專利名稱：家蠶中部絲腺細(xì)胞合成分泌溶菌酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建一種家蠶中部絲腺細(xì)胞合成分泌溶菌酶的方法。
背景技術(shù)：
溶菌酶(Lysozyme)又稱為胞壁質(zhì)酶，分子由1 個(gè)氨基酸組成，分子量約1 5 KDa，等電點(diǎn)約10.8。溶菌酶廣泛存在于家禽和鳥類的蛋清中，存在于哺乳動(dòng)物的眼淚、唾液、心、肺、肝、腎等液體及器官中，存在于大麥、蕪青、無花果等植物中。其中以蛋清中的含量最高，約含0. 3%，而人乳、眼淚、唾液中的活性最高，高于蛋清中的酶活性3倍。溶菌酶是一種專門作用于微生物細(xì)胞壁的水解酶，它破壞微生物細(xì)胞壁，引起細(xì)菌裂解，具有防腐和殺菌作用。而人和動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，故溶菌酶對(duì)人和動(dòng)物細(xì)胞無毒性作用，被廣泛用于醫(yī)療、食品、畜牧和生物工程等領(lǐng)域。如醫(yī)學(xué)上利用溶菌酶抗炎、 消腫，增強(qiáng)免疫力。食品上利用溶菌酶作為保健食品添加劑，用于水產(chǎn)類熟制品、肉類制品的防腐和保鮮。在畜牧上用作飼料防腐劑和殺菌劑，用于家畜防治胃腸炎、消化不良等疾病?？茖W(xué)研究中，利用溶菌酶分解細(xì)胞壁后制備原生質(zhì)體，用于微生物育種，用于細(xì)胞融合操作。溶菌酶價(jià)格很高，平均每公斤約2萬元。目前溶菌酶的生產(chǎn)主要是從生物組織中提取，提取的方法主要有直接結(jié)晶法、離子交換層析法、親和層析法、超濾法、膜色譜技術(shù) (親和膜色譜，離子交換膜色譜)法、反膠團(tuán)蘋取法、擴(kuò)張床吸附法等。生產(chǎn)工藝復(fù)雜，成本高，效益低。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)溶菌酶是高效率、低成本的生產(chǎn)方法。轉(zhuǎn)基因家蠶中部絲腺生物反應(yīng)器是在家蠶中部絲腺中表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。家蠶生長(zhǎng)周期短，50天左右可完成一個(gè)世代，每個(gè)雌蛾可產(chǎn)卵約400粒；家蠶經(jīng)過長(zhǎng)達(dá)四千多年的人工馴養(yǎng)、選育，性情溫順，已完成喪失飛翔逃逸能力，而在絲蛋白合成、分泌方面具有非常強(qiáng)的能力；合成的蛋白可以隨蠶絲蛋白一起分泌到體外，蠶絲蛋白主要由3種絲素蛋白和3種絲膠蛋白構(gòu)成，成分簡(jiǎn)單。所以，轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺生物反應(yīng)器構(gòu)建容易，運(yùn)行安全，表達(dá)外源蛋白效率高，外源蛋白多具有生物活性，蛋白純化方便，只需要通過飼養(yǎng)轉(zhuǎn)基因家蠶，就可以非常方便地維持表達(dá)系統(tǒng)的延續(xù)，是一種非常有價(jià)值的表達(dá)系統(tǒng)，具有廣闊的實(shí)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種家蠶中部絲腺細(xì)胞合成分泌溶菌酶的方法，利用轉(zhuǎn)基因家蠶技術(shù)將溶菌酶基因?qū)爰倚Q基因組內(nèi)，并在家蠶中部絲腺細(xì)胞中特異表達(dá)，開發(fā)出合成分泌溶菌酶的家蠶。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案的步驟如下
(1)采用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建家蠶合成分泌溶菌酶的載體pBSerlhLYZ-A3EGFP質(zhì)粒。(2)采用顯微注射轉(zhuǎn)基因家蠶方法將pBSerlhLYZ_A3EGFP質(zhì)粒及能夠提供轉(zhuǎn)座酶trans的輔助質(zhì)粒導(dǎo)入家蠶受精卵內(nèi)，蠶卵孵化后飼養(yǎng)至成蟲，自交續(xù)代為Gl代，在Gl代轉(zhuǎn)基因家蠶的小蠶期，通過熒光體視顯微鏡觀察選擇表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶，飼養(yǎng)至成蟲與絲膠蠶雜交續(xù)代為G2代，G2代以后再與絲膠蠶回交3-5代，以表達(dá)EGFP標(biāo)志基因及絲膠蠶性狀為每代的留種篩選標(biāo)志。