專利名稱：檢測人乳頭狀瘤病毒亞型的熒光pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測病毒亞型的試劑盒，尤其涉及一種檢測人乳頭狀瘤病毒亞型 的熒光PCR試劑盒，屬于人乳頭狀瘤病毒亞型的檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人乳頭狀瘤病毒(Human Papillomavirus，簡稱HPV)屬于乳頭瘤病毒屬，和所有 乳頭瘤病毒屬病毒一樣，是一種特異性感染皮膚或粘膜復(fù)層上皮的病毒。目前，HPV已被發(fā) 現(xiàn)的亞型有接近兩百種，其中大部分感染人類后并沒有明顯癥狀表現(xiàn)，少數(shù)部分有病理表 現(xiàn)，有些會可引起人類疣，如生長在生殖器官附近皮膚和粘膜上的人類尋常疣、尖銳濕疣； 一些高危亞型會引起人類的腫瘤，某些情況下會導(dǎo)致宮頸癌、陰道癌、肛門癌、陰莖癌等。HPV是一種雙鏈DNA病毒，屬于乳多空病毒科，是一種嗜上皮性病毒，在人和動物 中分布廣泛，有高度的特異性，種間不存在交叉感染，其基因組長度約為8000bp，主要由早 期基因區(qū)(E區(qū))、晚期基因區(qū)(L區(qū))和長控制區(qū)((long control region, LCR)組成。E 區(qū)有6個開放式閱讀框(ORF)，即El, E2，E4，E5，E6，E7。HPV基因組高度變異，目前發(fā)現(xiàn)的HPV共有100余種基因型，按其感染部位可分為 兩種皮膚型與粘膜型，其中約有40多種能夠感染生殖腔。HPV感染人體后，會在宿主細(xì)胞 內(nèi)不斷復(fù)制，并將病毒基因嵌合入人體基因中，改變細(xì)胞的功能。經(jīng)過一段時間的演變，加 上周圍環(huán)境因素的影響，使細(xì)胞癌化。在年輕女性中，多數(shù)HPV感染者持續(xù)時間較短，對身體不會造成嚴(yán)重危害，一年內(nèi) 70%的感染者轉(zhuǎn)化為陰性，兩年內(nèi)90%的感染者轉(zhuǎn)化為陰性。然而，仍有5% -10%的感染 者持續(xù)感染，持續(xù)感染者高度危險，有很大可能發(fā)生宮頸癌癌前病變，進(jìn)一步會演變成侵入 性子宮頸癌。幸運的是，這個演變需要一定的時間，這段時間為診斷和治療提供了良好的時 機(jī)。在1995年的IARC專題討論會上確定了 HPV某些亞型長期和反復(fù)地感染HPV是 宮頸癌發(fā)生的主要原因。目前，人類把與宮頸癌發(fā)生有關(guān)的HPV亞型稱為高危亞型，有HPV 16，18，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，26，82，73 等；與腫瘤不相關(guān)的稱為低 危亞型，最常見的為HPV 6，11和44等。子宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，每年大約有50 萬左右的宮頸癌新發(fā)病例，占所有癌癥新發(fā)病例的5%，在中國每年約有8萬左右的女性死 于宮頸癌。HPV感染是宮頸癌的直接病因，從感染到最終宮頸癌的發(fā)生就大多數(shù)患者而言有 一個緩慢的潛伏期，為此，及時定期檢測宮頸脫落細(xì)胞中HPV的有無在宮頸癌的早期篩查、 輔助診斷和愈后評估等環(huán)節(jié)中顯得尤為重要。HPV感染通常是沒有癥狀的，HPV感染在人群中非常常見。據(jù)世衛(wèi)組織研究統(tǒng)計， 曾感染HPV的人數(shù)，在性活躍期男女中的比率為50%，到50歲該數(shù)字增加到80%，所以它 是世界上第一大傳染疾病。全世界每年有約10-15%的新發(fā)病例。雖然大部分婦女HPV感染期比較短，一般在8-10個月左右，但仍有大約10-15%的35歲以上的婦女有持續(xù)感染的 情況。這些持續(xù)感染HPV的婦女，患子宮頸癌的風(fēng)險更高。過去，因缺少高靈敏度和特異性 的HPV診斷試劑，大約70%的感染者在最初的兩年是無法檢測到HPV的。大部分感染了 HPV 的婦女將會發(fā)展為輕度宮頸損傷，而大多數(shù)輕度損傷都是可以自動恢復(fù)的。有研究表明約 有15%的HPV感染者將會在兩年內(nèi)發(fā)展為重度損傷，而重度宮頸損傷極有可能發(fā)展為惡性 癌變，有統(tǒng)計認(rèn)為大約1/3的重度宮頸損傷將在10年內(nèi)(而最近在很多案例中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)癌速 度可以短至三年內(nèi))發(fā)展為癌癥。在診斷及防治這方面仍然缺乏有效的措施。對HPV病毒感染進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測可提高宮頸癌前病變篩查的敏感性，同時改善婦 女宮頸癌的防治。