專利名稱：運用雙重pcr引物檢測禾草腥黑粉菌和雀麥腥黑粉菌的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及使用PCR技術檢測寄生于禾本科草種中禾草腥黑粉菌(7 fusca E II & E V )和雀麥腥黑粉菌[Jilletia bromi (Brockm.) Brockm]的方法，屬于禾本科草種腥黑粉菌檢測領域。
背景技術：
早熟禾屬(/^3L )植物中的許多種是優(yōu)質的牧草和草坪草，在全國各地廣泛種植， 以滿足畜牧業(yè)及城市園林綠化建設的需要。草地早熟禾A pratensis L.的再生能力強， 抗寒性和秋季保綠性較好；加拿大早熟禾A compressaL.具發(fā)達的根系和根狀莖，耐寒、 耐土壤干旱、耐瘠薄的能力優(yōu)；一年生早熟禾A annua L.喜光，耐陰、耐旱性強，耐瘠薄 (謝可軍等.10種早熟禾屬植物的過氧化物酶同工酶分析.中國草地，2003，25(2): 30-33 )。目前，在進境禾本科草種中，早熟禾數(shù)量最多，每年約有2000多噸被引入中國。優(yōu)良草種的引進，一定程度上促進了畜牧業(yè)的發(fā)展和改善了城市的環(huán)境水平，產(chǎn)生了較好的經(jīng)濟效益和社會效益。但同時，隨著國外草籽的大量引進，外來危險性有害生物也隨草籽進入，對我國城市園林綠化建設及農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)安全造成潛在威脅。龔賢弟等(六月禾腥黑穗病菌的初步研究.植物檢疫，，1991，5(6): 407-411)和李鳴等(從美國進口六月禾中檢出狐草腥黑穗病菌.植物檢疫，1992，6(6): 42)報道，從進境草地早熟禾即六月禾0°. /Trateasil5)中發(fā)現(xiàn)一種冬孢子形態(tài)與雀麥上的TYBeiia bromi (Brockm.) Brockm.、烏爾波草上的(7 /i/sca E II & E V)、早熟禾中的 7 sterilis 私 T. togwateei 相似的腥黑粉菌。隨后，天津出入境檢驗檢疫局多次從來自美國的草地早熟禾、一年生早熟禾和加拿大早熟禾的種子中截獲此菌。
腥黑粉菌riBeiia Tul. & C. Tul.引起的腥黑穗病是早熟禾上重要的真菌病害， 嚴重影響早熟禾的品質和產(chǎn)量。Mof^iJilletia puccinelliae, a new species of reticulate-spored bunt fungus infecting Puccinellia distans. Mycologia, 2010, 102(3) : 613-623)認為，侵染早熟禾屬的腥黑粉菌有6種7 cathcartae Duran & G. W. Fisch.、T. paradoxa Jacz.、Τ. poae Nagorny> Τ. sterilis Ule、Τ. togwateei 禾口 Τ. transiliensis Μ. N. Kusnezow & Schwarzman.。其中，Τ1· paradoxa > Τ. transiIiensis 和Τ. cathcartae的冬孢子表面具瘤突，其它3種表面紋飾網(wǎng)狀-’T. sterilis的冬孢子堆聚生于葉鞘和莖部，其它種則危害子房，將種子變?yōu)榫`(Durto R et al. , The genus Tilletia. Pullman Press, Washington. , 1961, 138)。就寄主范圍而論，T1. togwateei Poareflexa Vasey & Scribn (Guillemette MK et al.， a new bunt species from Poa reflexa. Mycologia, 1988，80(3) : 273-285), T. /？徹沒寄生于林地早熟禾戶.nemoralis L.。依據(jù) Guillemette (Guillemette MK. Tilletia togwatii, a new bunt species from Poa refIexa. Mycologia, 1988, 80 (3) : 273—285)、Boyd (Boyd ML et al.