(3)與絲膠蠶多次回交后的蠶，再采用自交的方法使溶菌酶基因純合，采用轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對(duì)量無損傷測(cè)定方法選擇溶菌酶基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶，育成中部絲腺細(xì)胞能夠合成分泌溶菌酶、基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種。所述的pBSerlhLYZ-A3EGFP質(zhì)粒是以piggyBac轉(zhuǎn)座質(zhì)粒為基礎(chǔ)，質(zhì)粒帶有Amp抗性基因以用于質(zhì)粒的擴(kuò)增和篩選，包含piggyBac轉(zhuǎn)座子的2個(gè)轉(zhuǎn)座臂PBL 和PBR，包含2個(gè)功能表達(dá)框，一個(gè)是A3啟動(dòng)子啟動(dòng)的綠色熒光蛋白基因表達(dá)框A3 Promoter+EGFP+SV40,以用作轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性家蠶的篩選標(biāo)志，另一個(gè)是家蠶絲膠蛋白1 啟動(dòng)子、帶有便于提純外源蛋白的His接頭以及溶菌酶基因的表達(dá)框％1~1 Promoter +His+hLYZ+SV40,以表達(dá)溶菌酶，輔助質(zhì)粒包含Amp抗性基因、piggyBac轉(zhuǎn)座子的1個(gè)轉(zhuǎn)座臂PBR、A3啟動(dòng)子啟動(dòng)的轉(zhuǎn)座酶trans基因表達(dá)框A3 Promoter+ trans,以提供轉(zhuǎn)座酶。所述的以絲膠蠶性狀為每代的留種篩選標(biāo)志，其篩選的時(shí)期是蠶繭時(shí)期。本發(fā)明具有的有益效果是
本發(fā)明借助熒光標(biāo)志基因篩選轉(zhuǎn)基因家蠶，這種轉(zhuǎn)基因家蠶能夠在家蠶中部絲腺細(xì)胞特異地合成分泌溶菌酶，為提高溶菌酶的生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本奠定基礎(chǔ)。培育成功的生產(chǎn)溶菌酶的家蠶新品種，可以提高蠶農(nóng)養(yǎng)蠶經(jīng)濟(jì)效益，改善溶菌酶生產(chǎn)工藝，簡(jiǎn)化提純方法，提高生產(chǎn)溶菌酶企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。溶菌酶產(chǎn)量的提高和成本的降低，有利于溶菌酶的大量使用，進(jìn)一步提高醫(yī)療、食品、畜牧和生物工程等領(lǐng)域的經(jīng)濟(jì)效益。


圖1是家蠶中部絲腺細(xì)胞合成分泌溶菌酶的pBSerlhLYZ_A3EGFP載體結(jié)構(gòu)圖。圖2是能夠提供轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1
將pBSerlhLYZ-A3EGFP質(zhì)粒(圖1)及能夠提供轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒(圖2)按5:1比率混合，2種質(zhì)粒的總濃度為0. 3μβ/μ1，質(zhì)粒溶解在0. ImM含有4mM氯化鈉的磷酸緩沖液中，然后采用顯微注射方法導(dǎo)入家蠶產(chǎn)卵后8小時(shí)以內(nèi)的受精卵內(nèi)，導(dǎo)入總體積為30nl。將顯微注射的蠶卵在23°C，75%濕度，他光照條件下飼養(yǎng)至成蟲，自交續(xù)代(Gl代)。在轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的Gl代小蠶期，通過熒光顯微鏡(Olympus，SZX12，日本)觀察獲取表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶1蛾，熒光顯微鏡的激發(fā)波長(zhǎng)為460nm 490nm，發(fā)射波長(zhǎng)為510 nm 550 nm。將蠶飼養(yǎng)至成蟲與絲膠蠶雜交產(chǎn)卵續(xù)代(G2)。自第G2代以后的轉(zhuǎn)基因家蠶均采用單蛾育，在小蠶期通過熒光體視顯微鏡觀察，挑選表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶，飼養(yǎng)至成蟲，選擇蠶繭特性為絲膠的個(gè)體與絲膠蠶回交續(xù)代，經(jīng)回交5代選擇留種，在每代的小蠶期，通過熒光體視顯微鏡觀察選留表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶，在蠶繭時(shí)期選留蠶繭特性為絲膠的個(gè)體。與絲膠蠶回交5代后的蠶，再采用自交的方法使溶菌酶基因純合，采用轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對(duì)量無損傷測(cè)定方法選擇溶菌酶基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶，育成中部絲腺細(xì)胞能夠合成分泌溶菌酶、且溶菌酶含量占絲蛋白含量較高比例的基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種。