xù)高效表達(dá)hVEGF165的問題；本細(xì)胞模型將在干細(xì)胞移植治療心肌梗死領(lǐng)域開辟新的道路，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。2、本發(fā)明通過改良的分離純化可以快速大量獲得活力良好的BMSCs，轉(zhuǎn)染效率達(dá) 70 %，為臨床上BMSCs細(xì)胞移植治療心肌梗死等疾病提供便利。3、本發(fā)明轉(zhuǎn)染重組腺病毒BMSCs較普通BMSCs的細(xì)胞凋亡比例有明顯減少，壽命延長(zhǎng)，能夠高效表達(dá)hVEGF165，有利于將該細(xì)胞模型移植至受體器官，并且可以提高治療疾病的效果，具有廣泛的應(yīng)用前景。


圖1A-1C為原代培養(yǎng)的大鼠BMSCs圖。圖1D-1F為傳代培養(yǎng)的大鼠BMSCs圖。圖2A-2H為BMSCs細(xì)胞表面標(biāo)記物流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果示意圖。圖3A、3C、3E為轉(zhuǎn)染重組腺病毒后的BMSCs的普通光鏡Mh、48h、7ai變化圖。
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圖;3B、3D、3F為轉(zhuǎn)染重組腺病毒后的BMSCs的熒光顯微鏡變化圖。圖4A-4F為流式細(xì)胞儀測(cè)定重組腺病毒轉(zhuǎn)染BMSCs效率示意圖。圖5為VEGF165分泌水平示意圖。圖6A-6C為BMSCs凋亡檢測(cè)流式細(xì)胞儀散點(diǎn)示意圖。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施例1 本實(shí)施例涉及的抗凋亡且高效表達(dá)hVEGF165的細(xì)胞模型，以純化的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs作為轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以hBCL-2和hVEGF165雙基因共表達(dá)重組腺病毒，將hBCL_2 和hVEGF165雙基因共表達(dá)重組腺病毒轉(zhuǎn)染純化的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs，構(gòu)成抗凋亡且高效表達(dá)hVEGF165的細(xì)胞模型。本實(shí)施例的建立方法以及檢測(cè)過程包括以下步驟1)取得純化的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs ；2)重組腺病毒轉(zhuǎn)染純化的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs ；3)然后，采用轉(zhuǎn)染效率最高的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs建立的細(xì)胞模型，抗凋亡且高效表達(dá)hVEGF165 的細(xì)胞模型。具體操作方法如下一、對(duì)大鼠BMSCs分離純化1、大鼠BMSCs的分離1)取100_150g的雄性SD大鼠，3 %戊巴比妥鈉^il/Kg腹腔注射麻醉，將其置于 75%酒精中浸泡10分鐘，繼而將老鼠放在一個(gè)消毒過的塑料盆中。2)戴無菌手套，剪開SD大鼠下肢皮膚，完全暴露下肢肌肉，鈍性分離肌肉組織，顯露股骨和脛骨，從股骨和脛骨連接處小心進(jìn)行分離，完整取出股骨；同法取出脛骨，然后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)，放于含無菌0. OlM胎牛血清FBS的培養(yǎng)皿中。3)將分離的SD大鼠股骨和脛骨置于裝有IOml無菌胎牛血清FBS培養(yǎng)皿中，換新的無菌手套，換用超凈臺(tái)里面的無菌鑷子及剪刀，剔除脂肪及肌肉組織，露出骨髓端。然后放到另外一個(gè)含無菌胎牛血清FBS的培養(yǎng)皿中去除骨頭外面的血液及附著的肌肉，用無菌胎牛血清FBS反復(fù)沖洗三遍，直至骨頭外面無血液及肌肉殘留。4)用大剪刀剪去骨頭兩端的軟骨，止血鉗夾住骨頭，用IOml注射器抽取含20%胎牛血清FBS的H-DMEM培養(yǎng)基5ml，將針頭插入骨髓腔內(nèi)反復(fù)沖洗，可見骨髓液從軟骨端呈云霧狀流出，待骨髓腔變白時(shí)可停止沖洗，同法獲取其余骨頭的骨髓。5)收集骨髓懸液于15ml離心管中，1200rpm室溫離心lOmin，棄上清，用8ml含 20%胎牛血清FBS新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至2個(gè)T-25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。2、大鼠BMSCs的原代培養(yǎng)將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37°C、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，剛接種時(shí)骨髓中體積較大的單個(gè)核細(xì)胞呈球形，懸浮于培養(yǎng)液中，8-10h開始逐漸沉降貼壁；24h后棄去未貼壁細(xì)胞，更換培養(yǎng)液，用含10 %胎牛血清FBS的H-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，可見細(xì)胞基本貼壁，但細(xì)胞數(shù)量較少，細(xì)胞呈長(zhǎng)條形或多角形，如圖IA所示；以后每2-3天換液1次，培養(yǎng)至第3天可見細(xì)胞多逐漸變成長(zhǎng)梭形，如圖IB所示；之后細(xì)胞快速增殖，細(xì)胞核居中，偶有雙核，至接種后第6天細(xì)胞形成集落，形似短棒狀或纖維樣，呈平行或旋渦狀排列，如圖IC所示；貼壁細(xì)胞接近80% -90%融合后，結(jié)束原代培養(yǎng)。