專利名稱：家蠅對(duì)擬除蟲菊酯類殺蟲劑靶標(biāo)抗性的分子檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及家蠅對(duì)擬除蟲菊酯類靶標(biāo)抗性的分子檢測技術(shù)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，適合用于家蠅對(duì)擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性的快速檢測。
背景技術(shù)：
家蠅(Musca domestica)是一種重要的疾病傳媒,據(jù)報(bào)道它可以傳播100多種人畜疾病。家蠅也是重要的畜牧業(yè)害蟲，家蠅的發(fā)生可以導(dǎo)致畜禽產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的降低。因此家蠅種群的控制對(duì)于人類的健康和國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展都具有十分重要的意義。家蠅的防治長期以來主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，抗藥性問題突出?？顾幮詫?dǎo)致殺蟲劑殺蟲效率的下降，由此引發(fā)諸如殺蟲劑使用次數(shù)和劑量增加，蟲媒人畜疾病的流行等問題已給人類帶來巨大損失。擬除蟲菊酯殺蟲劑(如溴氰菊酯)已廣泛用于家蠅的防治，家蠅對(duì)這類殺蟲劑普 遍產(chǎn)生了抗性?？顾幮缘臋z測是科學(xué)制定有效的防治措施的前提，對(duì)減少化學(xué)藥劑對(duì)環(huán)境的污染和合理制定抗藥性治理具有重要的指導(dǎo)意義。家蠅對(duì)擬除蟲菊酯類的抗性的檢測常采用生物測定，這種方法存在如下缺點(diǎn)(I)試驗(yàn)周期長一般需要24小時(shí)以上才能得到生測結(jié)果；(2)對(duì)試蟲的數(shù)量和質(zhì)量要求高為保證生測結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要使用特定生理狀態(tài)的試蟲；(3)難于檢測早期抗性和預(yù)測抗性的發(fā)展趨勢生物測定的方法只能記錄殺蟲劑劑量和試蟲死亡率的信息，而無法測定個(gè)體的基因型。近年來，隨著對(duì)家蠅抗藥性抗性分子機(jī)制的了解，國內(nèi)外開始嘗試家蠅抗性的分子檢測技術(shù)的研究。經(jīng)過多年的研究發(fā)現(xiàn)，家蠅對(duì)擬除蟲菊酯類抗性的主要機(jī)制之一是鈉離子通道基因的點(diǎn)突變導(dǎo)致家蠅對(duì)農(nóng)藥的敏感性下降(即靶標(biāo)不敏感性)。靶標(biāo)不敏感主要是鈉離子通道蛋白在1014位點(diǎn)的氨基酸變異(亮氨酸L變?yōu)楸奖彼酕或組氨酸H，稱為擊倒抗性)以及918位點(diǎn)上的蛋氨酸(M)替換為蘇氨酸(T)。918位點(diǎn)的抗性突變只見于存在1014F抗性突變的個(gè)體，這兩抗性位點(diǎn)的突變組合稱為超擊倒抗性。至今，在國內(nèi)外只建立了基于PCR的L1014F抗性突變的檢測方法，而我們的研究發(fā)現(xiàn)，在我國，L1014H變異的頻率更高，而且在高抗性家蠅品系中還存在M918T這一抗性相關(guān)的遺傳變異。(Qiu X，Li M, Luo H, Fu T. 2007 Molecular analysis of resistancein a deltamethrin—resistant str ain of Musca domestica from China. PesticideBiochemistry and Physiolog y 89(2) :146-150)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是根據(jù)我們對(duì)我國各地家蠅抗藥性機(jī)制的了解，提出了家蠅抗藥性的分子檢測方法，包括L1014F，L1014H, M918T三個(gè)抗性突變的檢測方法。因此，本發(fā)明的目的是根據(jù)對(duì)我國各地家蠅抗藥性機(jī)制的了解，建立可用于檢測家蠅對(duì)擬除蟲菊酯類靶標(biāo)抗性的分子檢測方法。本發(fā)明的一方面涉及一種家蠅對(duì)擬除蟲菊酯類殺蟲劑靶標(biāo)抗性的分子檢測方法，該方法包含下列步驟