采用溫水對(duì)蠶繭進(jìn)行溶解，獲得家蠶中部絲腺細(xì)胞特異性合成分泌溶菌酶的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種的絲膠蛋白溶液，以同樣方法獲得的非轉(zhuǎn)基因家蠶品種的絲膠為對(duì)照，比較對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果，抑菌率提高17. 05%。實(shí)施例2:
將pBkrlhLYZ-A3EGFP質(zhì)粒(圖1)及能夠提供轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒(圖2)按1:1比率混合，2種質(zhì)粒的總濃度為 μβ/μ1，質(zhì)粒溶解在2mM含有ImM氯化鈉的磷酸緩沖液中，然后采用顯微注射方法導(dǎo)入家蠶產(chǎn)卵后6小時(shí)以內(nèi)的受精卵內(nèi)，導(dǎo)入總體積為5nl。將顯微注射的蠶卵在^°C，90%濕度，1 光照條件下飼養(yǎng)至成蟲，轉(zhuǎn)基因家蠶自交續(xù)代(Gl代)。在轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的Gl代小蠶期，通過熒光顯微鏡(Olympus，SZX12，日本)觀察獲得表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶1蛾，熒光顯微鏡的激發(fā)波長(zhǎng)為460歷 490匪，發(fā)射波長(zhǎng)為510 nm 550 nm。將蠶飼養(yǎng)至成蟲與絲膠蠶雜交產(chǎn)卵續(xù)代(G2)。自第G2代以后的轉(zhuǎn)基因家蠶均采用單蛾育，在小蠶期通過熒光體視顯微鏡觀察，挑選表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶，飼養(yǎng)至成蟲，選擇蠶繭特性為絲膠的個(gè)體與絲膠蠶回交續(xù)代，經(jīng)回交3代選擇留種，在每代的小蠶期，通過熒光體視顯微鏡觀察選留表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶，在蠶繭時(shí)期選留蠶繭特性為絲膠的個(gè)體。與絲膠蠶回交3代后的蠶，再采用自交的方法使溶菌酶基因純合，采用轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對(duì)量無損傷測(cè)定方法選擇溶菌酶基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶，育成中部絲腺細(xì)胞能夠合成分泌溶菌酶、且溶菌酶含量占絲蛋白含量較高比例的基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種。采用溫水對(duì)蠶繭進(jìn)行溶解，獲得家蠶中部絲腺細(xì)胞特異性合成分泌溶菌酶的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種的絲膠蛋白溶液，以同樣方法獲得的非轉(zhuǎn)基因家蠶品種的絲膠為對(duì)照，比較對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果，抑菌率提高16. 46%。實(shí)施例3
將pBkrlhLYZ-A3EGFP質(zhì)粒(圖1)及能夠提供轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒(圖2)按2 1比率混合，2種質(zhì)粒的總濃度為0. 5μβ/μ1，質(zhì)粒溶解在ImM含有2mM氯化鈉的磷酸緩沖液中，然后采用顯微注射方法導(dǎo)入家蠶產(chǎn)卵后4小時(shí)以內(nèi)的受精卵內(nèi)，導(dǎo)入總體積為15nl。將顯微注射的蠶卵在25°C，80%濕度，1 光照條件下飼養(yǎng)至成蟲，與非轉(zhuǎn)基因家蠶交配續(xù)代(Gl 代)。在轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的Gl代小蠶期，通過熒光顯微鏡(Olympus JZX12，日本)觀察獲得表達(dá) EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶1蛾，熒光顯微鏡的激發(fā)波長(zhǎng)為460nm 490nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 510 nm 550 nm。