3.大鼠BMSCs傳代擴(kuò)增培養(yǎng)1)細(xì)胞融合至80%-90%時(shí)，棄去舊培養(yǎng)液，加入2ml滅菌0. OlM的胎牛血清FBS 溶液，輕輕晃動(dòng)，洗滌細(xì)胞生長(zhǎng)面，然后棄去PBS溶液。幻加入Iml 0.25%胰酶，置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待鏡下細(xì)胞之間突起消失、變圓后，棄去胰酶；加入含10%胎牛血清FBS的H-DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基6ml終止消化，用吸管輕柔吹打成單細(xì)胞懸液。3)按1 2傳代分至2個(gè)新的T-25cm2培養(yǎng)瓶，置于37°C ,5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，此時(shí)記為Pl (第1代)，以后每3-4天細(xì)胞傳代一次。傳代培養(yǎng)3-4h開始貼壁，6-8h 貼壁完全，至P1、P2、P3以備實(shí)驗(yàn)用時(shí)細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化，但生長(zhǎng)更為迅速，同樣時(shí)間內(nèi)更快長(zhǎng)滿瓶底，均勻有序地以成纖維細(xì)胞樣分布特征，如圖1D-1F所示。4.大鼠BMSCs的鑒定1)P3細(xì)胞融合至90%左右，用0. 25%胰酶消化細(xì)胞，具體步驟同上。2)收集細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)后，調(diào)整每個(gè)檢測(cè)樣本的細(xì)胞數(shù)為5X105。3) 1200rpm室溫離心5分鐘，棄上清。4)滅菌胎牛血清FBS洗滌2遍并于相同條件下離心，棄上清，于待檢測(cè)的樣本中各加入IOOul滅菌1 X胎牛血清FBS溶液，輕輕混勻，分別加入⑶四、⑶34、⑶44、⑶45、⑶90 一抗及同型陰性對(duì)照各10ul。5)37°C避光孵育15分鐘，每管加入胎牛血清FBS溶液Iml后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 檢測(cè)結(jié)果如圖2A-2H所示。二、重組腺病毒轉(zhuǎn)染BMSCs1、重組腺病毒轉(zhuǎn)染BMSCs效率的測(cè)定1)用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀調(diào)整消化后細(xì)胞懸液的密度，以5 X IOVml密度接種在6孔板，每孔加入1. 5ml含10%胎牛血清FBS DMEM在細(xì)胞培養(yǎng)箱以5% CO2, 37°C條件下培養(yǎng)。2)培養(yǎng)24h后吸除舊培養(yǎng)液，每孔仍加入1. 5ml含10%胎牛血清FBS的DMEM培
養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3)24h后，吸除舊培養(yǎng)液，每孔加入1. 5ml DMEM培養(yǎng)基。為獲得最佳的病毒感染復(fù)數(shù)(multiplicity ofinfection，MOI)，按 MOI = O、10、50、100、200、400 分別加入相應(yīng)體積的重組 Ad-EGFP-VEGF165-BCL-2 (滴度為 5X K^pfu/mL)病毒液。4)轉(zhuǎn)染24h后棄去舊培養(yǎng)液，換為含2%胎牛血清FBS的DMEM培養(yǎng)基，經(jīng)過Mh、 48h,72h分別觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明在72h時(shí)達(dá)到最強(qiáng)，其后不再增加， 如圖3A-3F所示。5)繼續(xù)培養(yǎng)72h，然后消化6孔板細(xì)胞，每孔加入0. 25%胰酶0. 5ml，操作同前；將每個(gè)孔的細(xì)胞消化后重懸于含0. 5ml 0.01M PBS的流式細(xì)胞儀專用檢測(cè)管中，用吸管輕輕吹打?yàn)閱蝹€(gè)細(xì)胞懸液。6)在流式細(xì)胞儀上逐管檢測(cè)檢綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞的比例，測(cè)得其轉(zhuǎn)染效率在 8. 08% 70. 65%之間，可知最佳MOI = 400，如圖4A-4F所示。三、ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染后BMSCs培養(yǎng)上清中VEGF165的含量1、BMSCs培養(yǎng)上清液的收集