， Molecular relationships among varieties of the Tilletia fusca(71. bromi) complex and related species. Mycological Research, 1997, 101 (3): 269-277)； Boyd ML et al. , Evidence supporting the separation of the Vulpia- and Bromus-infecting isolates in the Tilletia fusca (T. bromi) complex. Mycologia, 1998， 90(6): 1031-1039)禾口 Vanky (Vanky K. European smut fungi. Gustav Fischer Verlag Press, Germany. 1994，570)的分類觀點，7和 7力寄主不包括早
熟禾屬，那么，從早熟禾中發(fā)現(xiàn)的類似7 ⑵和7力的腥黑粉菌之分類地位及有關特性需要進一步明確。羅加鳳(羅加鳳等，從進口早熟禾種子中檢出的一種腥黑粉菌與其近似種的比較.菌物學報，2011，30(1): 32-38)根據(jù)3種早熟禾上截獲的腥黑粉菌與4 種近似種基于菌癭、冬孢子形態(tài)及萌發(fā)生理特性的比較，將早熟禾上的腥黑粉菌定名為7 bromi 0但是長期以來檢疫系統(tǒng)一直將早熟禾上發(fā)現(xiàn)的這種腥黑粉菌鑒定為禾草腥黑穗病菌7 /iAsca (龔賢弟等，六月禾腥黑穗病菌的初步研究.植物檢疫，1991，5(6): 407-411;王圓.中國進境植物檢疫有害生物選編，北京中國農(nóng)業(yè)出版社，1997， 505-506)，而且T. bromi和T. fusca之間冬孢子形態(tài)及萌發(fā)生理特性非常相似(羅加鳳等，從進口早熟禾種子中檢出的一種腥黑粉菌與其近似種的比較.菌物學報，2011， 30(1): 32-38. ),Boyd 等(Boyd ML et al. , Molecular relationships among varieties of the Tilletia fusca (T. bromi) complex and related species. Mycological Research, 1997, 101(3): 269-277; Boyd ML et al., Evidence supporting the separation of the Vulpia- and Bromus-infecting isolates in the Tilletia fusca (T. bromi) complex. Mycologia, 1998，90(6): 1031-1039)從寄主?；浴⒎肿由飳W及細胞學三方面闡述了侵染Vulpia的?；秃颓秩綢o^as的?；偷牟煌瑢⒓戏N分為兩個獨立的種，T. ZiAsca和7 bromi -’\k為T. /i/sca寄主僅限于fe7/7ia，而將侵染雀麥的腥黑粉菌歸為7力ro i。腥黑粉菌屬主要依據(jù)形態(tài)學、萌發(fā)生理、細胞學諸方面的特性以及寄主?；赃@些傳統(tǒng)方法進行分類，但萌發(fā)實驗耗時費力，萌發(fā)是否成功受材料新鮮程度、材料多少、培養(yǎng)條件等諸多因素的制約，不利于口岸的快速檢測。隨著草業(yè)國際化引種頻繁，7 bromm T. /皿⑵通過口岸傳入我國的風險越來越大。為了保護我國的牧草生產(chǎn)和城市綠化，因此為了在口岸更為快速、準確的對這兩種腥黑粉菌進行檢測，有必要在口岸建立雀麥腥黑粉菌和禾草腥黑粉菌的快速準確的分子檢測方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明建立了快速簡便、特異性強、靈敏度高、準確可靠的T. fusca和T. bromi 雙重PCR分子檢測方法，能將T. fusca和T. bromi區(qū)別開來。該方法不僅能夠檢測菌絲基因組DNA，而且可以利用冬孢子雙重套式擴增實現(xiàn)對兩種腥黑粉菌冬孢子的同時檢測，節(jié)約了試劑和時間，檢測快速、可靠，整個過程在一個工作日內完成，可有效在口岸檢測中推廣應用。實驗涉及的材料包括Tilletia屬的2個近似種共計7個菌株(見表1，主要為菌絲和冬孢子)，來源于天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心植檢實驗室，ZaoU Zao2、 ZaoL, Poa5、Poa6為美國進境早熟禾上截獲，LMC307和LMC312為交流的標本，所有菌株均由冬孢子培養(yǎng)出菌絲。