將蠶飼養(yǎng)至成蟲與絲膠蠶雜交產(chǎn)卵續(xù)代(G2)。自第G2代以后的轉(zhuǎn)基因家蠶均采用單蛾育，在小蠶期通過熒光體視顯微鏡觀察，挑選表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶，飼養(yǎng)至成蟲，選擇蠶繭特性為絲膠的個(gè)體與絲膠蠶回交續(xù)代，經(jīng)回交4代選擇留種， 在每代的小蠶期，通過熒光體視顯微鏡觀察選留表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶，在蠶繭時(shí)期選留蠶繭特性為絲膠的個(gè)體。與絲膠蠶回交4代后的蠶，再采用自交的方法使溶菌酶基因純合，采用轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對(duì)量無損傷測(cè)定方法選擇溶菌酶基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶，育成中部絲腺細(xì)胞能夠合成分泌溶菌酶、且溶菌酶含量占絲蛋白含量較高比例
5的基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種。采用溫水對(duì)蠶繭進(jìn)行溶解，獲得家蠶中部絲腺細(xì)胞特異性合成分泌溶菌酶的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種的絲膠蛋白溶液，以同樣方法獲得的非轉(zhuǎn)基因家蠶品種的絲膠為對(duì)照，比較對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果，抑菌率提高15. 92%。實(shí)施例4
將pBSerlhLYZ-A3EGFP質(zhì)粒(圖1)及能夠提供轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒(圖2)按3:1比率混合，2種質(zhì)粒的總濃度為0. 6μβ/μ1，質(zhì)粒溶解在1. 5mM含有2. 5mM氯化鈉的磷酸緩沖液中， 然后采用顯微注射方法導(dǎo)入家蠶產(chǎn)卵后5小時(shí)以內(nèi)的受精卵內(nèi)，導(dǎo)入總體積為20nl。將顯微注射的蠶卵在，75%濕度，12h光照條件下飼養(yǎng)至成蟲，與非轉(zhuǎn)基因家蠶交配續(xù)代(Gl 代)。在轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的Gl代小蠶期，通過熒光顯微鏡(Olympus JZX12，日本)觀察獲得表達(dá) EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶2蛾，熒光顯微鏡的激發(fā)波長(zhǎng)為460nm 490nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 510 nm 550 nm。將蠶飼養(yǎng)至成蟲與絲膠蠶雜交產(chǎn)卵續(xù)代(G2)。自第G2代以后的轉(zhuǎn)基因家蠶均采用單蛾育，在小蠶期通過熒光體視顯微鏡觀察，挑選表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶，飼養(yǎng)至成蟲，選擇蠶繭特性為絲膠的個(gè)體與絲膠蠶回交續(xù)代，經(jīng)回交4代選擇留種， 在每代的小蠶期，通過熒光體視顯微鏡觀察選留表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶，在蠶繭時(shí)期選留蠶繭特性為絲膠的個(gè)體。與絲膠蠶回交4代后的蠶，再采用自交的方法使溶菌酶基因純合，采用轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對(duì)量無損傷測(cè)定方法選擇溶菌酶基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶，育成中部絲腺細(xì)胞能夠合成分泌溶菌酶、且溶菌酶含量占絲蛋白含量較高比例的基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種。采用溫水對(duì)蠶繭進(jìn)行溶解，獲得家蠶中部絲腺細(xì)胞特異性合成分泌溶菌酶的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種的絲膠蛋白溶液，以同樣方法獲得的非轉(zhuǎn)基因家蠶品種的絲膠為對(duì)照，比較對(duì)大腸桿菌的抑菌效果，2個(gè)品種中部絲腺腺腔內(nèi)溶物抑菌率分別提高9. 35%和8. 41%，絲膠抑菌率分別提高11. 68 %和10. 79%。
權(quán)利要求