1)消化細(xì)胞接種于6孔板，并用病毒液轉(zhuǎn)染BMSCs。2)分為3組第1組為正常BMSCs組；第2組為轉(zhuǎn)染Ad-EGFP的BMSCs組；第3組為轉(zhuǎn)染 Ad-EGFP-VEGF165-BCL-2 的 BMSCs 組。在轉(zhuǎn)染病毒后第 1、3、5、7、9、11、13、15、17 天收集培養(yǎng)孔的細(xì)胞上清液，每次收集完上清液后，每孔再重新加入1. 5ml新鮮的DMEM培養(yǎng)基。 直至第15天。收集后的上清液以3000rpm/min，4°C離心20min，然后放于_20°C冰箱保存。 待收集完所有時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞上清液后，將各個(gè)標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。2. ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中VEGF165濃度1)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第1、第2孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品lOOul，然后在第1、第2孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；然后從第1、第2孔中各取IOOul分別加到第3孔和第4孔，再在第3、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻 ’然后在第3孔和第4孔中先各取50ul棄掉，再各取50ul分別加入到第5、第6孔中，再在第5、 第6孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第5、第6孔中各取50ul分別加到第 7、第8孔中，再在第7、第8孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻后從第7、第8孔中分別取50ul加到第9、第10孔中，再在第9第10孔分別加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻后從第9 第10孔各取50ul棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50ul，濃度分別為600pg/ml，400pg/ml， 200pg/ml,100pg/ml，50pg/ml)。2)加樣分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、 待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40ul，然后再加待測(cè)樣品 IOul (樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。3)溫育用封板膜封板后置于37°C溫育30分鐘。4)配液將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。5)洗滌小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。6)加酶每孔加入酶標(biāo)試劑50ul，空白孔除外。7)溫育操作同3)步。8)洗滌操作同5)步。9)顯色每孔先加入顯色劑A50ul，再加入顯色劑B50ul，輕輕振蕩混勻，37°C避光顯色15分鐘。10)終止每孔加終止液50ul，終止反應(yīng)。11)測(cè)定以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(0D值)。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。12)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，SPSS10. 0軟件擬合二次方程，將樣品OD值轉(zhuǎn)換為濃度。轉(zhuǎn)染重組腺病毒后BMSCs的VEGF165分泌水平(pg/ml)如圖5所示，除了 ld、3d、 7d及l(fā)ld，轉(zhuǎn)染Ad-EGFP-VEGF165-BCL-2腺病毒的BMSCs上清中VEGF165的分泌水平與正常 BMSCs組相比，均顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；除了 Id及3d，其余時(shí)間點(diǎn)與轉(zhuǎn)染Ad-EGFP的BMSCs組相比，VEGF165的分泌水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P < 0. 05)；正常組與轉(zhuǎn)染Ad-EGFP組VEGF165的分泌水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0. 05)。隨著時(shí)間的推移，轉(zhuǎn)染 Ad-EGFP-VEGF165-BCL-2腺病毒組VEGF165分泌量逐漸增加，至13d達(dá)到高峰(924. 3士56. 5)pg/ml, η = 3。此后，VEGF165分泌逐漸下降，但仍保持在一個(gè)可檢測(cè)水平之上，并持續(xù)至 17d(4682 士83. 3) pg/ml 以后。轉(zhuǎn)染 Ad-EGFP 的 BMSCs 組(494. 6 士 114. 8) pg/ml 及正常 BMSCs 組(592. 0士 135. 8)pg/ml都于Ild達(dá)到分泌峰值。四、轉(zhuǎn)染重組腺病毒后BMSCs在模擬血清剝奪環(huán)境下凋亡檢測(cè)1、用Annexin V-PE/7-AAD檢測(cè)盒對(duì)細(xì)胞凋亡檢測(cè)1)消化細(xì)胞接種于6孔板，并用病毒液轉(zhuǎn)染BMSCs。2)分為3組第1組為正常BMSCs組；第2組為轉(zhuǎn)染Ad-EGFP的BMSCs組；第3組為轉(zhuǎn)染 Ad-EGFP-VEGF165-BCL-2 的 BMSCs 組。