具體技術方案如下
本發(fā)明的目的之一是提供一種檢測禾草腥黑粉菌U. fusca)和雀麥腥黑粉菌(7 知菌絲基因組DNA的雙重特異PCR方法和冬孢子的雙重套式PCR方法，既能對菌絲基因組DNA實現(xiàn)雙重特異PCR檢測，又能對冬孢子實現(xiàn)雙重套式PCR檢測，所設計的引物和用途如下
(1)設計腥黑粉菌屬通用引物，序列如下
通用外套引物IGSUFl =GGA TGC ATT CTG GGG ACG T IGSURl :GTA GCC TTG TTG CTA CGA TCT G 通用內套引物:NIGSUF1 :CAC CGC CCA AGC ACG TAC NIGSUR1 :GAC CTT TTG GGG TCA AAC TTC TC
通用外套引物用于腥黑粉菌屬菌絲基因組DNA或冬孢子套式擴增，擴增片段約為 900bp，通用內套引物用于冬孢子的套式擴增，擴增片段約為700bp，這兩套引物用于腥黑粉菌屬擴增過程質量監(jiān)測，檢查所抽提的菌絲基因組DNA質量和冬孢子的挑取和破碎，避免檢測過程中的假陰性；
(2)設計禾草腥黑粉菌和雀麥腥黑粉菌各自的外套引物和特異引物，序列如下 禾草腥黑粉菌的外套引物:IGSUF2 :GAG CGA TAC CTT TGC ATT CTG ACG T IGSUR2 :CAC TGC ATT CTG GGG ACG TAC
禾草腥黑粉菌的特異引物PFSF =GAC TCG CGT CAA GCG A PFSR :GCG AAG GGA AAG TTC GAC，
特異引物的擴增片段約為140bp，這兩套引物用于禾草腥黑粉菌的菌絲基因組DNA特異PCR擴增和冬孢子套式PCR的擴增。雀麥腥黑粉菌外套引物tubF=GAA GAC GTA TGC GTT GAG GA tubR :AGG AGG ATG CCG AGC GAG A
雀麥腥黑粉菌特異引物PNSF:CTC AAC CCT TCC CTC TAT TCC PNSR :CGA TAC GGA TTC TGC ATT CC
特異引物的擴增片段約為420bp，這兩套引物用于雀麥腥黑粉菌的菌絲基因組DNA特異PCR擴增和冬孢子套式PCR的擴增。本發(fā)明的目的之二是為檢測禾草腥黑粉菌和雀麥腥黑粉菌的方法提供下列步驟
(1)實驗材料冬孢子的萌發(fā)和菌絲的培養(yǎng)；
(2)菌絲基因組DNA的提??；
(3)冬孢子的挑取與破碎；
(4)菌絲基因組DNA雙重PCR檢測； (5 )冬孢子雙重套式PCR檢測。本發(fā)明的目的之三是運用雙重PCR引物檢測禾草腥黑粉菌和雀麥腥黑粉菌的方法以及所設計的6套引物在檢測禾草腥黑粉菌和雀麥腥黑粉菌方面的應用。本發(fā)明設計合成了 6套引物，包括通用外套引物、通用內套引物、T. fusca和T. brotni的外套引物和特異引物。通用外套引物用于菌絲基因組DNA或冬孢子的套式擴增， 通用內套引物用于冬孢子的套式擴增，這兩套引物用于擴增過程質量監(jiān)測，檢查所抽提的
5菌絲基因組DNA質量和冬孢子的挑取和破碎，避免檢測過程中的假陰性。Τ. ⑵和7 知的外套引物和特異引物用于兩種菌的菌絲基因組DNA雙重特異PCR擴增，各自的外套引物與特異引物用于它們的冬孢子DNA的雙重套式PCR特異擴增。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明建立了快速簡便、特異性強、靈敏度高、準確可靠的T. fusca和T. bromi的雙重PCR分子檢測方法，能將T. fusca和T. 知區(qū)別開來。采用通用引物監(jiān)測實驗過程，避免假陰性。該方法不僅能夠檢測菌絲基因組DNA，而且可以利用冬孢子雙重套式擴增實現(xiàn)對兩種腥黑粉菌冬孢子的同時檢測，節(jié)約了試劑和時間，檢測快速、可靠，整個過程在一個工作日內完成，可有效在口岸檢測中推廣應用。下面結合附圖與具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細描述。


圖1 菌絲基因組DNA外套通用引物的擴增； 圖2 菌絲基因組DNA特異引物的雙重擴增；
圖3 冬孢子通用引物套式PCR的擴增； 圖4 冬孢子特異引物雙重套式PCR的擴增。
具體實施例方式實施例1 實驗材料冬孢子的萌發(fā)和菌絲的培養(yǎng)