(I)提取單頭家蠅基因組DNA ；(2)對(duì)家蠅鈉離子通道基因1014位點(diǎn)抗性相關(guān)變異進(jìn)行分子檢測；(3)對(duì)家蠅鈉離子通道基因918位點(diǎn)抗性相關(guān)變異進(jìn)行分子檢測。其中，所述家蠅鈉離子通道基因序列選自SEQ ID NO :10(鈉離子通道基因1014L)、11(鈉離子通道基因1014F)、12(鈉離子通道基因1014H)、13 (鈉離子通道基因918M)、14(GenBank登錄號(hào)為EF592581，鈉離子通道基因918T)所示。其中，1014的位點(diǎn)抗性相關(guān)變異為L1014F或L1014H，918位點(diǎn)抗性相關(guān)變異為M918T，可以使用PCR方法對(duì)家蠅鈉離子通道基因編碼的1014氨基酸位點(diǎn)和918氨基酸位點(diǎn)抗性相關(guān)的變異進(jìn)行分子檢測。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，對(duì)家蠅鈉離子通道基因1014位點(diǎn)抗性相關(guān)變異的PCR檢測使用下列5種PCR引物
PF :正向通用外引物，序列為 5’ -CAT GAT TGT GTT CCG AGT GC-3，(SEQ ID NO:
1);PR:反向通用外引物，序列為 5’ -CGA AGT TGG ACA AAA GCA AA-3’ (SEQ ID NO:
2)PL : 1014L 敏感基因特異性引物，序列為 5 ’ -TGG CCA CGT CAA CTTACC ACGAG-3’ (SEQ ID NO 3)PF 1014F抗性基因型特異性引物，序列為5’ -CCA CGG TCG TGA TCG GCAGTT-3’ (SEQ ID NO 4)PH :1014H抗性基因型特異性引物，序列為5’ -CAC GGT CGT GA TCGG CAA TCAT-3，(SEQ ID NO 5)其中，對(duì)每個(gè)個(gè)體設(shè)置3個(gè)PCR反應(yīng)，分別使用三種不同的引物混合物，即Al (PF+PR+PL, 1:1:3 混合)，A2 (PF+PR+PF, 1:1:3 混合)，A3 (PF+PR+PH, 1:1:3混合)。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4°C 3min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s，35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，對(duì)家蠅鈉離子通道基因918位點(diǎn)抗性相關(guān)變異的PCR檢測使用下列4種PCR引物SI :5，-TCA ACA CCA ACA CCA TTA CAT AT-3，(SEQ ID NO 6)S2 :5，-CGT GAT GGG AAT GCA ACT TTT CGG A_3，(SEQ ID NO 7)S3 :5’ -CAC TGA ATT TAC TCA TTT CGA TGA T-3’ (SEQ ID NO 8)S4 :5，-CCC ATT GTC CGG CCC G_3’ (SEQ ID NO :9)其中，PCR 反應(yīng)中引物 S1、S2、
S3和 S4 的混合比例為 I : I : 3 : 3。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4°C 3min ；94V 30s, 50°C 30s,72°C 30s，30 個(gè)循環(huán)；72V IOmin0本發(fā)明的另一方面涉及上述方法在家蠅抗藥性檢測中的應(yīng)用。本發(fā)明的第三方面涉及一種用于家蠅對(duì)擬除蟲菊酯類殺蟲劑靶標(biāo)抗性檢測的試劑盒，包括(I)用于提取單頭家蠅基因組DNA的試劑；(2)用于對(duì)家蠅鈉離子通道基因1014位點(diǎn)抗性相關(guān)變異進(jìn)行分子檢測的試劑；(3)用于對(duì)家蠅鈉離子通道基因918位點(diǎn)抗性相關(guān)變異進(jìn)行分子檢測的試劑。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，用于對(duì)家蠅鈉離子通道基因1014位點(diǎn)抗性相關(guān)變異進(jìn)行分子檢測的試劑包括下列5種PCR引物
PF :正向通用外引物，序列為 5’ -CAT GAT TGT GTT CCG AGT GC-3，(SEQ ID NO:
1);PR:反向通用外引物，序列為 5’ -CGA AGT TGG ACA AAA GCA AA-3’ (SEQ ID NO:
2)PL : 1014L 敏感基因特異性引物，序列為 5 ’ -TGG CCA CGT CAA CTTACC ACGAG-3’ (SEQ ID NO 3)PF 1014F抗性基因型特異性引物，序列為5’ -CCA CGG TCG TGA TCG GCAGTT-3’ (SEQ ID NO 4)PH :1014H抗性基因型特異性引物，序列為5’ -CAC GGT CGT GA TCGG CAA TCA T-3，(SEQ ID NO 5)在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，用于對(duì)家蠅鈉離子通道基因918位點(diǎn)抗性相關(guān)變異進(jìn)行分子檢測的試劑包括下列4種PCR引物SI :5，-TCA ACA CCA ACA CCA TTA CAT AT-3，(SEQ ID NO 6)S2 :5，-CGT GAT GGG AAT GCA ACT TTT CGG A_3，(SEQ ID NO 7)S3 :5，-CAC TGA ATT TAC TCA TTT CGA TGA T-3，(SEQ ID NO 8)S4 :5，-CCC ATT GTC CGG CCC G_3，(SEQ ID NO 9)本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)有如下優(yōu)點(diǎn)I.本發(fā)明建立的抗性分子檢測技術(shù)與傳統(tǒng)生物測定相比具有如下優(yōu)點(diǎn)(I)需要生物材料少，數(shù)量在50-200頭就可以滿足檢測要求；(2)對(duì)材料的要求低可以采用任何蟲態(tài)的試蟲，可以用活體，也可以用保存的樣品，可以用整頭家蠅，也可以用蟲體的某一部位(如雙翅)；(3)可以區(qū)分種群的雜/純合狀態(tài)有利預(yù)測種群抗性基因頻率的變化趨勢，便于抗性的早期診斷；(4)快速從DNA的提取到PCR產(chǎn)物的檢測，數(shù)小時(shí)就可以完成。2.本發(fā)明與其它文獻(xiàn)報(bào)道的用于家蠅靶標(biāo)抗性檢測的分子檢測法方法(李春曉等特異性等位基因PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測家蠅擊倒抗性相關(guān)鈉通道的基因突變。中國媒介生物學(xué)及控制雜志(2007)，18 (3) =255-256)相比，具有(I)覆蓋面廣不僅可以檢測1014F,還可以檢測1014H這一在我國自然種群家蠅中普遍存在的抗性基因型；(2)提供了 M918T抗性突變的快速檢測方法用I個(gè)PCR反應(yīng)就可以區(qū)分抗性與敏感基因型，而且M918T抗性突變意味著更高的抗性水平，該方法可以用于家蠅超擊倒抗性的早期預(yù)警。


以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中圖IA-F為家蠅鈉離子通道基因1014位點(diǎn)基因型檢測結(jié)果。其中，M代表DNA分子量標(biāo)記(50bp DNA ladder，天根公司)；A1 :反應(yīng)所用引物為PF+PR+PL，按I : I : 3混合；A2 :反應(yīng)所用引物為PF+PR+PF，按I : I : 3混合；A3 :反應(yīng)所用引物為PF+PR+PH，按1:1: 3混合。其中圖IA為1014L/L基因型電泳圖；圖IB為1014L/F基因型電泳圖；圖IC為1014F/F基因型電泳圖；圖ID為1014L/H基因型電泳圖；圖IE為1014F/H基因型電泳圖；圖IF為1014H/H基因型電泳圖。圖2為家蠅鈉離子通道基因918位點(diǎn)基因型檢測結(jié)果。其中，M代表分子量標(biāo)記(50bp DNA ladder，天根公司)；RR :抗性純合子；RS :雜合子；SS :敏感純合子;B1_B5 :北京樣品檢測，顯示全部敏感純合。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I單頭家蠅基因組DNA的提取方法(參考 Rinkevich FD et al. Frequencies of the pyrethroid resistancealleles of Vsscland CYP6Dlin house flies from the eastern United Strtes. InsectMolecular Biology (2006)，15 (2)，157-167)本發(fā)明所使用的家蠅株系來源如下所使用的家蠅RR(實(shí)驗(yàn)室抗性BJD品系，基因型為918T純合)，RS (實(shí)驗(yàn)室抗性與敏感品系的雜交Fl代，基因型為918M/T雜合)，
