蛋白酶體抑制劑mg-132作為菊酯類殺蟲劑的增效劑的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于害蟲抗藥性防治領(lǐng)域，具體涉及蛋白酶體抑制劑MG‐132作為菊酯類殺蟲劑的增效劑的應(yīng)用。本發(fā)明將蛋白酶體抑制劑MG‐132作為菊酯類殺蟲劑增效劑，用二甲基亞砜作為溶劑將蛋白酶體抑制劑MG‐132配制成30μM，再噴灑到田間小菜蛾的卵、幼蟲和飼料上進行預(yù)處理，預(yù)處理24小時后施菊酯類殺蟲劑。本發(fā)明通過個體和細胞水平分別證明MG‐132能顯著提高溴氰菊酯的防效。
【專利說明】
蛋白酶體抑制劑MG-132作為菊酯類殺蟲劑的増效劑的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于害蟲抗藥性防治領(lǐng)域，具體涉及蛋白酶體抑制劑MG-132及一種治理小 菜蛾的溴氰菊酯抗性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 昆蟲對殺蟲劑的抗藥性是在藥劑的長期選擇作用下，昆蟲產(chǎn)生的一種生態(tài)適應(yīng)和 進化現(xiàn)象。這種復(fù)雜的選擇過程顯然與多種代謝和調(diào)節(jié)相關(guān)，需要多種蛋白質(zhì)和酶的參與。 蛋白酶體降解途徑是細胞內(nèi)降解蛋白質(zhì)的一個重要途徑，對于細胞許多生命功能的正常運 行，例如細胞周期調(diào)控，基因表達，氧化應(yīng)激反應(yīng)等都是必不可少的。
[0003] 溴氰菊酯是人工合成擬除蟲菊酯殺蟲劑中殺蟲毒力最大的一個品種，性質(zhì)穩(wěn)定， 殺蟲譜廣，生物活性高，在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用。小菜蛾對擬除蟲菊酯類藥劑的抗性發(fā)展 速度快，抗性最為顯著。小菜蛾的抗藥性問題是十分嚴(yán)重的，抗性治理也有一定的難度，要 有效解決這一問題，除了加速殺蟲劑新品種的開發(fā)外，更為切實可行的措施是增強現(xiàn)有殺 蟲劑的殺蟲效果，延長其有效使用時間。
[0004] MG-132是一種強效的，可逆的，細胞通透性的蛋白酶體抑制劑（IC50 = IOOnM)，與 20S和26S蛋白酶體結(jié)合并使其失活。尚沒有將MG-132用于害蟲防治的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供提高溴氰菊酯控制小菜蛾的方法及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明公開了蛋白酶體抑制劑MG-132作為菊酯類殺蟲劑的增效劑的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明中所說的菊酯類殺蟲劑是溴氰菊酯殺蟲劑。
[0008] 所說的MG-132是蛋白酶體的特異性抑制劑。
[0009] 本發(fā)明進一步通過實驗研究蛋白酶體抑制劑MG-132處理不同時間和不同處理濃 度對對溴氰菊酯毒性的影響。
[0010] (1)蛋白酶體抑制劑MG-132處理不同時間對溴氰菊酯毒性的影響
[0011]①首先用二甲基亞砜(DMSO)作為溶劑將蛋白酶體抑制劑配制成最終濃度為ΟμΜ， 1ΟμΜ，20μΜ，30μΜ，40μΜ和50μΜ〇
[0012] ②將處于對數(shù)期的果蠅Kc細胞預(yù)先接種到96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24h。
[0013] ③將2μL濃度為30μM的MG-l32加入到每孔中，繼續(xù)培養(yǎng)不同的時間（2h，4h，6h，8h， l〇h)。取各個時間點的細胞組進行下一步毒性檢測實驗。