實驗涉及的材料包括Tilletia屬的2種近似種共計7個菌株(主要為菌絲和冬孢子) 來源于天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心植檢實驗室，Za0l、^i02、Za0L、P0a5、 Poa6為美國進境早熟禾上截獲，LMC307和LMC312為交流的標本，所有菌株均由冬孢子培養(yǎng)出菌絲，供試材料的相關信息見表1。
權利要求
1.一種運用雙重PCR引物檢測禾草腥黑粉菌和雀麥腥黑粉菌的方法，既能對菌絲基因組DNA實現(xiàn)雙重特異PCR檢測，又能對冬孢子實現(xiàn)雙重套式PCR檢測，其特征在于，所設計的引物和用途如下(1)設計腥黑粉菌屬通用引物，序列如下通用外套引物IGSUFl =GGA TGC ATT CTG GGG ACG T IGSURl :GTA GCC TTG TTG CTA CGA TCT G 通用內套引物:NIGSUF1 :CAC CGC CCA AGC ACG TAC NIGSUR1 :GAC CTT TTG GGG TCA AAC TTC TC通用外套引物用于腥黑粉菌屬菌絲基因組DNA或冬孢子套式擴增，擴增片段約為 900bp，通用內套引物用于冬孢子的套式擴增，擴增片段約為700bp，這兩套引物用于腥黑粉菌屬擴增過程質量監(jiān)測，檢查所抽提的菌絲基因組DNA質量和冬孢子的挑取和破碎，避免檢測過程中的假陰性；(2)設計禾草腥黑粉菌和雀麥腥黑粉菌各自的外套引物和特異引物，序列如下 禾草腥黑粉菌的外套引物:IGSUF2 :GAG CGA TAC CTT TGC ATT CTG ACG T IGSUR2 :CAC TGC ATT CTG GGG ACG TAC禾草腥黑粉菌的特異引物PFSF =GAC TCG CGT CAA GCG A PFSR :GCG AAG GGA AAG TTC GAC,特異引物的擴增片段約為140bp，這兩套引物用于禾草腥黑粉菌的菌絲基因組DNA特異PCR擴增和冬孢子套式PCR的擴增，雀麥腥黑粉菌外套引物:tubF =GAA GAC GTA TGC GTT GAG GA tubR :AGG AGG ATG CCG AGC GAG A雀麥腥黑粉菌特異引物PNSF :CTC AAC CCT TCC CTC TAT TCC PNSR :CGA TAC GGA TTC TGC ATT CC特異引物的擴增片段約為420bp，這兩套引物用于雀麥腥黑粉菌的菌絲基因組DNA特異PCR擴增和冬孢子套式PCR的擴增。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種運用雙重PCR引物檢測禾草腥黑粉菌和雀麥腥黑粉菌的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)實驗材料冬孢子的萌發(fā)和菌絲的培養(yǎng)；(2)菌絲基因組DNA的提??；(3)冬孢子的挑取與破碎；(4)菌絲基因組DNA雙重PCR檢測； (5 )冬孢子雙重套式PCR檢測。
3.權利要求1和2所述的一種運用雙重PCR引物檢測禾草腥黑粉菌和雀麥腥黑粉菌的方法以及所設計的6套引物在檢測禾草腥黑粉菌和雀麥腥黑粉菌方面的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用PCR擴增技術檢測禾草腥黑粉菌(TilletiafuscaEⅡ&EⅤ)和雀麥腥黑粉菌[T.bromi(Brockm.)Brockm]的方法，屬于禾本科草種腥黑粉菌檢測領域。本發(fā)明設計了6套引物，即通用外套引物、通用內套引物、T.fusca的外套引物和特異引物、T.bromi的外套引物和特異引物。通用外套引物用于菌絲基因組DNA或冬孢子的套式擴增，通用內套引物用于冬孢子的套式擴增，這兩套引物用于擴增過程質量監(jiān)測，檢查所抽提的菌絲基因組DNA質量和冬孢子的挑取和破碎，避免檢測過程中的假陰性。T.fusca和T.bromi的外套引物和特異引物可用于兩種菌的菌絲基因組DNA雙重特異PCR擴增，各自的外套引物與特異引物用于雙重套式PCR特異擴增冬孢子DNA。
文檔編號C12Q1/04GK102229998SQ20111014561
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月1日 優(yōu)先權日2011年6月1日
發(fā)明者劉躍庭, 劉鵬, 廖芳, 張裕君, 羅加鳳, 黃國明 申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心