SS (實(shí)驗(yàn)室敏感品系，基因型為918M純合)，B1-B5,L/L，L/F，F(xiàn)/F，L/H，F(xiàn)/H，H/H基因型家蠅采自北京奧運(yùn)村垃圾站以上品系家蠅均可得自中國科學(xué)院動(dòng)物研究所(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院-5號(hào))。(I)取單頭家蠅(去腹部)置于I. 5ml體積的離心管(印pendorf管)中，加入
0.5ml裂解緩沖液，碾磨將蟲體搗碎，置60°C溫浴，20分鐘后取出；(2)加75 μ I的8Μ醋酸鉀，混勻，置冰上10分鐘；(3) 14000g離心5min，取400 μ I上清液(避免取到沉淀)轉(zhuǎn)至新的離心管；(4)加入800 μ I (上清液的2倍體積)100%冰冷乙醇，室溫放置IOmin ；(5)離心10分鐘，棄上清，沉淀用0. 5ml 70%乙醇清洗；(6)離心5分鐘,沉淀干燥后,加入50 μ I水重溶。制備的DNA樣品可直接用于后續(xù)的PCR，也可以將樣品保存在4°C下備用，或在-20°C條件下長期保存。以上方法中使用的試劑配制方法如下(I)溶液A :含 IOOmM Tris HCl pH 8. O, IOmM EDTA, 50mM NaCl (高壓滅菌，室溫保存)；(2)0. 15M 精胺(spermine)(過濾滅菌,分裝保存在 _20°C ) ； (Fluka 公司)(3) 0. 5M亞精胺(spermidine)(過濾滅菌,分裝保存在_20°C ) ； (Fluka公司)(4) 20mg/ml蛋白酶K (過濾滅菌,分裝保存在_20°C ) ; (Merck公司)(5)10% SDS，用溶液A配制，無須滅菌；(6) 8M醋酸鉀(室溫保存，IOOml水中溶解醋酸鉀78. 51g)；(7)裂解緩沖液(現(xiàn)配現(xiàn)用):為溶液A含I % SDS ；0. 15mM精胺，O. 5mM亞精胺和0. lmg/ml (20U/mg)蛋白酶 K。實(shí)施例2家蠅鈉離子通道基因1014位點(diǎn)抗性相關(guān)變異的分子檢測(I)PCR引物一共有5條引物(委托Invitrogen公司合成)，其中PF:為通用外引物(正向)，序列為 5’ -CAT GAT TGT GTT CCG AGTGC-3，(SEQ IDNO 1)PR :為通用外引物(反向)，序列為 5，-CGA AGT TGG ACA AAA GCAAA-3’ (SEQ IDNO 2)PL :為1014L敏感基因特異性引物，序列為5’ -TGG CCA CGT CAACTT ACC ACGAG-3’ (SEQ ID NO 3)PF :為1014F抗性基因型特異性引物，序列為5’ -CCA CGG TCG TGA TCG GCAGTT-3’ (SEQ ID NO 4)PH :1014H抗性基因型特異性引物，序列為5’ -CAC GGT CGT GA TCGG CAA TCAT-3，(SEQ ID NO 5) (2)PCR反應(yīng)設(shè)置每個(gè)個(gè)體設(shè)置三個(gè)PCR反應(yīng)，分別使用三種不同的引物混合物，即 Al (PF+PR+PL, I I 3 混合)，A2 (PF+PR+PF, I I 3 混合)，A3 (PF+PR+PH,1:1: 3 混合^PCR反應(yīng)體系為 20 μ 1，含 10XPCR緩沖液(Takara公司，IOOmM Tris-HCL,500mMKCL, 15mM MgCL2) 2. O μ 1，dNTP (2. 5mM) I. 5 μ I，引物混合物 I. 2μ I ；DNA I μ 1，Taq 酶(Takara 公司，r~Taq, 5U/ μ I) O. 2 μ I。(3) PCR 反應(yīng)程序94 °C 3min ；94 °C 30s, 60 °C 30s, 72 °C 30s, 35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin。(4) PCR產(chǎn)物的電泳檢測將PCR產(chǎn)物在2. O %的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電壓設(shè)定在160V，電泳20min后在紫外光下檢測。各反應(yīng)除了有285bp的參照條帶外，根據(jù)另一條基因特異性引物產(chǎn)物的有無，來判斷各個(gè)體的基因型?；蛐团袆e方法見下表
~LTLL/F ~FVFL/HH/H ~FVH
~Ti285+140 285+140 285285+140 285285