[0014]④向經(jīng)蛋白酶體抑制劑處理過的細胞中加入2yL濃度為30ppm的溴氰菊酯藥物(配 制溴氰菊酯的溶劑為DMS0)。每個藥物濃度設(shè)有3個復(fù)孔。
[0015] ⑤藥物處理細胞24h后，用臺盼藍染色法檢測細胞存活率。
[0016] ⑥與對照組相比，計算細胞相對存活率。
[0017] ⑵蛋白酶體抑制劑MG-132不同處理濃度對溴氰菊酯毒性的影響
[0018] ①基于上步的實驗結(jié)果，用不同濃度的蛋白酶體抑制劑(最終濃度為0μΜ，10μΜ，20 μΜ，30μΜ，40μΜ和50μΜ)預(yù)處理對數(shù)期果蠅Kc細胞6h;
[0019] ②對經(jīng)蛋白酶體抑制劑處理過的細胞進行30ppm濃度的藥物刺激24h，每個濃度設(shè) 有3個復(fù)孔；
[0020] ③臺盼藍染色法檢測細胞存活率。（具體操作方法同前）。
[0021] (3)在施藥之前用MG-132處理幼蟲24小時，可明顯提高防效。
[0022]經(jīng)研究表明：（1)蛋白酶體抑制劑對細胞蛋白酶體活性呈可逆性抑制現(xiàn)象。（2)MG-132預(yù)處理，能顯著提高溴氰菊酯處理細胞的死亡率。（3) JG-132預(yù)處理，使溴氰菊酯抗性 品系小菜蛾的抗性水平顯著下降。
[0023]進一步地，本發(fā)明提供了蛋白酶體抑制劑MG-132作為菊酯類殺蟲劑增效劑的具體 應(yīng)用方法，是用二甲基亞砜作為溶劑將蛋白酶體抑制劑MG -13 2配制成3 0 μΜ，再噴灑到田間 小菜蛾的卵、幼蟲和飼料上進行預(yù)處理，預(yù)處理24小時后施菊酯類殺蟲劑。
[0024]本發(fā)明通過個體和細胞水平分別證明MG-132能顯著提高溴氰菊酯的防效，因此本 發(fā)明在抗性的防治應(yīng)用中具有重要的意義。
【附圖說明】
[0025]圖1特定濃度蛋白酶體抑制劑處理不同時間對細胞活性的影響(*代表ρ〈0.05)。 [0026]圖2不同濃度蛋白酶體抑制劑MG-132處理對細胞活性的影響 [0027] 對照:僅用溴氰菊酯藥物處理的對照組細胞；
[0028] MG-132:用30ppm溴氰菊酯和相應(yīng)濃度蛋白酶體抑制劑處理的細胞；
[0029] *代表ρ〈〇·〇5。
【具體實施方式】
[0030] 實施例一
[0031] 1、小菜蛾抗性品系
[0032] 小菜蛾源自貴州省貴陽市花溪區(qū)中曹鄉(xiāng)的甘藍地，室內(nèi)繁殖一代后測四齡幼蟲的 LD5Q值，與武漢市蔬菜研究所的小菜蛾敏感品系四齡幼蟲LD5q值比較，發(fā)現(xiàn)小菜蛾田間種群 為敏感種群。將其作為敏感品系同步隔離培養(yǎng)。小菜蛾溴氰菊酯抗性品系(抗性倍數(shù)>5000) 由點滴法處理小菜蛾四齡幼蟲敏感品系經(jīng)多代繁育選育而成。
[0033] 2、MG_ 132對溴氰菊酯毒性的影響
[0034] (1)特定濃度MG-132處理不同時間所引起的細胞活性的變化
[0035] 首先用特定濃度（30μΜ)的蛋白酶體抑制劑MG-132預(yù)處理果蠅Kc細胞不同時間 (Oh，2h，4h，6h，8h，IOh)，分別對每組細胞進行DM藥物(30ppm)處理，CCK-8試劑盒進行細胞 毒性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體抑制劑對細胞蛋白酶體活性呈可逆性抑制現(xiàn)象，并且在預(yù)處 理6h時，抑制效果達到最佳(附圖1)。
[0036] (2)不同濃度MG-132處理相同時間所引起的細胞活性的變化
[0037] 在上步實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，用不同濃度的蛋白酶體抑制劑MG-132預(yù)處理果蠅細胞 6h，再用濃度為30ppm溴氰菊酯藥物脅迫細胞，毒性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):經(jīng)MG-132預(yù)處理的果蠅 細胞的死亡率明顯高于未經(jīng)MG-132處理的對照組(control)細胞，并且在高濃度的MG-132 誘導(dǎo)下，果蠅細胞出現(xiàn)大面積的凋亡(附圖2)。