宮頸癌早期癥狀不明顯，篩查預(yù)警對早期發(fā)現(xiàn)宮頸癌，降低死亡率極為重 要。傳統(tǒng)上，宮頸涂片檢測是群體篩查的常規(guī)手段，屬于細(xì)胞學(xué)檢測方法。實驗室的技術(shù)人 員會于顯微鏡下觀察不正常的細(xì)胞以診斷病人的病情，但由于這方法只以觀察作為診斷基 礎(chǔ)，受取材、涂片制作質(zhì)量、閱片技術(shù)影響，其準(zhǔn)確率低，假陰性高，重復(fù)性差，得到的結(jié)果及 分析漏診率可達(dá)30%。在檢查和篩選HPV的基因型方法中，實時熒光PCR法及雜交捕獲法 是最為常用的，但是實時熒光PCR法所需要的設(shè)備比較昂貴，而且其對于不同種基因型HPV 的診斷操作繁瑣，不適合于對子宮頸癌的大規(guī)模篩查。商業(yè)化的雜交捕獲法試劑盒無須PCR 擴(kuò)增即可檢測出臨床樣品中的HPV DNA，并且可區(qū)別高危型和低危型兩類，但是此類試劑盒 無法鑒定出感染HPV的具體基因型。最近的分型與臨床的結(jié)合研究已經(jīng)證實不同的HPV亞 型及其載量的不同在致癌性方面存在比較大的差別，這些數(shù)據(jù)用于診斷結(jié)合臨床治療至為 重要，因此有必要對各個宮頸樣本中存在的HPV進(jìn)行分型定量檢測，從而有助于更詳細(xì)的 分析各種HPV的致病性，以達(dá)到最佳的臨床療效。人乳頭狀瘤病毒(HPV)是引起宮頸癌及癌前病變的必要因素，宮頸癌的篩查是降 低宮頸癌發(fā)病率最經(jīng)濟(jì)有效的方法，HPV的檢測已是宮頸癌早期篩查的一個重要方面。許 多研究支持將HPV檢測傳統(tǒng)的巴氏涂片結(jié)合，HPV檢測陽性可作為細(xì)胞學(xué)檢查ASCUS結(jié)果 行陰道鏡檢查的指征，在一定程度上減少重復(fù)細(xì)胞學(xué)檢查，減少陰道鏡檢查，減少在隨診中 高危人群的丟失。此外，HPVDNA檢測可以預(yù)示治療后病變殘存和復(fù)發(fā)的高?；颊?，同時血 清HPVDNA可能成為宮頸癌治療后的病情監(jiān)測的有效腫瘤標(biāo)志物。因此，HPV檢測的臨床意 義不容忽視。HPV的檢測作為宮頸癌的篩查已逐漸向臨床推廣，但是不同的HPV型別有不同的 致病能力，所以發(fā)展HPV基因型的分型方法越來越重要。目前HC-II法是唯一通過FDA批 準(zhǔn)的可在臨床使用的一種檢測HPV DNA的技術(shù)，但他不能對HPV進(jìn)行具體分型，而且存在交 叉雜交的問題。多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)不僅可以檢測具體型別還可以檢測所有型別，是一 個有較大的發(fā)展前景的方法。針對現(xiàn)有方法的缺點和不足，通過不斷的努力，將各種檢測方 法有機(jī)結(jié)合，取長補(bǔ)短，相信在不久的將來會產(chǎn)生簡單、快速、方便、價廉，且敏感性、特異性 很高的HPV檢測方法應(yīng)用于宮頸癌的篩查中。以熒光標(biāo)記探針為基礎(chǔ)的實時熒光PCR技術(shù)，在目前國內(nèi)的臨床診斷中應(yīng)用最為 廣泛。在探針法的實時熒光PCR反應(yīng)體系中，根據(jù)所檢測病原體的多少，還可以分為單重或 多重實時熒光PCR技術(shù)，反應(yīng)體系中往往包括一對或多對特異性PCR引物及探針，通過研發(fā) 過程中的條件摸索，探針及引物只與相對應(yīng)的模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點在兩條引物 之間。探針的5'端標(biāo)記有報告基團(tuán)(R印orter，R)，如FAM、VIC、R0X等，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher，Q)，如BHQ1、BHQ2、TAMRA等。當(dāng)探針完整的時候，報告基團(tuán)所發(fā)射的 熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中遇 到與模板結(jié)合的探針，其3' -5'外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基 團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號。所以，每經(jīng)過一個PCR循環(huán)，熒光信號也和目的片 段一樣，有一個同步指數(shù)增長的過程。采用實時熒光PCR技術(shù)檢測HPV各亞型的關(guān)鍵是需要設(shè)計出能夠特異、靈敏的檢 測出各亞型的PCR引物及探針。