3)在轉(zhuǎn)染病毒24h后，各個(gè)組的細(xì)胞用0. OlMPBS漂洗2次，以去除殘留的培養(yǎng)基， 加入不含F(xiàn)BS的H-DMEM培養(yǎng)基，以無血清環(huán)境下培養(yǎng)6天。4)吸除培養(yǎng)孔里面的舊培養(yǎng)液，每個(gè)孔用0. OlM的胎牛血清FBS漂洗一遍。5)每孔加入0. 25%胰酶消化細(xì)胞lmin，加樣槍輕輕吸除胰酶。6)每孔加入Iml胎牛血清FBS溶液，用吸管吹打孔里面的貼壁細(xì)胞，然后將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管。7) 1200rpm/min，4°C離心 5min。8)加入IOOul IXBinding Buffer，用吸管輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，然后轉(zhuǎn)移到流式細(xì)胞儀專用檢測(cè)管。9)每個(gè)檢測(cè)管依次加入 5ul Annexin V-PE 及 5ul 7-AAD。10)輕輕振蕩檢測(cè)管，室溫下避光反應(yīng)15min。11)每個(gè)管再加入400ul IXBinding Buffer，輕輕振蕩混勻。12)在Ih內(nèi)于流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。如圖6A-6C所示，分別為第1組、第2組和第3組BMSCs凋亡檢測(cè)流式細(xì)胞儀散點(diǎn)圖，左下象限顯示活細(xì)胞，為(PE-/AAD-)；右上象限是非活細(xì)胞，即壞死及晚期凋亡細(xì)胞， 為(PE+/AAD+)；而右下象限為早期凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)(PE+/AAD-)，可以看到第3組細(xì)胞左下象限細(xì)胞數(shù)少，凋亡細(xì)胞比例低，而第1組及第2組細(xì)胞左下象限凋亡細(xì)胞比例較高。第3組細(xì)胞的凋亡率(3. 43士 1.61% )明顯比第2組(9. 92士5. 99% )及第1組 (10. 51 士4. 54% )低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(ρ < 0. 05)。而第1組與第2組的凋亡率差異則沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0. 05)。凋亡檢測(cè)的結(jié)果證明轉(zhuǎn)染重組腺病毒后BMSCs表達(dá)BCL-2蛋白增加，可以抑制細(xì)胞的凋亡，降低凋亡細(xì)胞比例，具有實(shí)際的生物學(xué)效應(yīng)。如下表1所示。
權(quán)利要求
1.一種抗凋亡高效表達(dá)hVEGF165的細(xì)胞模型，其特征在于以純化的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs作為轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以hBCL-2和hVEGF165雙基因共表達(dá)重組腺病毒，將hBCL_2和 hVEGF165雙基因共表達(dá)重組腺病毒轉(zhuǎn)染純化的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs，構(gòu)成抗凋亡且高效表達(dá)hVEGF165的細(xì)胞模型。
2.如權(quán)利要求1所述的一種抗凋亡高效表達(dá)hVEGF165的細(xì)胞模型的建立方法，其特征在于包括以下步驟1)取得純化的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs取大鼠股骨，在無菌條件下剔除肌肉組織，剪去兩端干骺端，抽取含20%胎牛血清FBS 的DMEM培養(yǎng)基，反復(fù)沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞懸液于離心管中進(jìn)行離心后棄去上清，加入 DMEM培養(yǎng)基后放于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶置于35°C 39°C、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；經(jīng)過20-30小時(shí)后部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，棄去上清液，然后每2-3天換液1次，直到細(xì)胞達(dá)到85%-90%融合時(shí)，以1 2或1 3傳代培養(yǎng)，再以DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直到獲得純化的的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs ；2)重組腺病毒轉(zhuǎn)染純化的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs調(diào)整純化的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs的細(xì)胞懸液密度，以5X104/ml密度接種在多孔板上，每孔加入DMEM培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)箱以35°C 