[0038] 3、MG_ 132對小菜蛾溴氰菊酯抗性水平的影響
[0039] (I)MG-132 預(yù)處理
[0040] 挑選生長狀態(tài)良好的抗性品系小菜蛾(DR)幼蟲作為實驗材料，腹腔顯微注射蛋白 酶體抑制劑(MG-132)(購自Sigma-Aldrich公司）24h后進行活體水平毒性檢測（臨用前用二 甲基亞砜溶解配成30μΜ)，在相同的條件下，對照組小菜蛾幼蟲腹腔則同時注射等體積的二 甲基亞砜(DMSO)。采用點滴法分別對實驗組和對照組幼蟲進行毒力測定(蘭亦全和趙士熙， 2003)〇
[0041 ] (2)毒性檢測
[0042]小菜蛾幼蟲經(jīng)MG-132預(yù)處理24h后，用毛細微量進樣器將IyL溴氰菊酯藥劑點在幼 蟲的前胸背板上，每個濃度的藥劑分別處理50只小菜蛾幼蟲，然后放入用紗布封口的培養(yǎng) 皿中，人工喂食蘿卜苗。飼喂48h后統(tǒng)計不同濃度藥劑處理組幼蟲的死亡數(shù)，以輕觸蟲體不能 協(xié)調(diào)活動視為判斷死亡標(biāo)準(zhǔn)。
[0043]注:毒力測定實驗設(shè)有3次生物學(xué)重復(fù)。
[0044] (3)經(jīng)MG-132處理后抗性品系小菜蛾幼蟲對溴氰菊酯毒力的變化
[0045]抗性品系小菜蛾幼蟲經(jīng)不同濃度的溴氰菊酯藥物處理48h后，人工記錄各藥物濃 度處理組幼蟲的死亡數(shù)，采用SPSS軟件進行毒力回歸分析得出參數(shù)估計和回歸方程檢驗 表、95%的置信區(qū)間。通過分析得出小菜蛾抗性品系的毒力回歸方程為Probit(P)=-1.943 +1.017義，當(dāng)？ = 0.5時，查得1^：50值為16.9口口111，95%的置信區(qū)間為9.76~15.35。
[0046]為了進一步研究蛋白酶體活性的改變與溴氰菊酯應(yīng)激反應(yīng)之間的關(guān)系，蛋白酶體 抑制劑MG-132被用來處理抗性品系小菜蛾幼蟲，經(jīng)MG-132預(yù)處理后，再分別對處理組和未 處理組的小菜蛾幼蟲進行溴氰菊酯毒力測定。三次獨立的生物學(xué)實驗的結(jié)果經(jīng)分析得：當(dāng) 蛋白酶體的活性被抑制劑MG-132抑制之后，小菜蛾抗性品系對農(nóng)藥溴氰菊酯的LC50的值被 顯著下調(diào)。結(jié)果如表1所示。
[0047]表1.經(jīng)MG-132處理后抗性品系小菜蛾幼蟲對溴氰菊酯毒力的變化
[0049] η:代表幼蟲總數(shù);*代表p<0.05。
【主權(quán)項】
1. 蛋白酶體抑制劑MG-132作為菊酯類殺蟲劑的增效劑的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所說的應(yīng)用，其特征在于:其中所說的菊酯類殺蟲劑是溴氰菊酯殺蟲 劑。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所說的應(yīng)用，其特征在于:其中所說的MG-132是蛋白酶體的特異性抑 制劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所說的應(yīng)用，其特征在于：用二甲基亞砜作為溶劑將蛋白酶體抑制劑 MG-132配制成30μΜ，再噴灑到田間小菜蛾的卵、幼蟲和飼料上進行預(yù)處理，預(yù)處理24小時后 施菊酯類殺蟲劑。
【文檔編號】A01P7/00GK105961426SQ201610303480
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月10日
【發(fā)明人】程羅根, 程晨, 胡俊麗, 李風(fēng)良
【申請人】南京師范大學(xué)