1.一種家蠶中部絲腺細(xì)胞合成分泌溶菌酶的方法，其特征在于該方法的步驟如下(1)采用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建家蠶合成分泌溶菌酶的載體pBkrlhLYZ-A3EGFP質(zhì)粒；(2)采用顯微注射轉(zhuǎn)基因家蠶方法將pBkrlhLYZ-A3EGFP質(zhì)粒及能夠提供轉(zhuǎn)座酶 trans的輔助質(zhì)粒導(dǎo)入家蠶受精卵內(nèi)，蠶卵孵化后飼養(yǎng)至成蟲，自交續(xù)代為Gl代，在Gl代轉(zhuǎn)基因家蠶的小蠶期，通過熒光體視顯微鏡觀察選擇表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因家蠶，飼養(yǎng)至成蟲與絲膠蠶雜交續(xù)代為G2代，G2代以后再與絲膠蠶回交3-5代，以表達(dá)EGFP標(biāo)志基因及絲膠蠶性狀為每代的留種篩選標(biāo)志；(3)與絲膠蠶多次回交后的蠶，再采用自交的方法使溶菌酶基因純合，采用轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達(dá)相對(duì)量無損傷測(cè)定方法選擇溶菌酶基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶，育成中部絲腺細(xì)胞能夠合成分泌溶菌酶、基因純合的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種家蠶中部絲腺細(xì)胞合成分泌溶菌酶的方法，其特征在于所述的pBSerlhLYZ-A3EGFP質(zhì)粒是以piggyBac轉(zhuǎn)座質(zhì)粒為基礎(chǔ)，質(zhì)粒帶有Amp抗性基因以用于質(zhì)粒的擴(kuò)增和篩選，包含PiggyBac轉(zhuǎn)座子的2個(gè)轉(zhuǎn)座臂PBL和PBR，包含2個(gè)功能表達(dá)框，一個(gè)是A3啟動(dòng)子啟動(dòng)的綠色熒光蛋白基因表達(dá)框A3 Promoter+EGFP+SV40,以用作轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性家蠶的篩選標(biāo)志，另一個(gè)是家蠶絲膠蛋白1啟動(dòng)子、帶有便于提純外源蛋白的His接頭以及溶菌酶基因的表達(dá)框^51~1 Promoter +His吒LYZ+SV40，以表達(dá)溶菌酶， 輔助質(zhì)粒包含Amp抗性基因、piggyBac轉(zhuǎn)座子的1個(gè)轉(zhuǎn)座臂PBR、A3啟動(dòng)子啟動(dòng)的轉(zhuǎn)座酶 trans基因表達(dá)框A3 Promoter+ trans，以提供轉(zhuǎn)座酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種家蠶中部絲腺細(xì)胞合成分泌溶菌酶的方法，其特征在于所述的以絲膠蠶性狀為每代的留種篩選標(biāo)志，其篩選的時(shí)期是蠶繭時(shí)期。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種家蠶中部絲腺細(xì)胞合成分泌溶菌酶的方法。是先構(gòu)建家蠶合成分泌溶菌酶的載體pBSer1hLYZ-A3EGFP質(zhì)粒，再利用顯微注射轉(zhuǎn)基因家蠶技術(shù)將這種質(zhì)粒與能夠提供轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒一起導(dǎo)入到家蠶受精卵內(nèi)，依靠piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座特性，使綠色熒光蛋白基因和溶菌酶基因?qū)氲郊倚Q基因組內(nèi)，并得到穩(wěn)定遺傳和表達(dá)，從而創(chuàng)制成一種能夠在家蠶中部絲腺細(xì)胞特異性合成分泌溶菌酶的轉(zhuǎn)基因家蠶，并進(jìn)一步將這種轉(zhuǎn)基因家蠶與絲膠蠶雜交，將雜交后代再與絲膠蠶回交3-5代，最后再自交使溶菌酶基因純合，育成分泌溶菌酶的轉(zhuǎn)基因家蠶新品種，為提高溶菌酶的生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102226202SQ20111012358
公開日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2011年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月13日
發(fā)明者危浩, 莊蘭芳, 鐘伯雄 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)