A2285285+189 285+189 285285285+189
A3285285285285+189 285+189 285+189檢測結(jié)果如圖I所示。實(shí)施例3家蠅鈉離子通道基因918位點(diǎn)抗性相關(guān)變異的分子檢測(I)PCR引物引物有四條，其序列分別為SI :5，-TCA ACA CCA ACA CCA TTA CAT AT-3，(SEQ ID NO 6)S2 :5，-CGT GAT GGG AAT GCA ACT TTT CGG A_3，(SEQ ID NO 7)S3 :5，-CAC TGA ATT TAC TCA TTT CGA TGA T-3，(SEQ ID NO 8)S4 :5，-CCC ATT GTC CGG CCC G_3，(SEQ ID NO 9)(2)PCR反應(yīng)設(shè)置PCR反應(yīng)體系15 μ 1，含10XPCR緩沖液(Takara公司，IOOmMTris-HCL, 500mM KCL, 15mM MgCL2) I. 5 μ I, dNTP(2. 5mM) I. 2 μ 1，引物混合物 I. 2 μ I [=S1+S2+S3+S4 (O. 15 μ 1+0. 15 μ 1+0. 45 μ 1+0. 45 μ I) ]，DNA O. 5 μ I，Taq 酶(Takara 公司，r-Taq,5U/μ I)0. I μ I。(3) PCR 反應(yīng)程序94 V 3min ；94 V 30s, 50 V 30s, 72 V 30s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin。 (4) PCR產(chǎn)物的電泳檢測
將PCR產(chǎn)物在2. 0%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電壓設(shè)定在160v，20min后紫外光下檢測。如果在272bp和115bp有條帶，說明該個(gè)體為敏感純合子；如果在272bp和196bp有條帶，說明該個(gè)體為抗性純合子；如果在272bp，196bp和115bp有條帶，說明該個(gè)體為雜檢測結(jié)果如圖2所示。
權(quán)利要求
1.一種家蠅對(duì)擬除蟲菊酯類殺蟲劑靶標(biāo)抗性的分子檢測方法，包含下列步驟 (1)提取單頭家蠅基因組DNA; (2)對(duì)家蠅鈉離子通道基因1014位點(diǎn)抗性相關(guān)變異進(jìn)行分子檢測； (3)對(duì)家蠅鈉離子通道基因918位點(diǎn)抗性相關(guān)變異進(jìn)行分子檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述家蠅鈉離子通道基因序列選自SEQID NO10，SEQ ID NO 11, SEQ ID NO :12，SEQ ID NO 13 和 SEQ IDNO :14。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，所述家蠅鈉離子通道基因1014位點(diǎn)抗性相關(guān)變異為L1014F或L1014H。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述家蠅鈉離子通道基因918位點(diǎn)抗性相關(guān)變異為M918T。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，使用PCR方法對(duì)家蠅鈉離子通道基因1014位點(diǎn)和918位點(diǎn)抗性相關(guān)變異進(jìn)行分子檢測。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，步驟(2)中使用了下列5種PCR引物 PF :正向通用外引物，序列如SEQ ID NO :I所示； PR :反向通用外引物，序列如SEQ ID NO 2所示； PL :1014L敏感基因特異性引物，序列如SEQ ID NO :3所示； PF 1014F抗性基因型特異性引物，序列如SEQ ID NO 4所示； PH :1014H抗性基因型特異性引物，序列如SEQ ID NO 5所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，步驟(2)中每個(gè)個(gè)體設(shè)置3個(gè)PCR反應(yīng)A1、A2和A3，其分別使用下列3種不同的引物混合物 Al PF+PR+PL, 1:1:3 混合； A2 PF+PR+PF, 1:1:3 混合；A3 PF+PR+PH, I I 3 混合。