39°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)；經(jīng)過40-50小時(shí)后，吸除舊培養(yǎng)液，再次每孔加入DMEM培養(yǎng)基，按病毒感染復(fù)數(shù)MOI = 0、10、 50、100、200、400分別加入相應(yīng)體積的重組腺病毒液Ad-EGFP-VEGF165-BCL_2 ；對(duì)所述大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染、經(jīng)過20-30小時(shí)后，棄去舊培養(yǎng)液，換為更低含量FBS 的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)對(duì)所述大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染，在此次轉(zhuǎn)染過程中的不同時(shí)間段分別觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白的表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)60-80小時(shí)后，然后消化多孔板細(xì)胞，每孔加入0. 25%胰酶0. 5ml，操作同前；將每孔的細(xì)胞消化后重懸于含0. 5ml的0. OlM PBS的流式細(xì)胞儀專用檢測(cè)管中，用吸管輕輕吹打?yàn)閱蝹€(gè)細(xì)胞懸液，在流式細(xì)胞儀上逐管檢測(cè)綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞的比例，測(cè)得轉(zhuǎn)染效率最高的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs ；3)然后，采用轉(zhuǎn)染效率最高的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs建立的細(xì)胞模型，抗凋亡且高效表達(dá)hVEGF165的細(xì)胞模型。
3.如權(quán)利要求2所述的一種抗凋亡高效表達(dá)hVEGF165的細(xì)胞模型的建立方法，其特征在于步驟1)中，在將取大鼠股骨前，先將大鼠用3%戊巴比妥鈉aiil/kg腹腔注射麻醉后置于75%酒精中浸泡lOmin，剪去其皮毛；所用沖洗骨髓腔的DMEM培養(yǎng)基為含20%胎牛血清FBS的DMEM培養(yǎng)基；用于培養(yǎng)細(xì)胞的的DMEM培養(yǎng)基為含10%胎牛血清FBS的DMEM培養(yǎng)基。
4.如權(quán)利要求2所述的一種抗凋亡高效表達(dá)hVEGF165的細(xì)胞模型的建立方法，其特征在于步驟1)中，用于第一次培養(yǎng)細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)基為含10%胎牛血清FBS的DMEM培養(yǎng)基，用于第二次培養(yǎng)細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)基為含2%胎牛血清FBS的DMEM培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種抗凋亡且高效表達(dá)hVEGF165細(xì)胞模型的建立方法，其特征在于1)步中所述的大鼠為SD大鼠，重100-150g。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種抗凋亡高效表達(dá)hVEGF165細(xì)胞模型的建立方法，其特征在于1)步中所述的細(xì)胞培養(yǎng)瓶為二個(gè)T-25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種抗凋亡高效表達(dá)hVEGF165細(xì)胞模型的建立方法，其特征在于 步中所述的觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白的表達(dá)通過普通光鏡或熒光顯微鏡觀察。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗凋亡高效表達(dá)hVEGF165細(xì)胞模型及其建立方法，該細(xì)胞模型以BMSCs作為轉(zhuǎn)染細(xì)胞，與hBCL-2和hVEGF165雙基因共表達(dá)重組腺病毒。其建立方法包括以下步驟1)對(duì)大鼠BMSCs分離純化，從而獲得大量純化活力良好的BMSCs；2)重組腺病毒轉(zhuǎn)染BMSCs，采用病毒感染復(fù)數(shù)MOI＝400轉(zhuǎn)染72h的BMSCs建立細(xì)胞模型。其用途特征是1)用于治療心肌梗死等疾??；2)用于移植至受體器官。本發(fā)明轉(zhuǎn)染重組腺病毒BMSCs較普通BMSCs的細(xì)胞凋亡比例有明顯減少，壽命延長(zhǎng)，能夠高效表達(dá)hVEGF165，有利于將該細(xì)胞模型移植至受體器官，并且可以提高治療疾病的效果，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N7/01GK102329777SQ201110206260
公開日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月22日
發(fā)明者何曉青, 倪曉彬, 劉世明, 林育輝, 羅承鋒, 陳敏生 申請(qǐng)人:廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院