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其中，步驟(2)的PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C3min;94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s，35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟(3)中使用了下列4種PCR引物 51:序列如SEQ ID NO 6所示； 52:序列如SEQ ID NO 7所示； 53:序列如SEQ ID NO 8所示； 54:序列如SEQ ID NO 9所示。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，步驟(3)的PCR反應(yīng)中引物S1、S2、S3和S4的混合比例為I : I : 3 : 3。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，其中，步驟(3)的PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C3min ；94°C 30s, 50°C 30s, 72°C 30s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法在家蠅抗藥性檢測中的應(yīng)用。
13.一種用于家蠅對(duì)擬除蟲菊酯類殺蟲劑靶標(biāo)抗性檢測的試劑盒，包括 (1)用于提取單頭家蠅基因組DNA的試劑； (2)用于對(duì)家蠅鈉離子通道基因1014位點(diǎn)抗性相關(guān)變異進(jìn)行分子檢測的試劑； (3)用于對(duì)家蠅鈉離子通道基因918位點(diǎn)抗性相關(guān)變異進(jìn)行分子檢測的試劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其中所述家蠅鈉離子通道基因序列如SEQID NO.10，11，12，13 和 14 所示。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的試劑盒，其中，用于對(duì)家蠅鈉離子通道基因1014位點(diǎn)抗性相關(guān)變異進(jìn)行分子檢測的試劑包括下列5種PCR引物 PF :正向通用外引物，序列如SEQ ID NO :I所示； PR :反向通用外引物，序列如SEQ ID NO 2所示； PL :1014L敏感基因特異性引物，序列如SEQ ID NO :3所示； PF 1014F抗性基因型特異性引物，序列如SEQ ID NO 4所示； PH :1014H抗性基因型特異性引物，序列如SEQ ID NO 5所示。 根據(jù)權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中，用于對(duì)家蠅鈉離子通道基因.918位點(diǎn)抗性相關(guān)變異進(jìn)行分子檢測的試劑包括下列4種PCR引物 .51:序列如SEQ ID NO 6所示； .52:序列如SEQ ID NO 7所示； .53:序列如SEQ ID NO 8所示； .54:序列如SEQ ID NO 9所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及家蠅對(duì)擬除蟲菊酯類殺蟲劑靶標(biāo)抗性的分子檢測方法。采用根據(jù)家蠅鈉離子通道基因的敏感與抗性基因型設(shè)計(jì)的特異性引物，以單頭家蠅的基因組DNA為模板，進(jìn)行鈉離子通道基因片段的PCR擴(kuò)增，根據(jù)對(duì)PCR產(chǎn)物的電泳檢測，來區(qū)分家蠅個(gè)體的基因型，檢測抗性基因型頻率。本發(fā)明涵蓋家蠅鈉離子通道的1014F，1014H，918T三種抗性點(diǎn)突變的檢測方法。該方法經(jīng)濟(jì)、快速、高通量、準(zhǔn)確性高。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102864209SQ20111018641
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2011年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月5日
發(fā)明者邱星輝, 李梅, 王慶敏, 周云輝 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院動(dòng)物研究所