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種能夠準(zhǔn)確的檢測出人乳頭狀瘤病毒各種亞型的熒 光PCR試劑盒，該試劑盒具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點。本發(fā)明的主要目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種檢測人乳頭狀瘤病毒各種亞型的熒光PCR試劑盒，包括以下各組分PCR反應(yīng) 液，探針或由探針與引物組成的混合液，細(xì)胞裂解液，雙蒸水和陽性參考品；其中，所述的探 針或由探針與引物組成的混合液包括以下8種反應(yīng)液用于檢測人乳頭狀瘤病毒16/18/31 亞型的A反應(yīng)液；用于檢測人乳頭狀瘤病毒59/66/53亞型的B反應(yīng)液；用于檢測人乳頭狀 瘤病毒33/58/45亞型的C反應(yīng)液；用于檢測人乳頭狀瘤病毒亞型56/52/35的D反應(yīng)液； 用于檢測人乳頭狀瘤病毒68/51/39亞型的E反應(yīng)液；H反應(yīng)液；用于檢測人乳頭狀瘤病毒 82/73/26亞型的F反應(yīng)液；用于檢測人乳頭狀瘤病毒6/11/81亞型的G反應(yīng)液。其中，A反應(yīng)液由 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ IDNo. 4、SEQ ID No. 5,SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7所示的核苷酸組成；其中，SEQ ID No. 3的5'端標(biāo)記有 FAM熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基團(tuán)，SEQ ID No. 4的5'端標(biāo)記有HEX熒 光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基團(tuán)，SEQ ID No. 7的5'端標(biāo)記有ROX熒光報告 基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQ2熒光淬滅基團(tuán)；C 反應(yīng)液由 SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10、SEQ IDNo. 11、SEQ ID No. 12,SEQ ID No. 13和SEQ ID No. 14所示的核苷酸組成；其中，SEQ ID No. 10的5'端標(biāo) 記有FAM熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基團(tuán)，SEQ ID No. 11的5'端標(biāo)記有 HEX熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基團(tuán)，SEQ ID No. 14的5'端標(biāo)記有ROX熒 光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQ2熒光淬滅基團(tuán)；E 反應(yīng)液由 SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 17、SEQ IDNo. 18、SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 20、SEQ ID No. 21、SEQ ID No. 22 和 SEQ ID No. 23 所示的核苷酸組成； 其中，SEQ ID No. 17的5'端標(biāo)記有FAM熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基團(tuán)； SEQ ID No. 18的5'端標(biāo)記有ROX熒光報告基團(tuán)，3‘端標(biāo)記有BHQ2熒光淬滅基團(tuán)；SEQ ID No. 19的5'端標(biāo)記有ROX熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQ2熒光淬滅基團(tuán)；SEQID No. 23的 5'端標(biāo)記有HEX熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基團(tuán)；D 反應(yīng)液由 SEQ ID No. 24、SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 26、SEQ IDNo. 27、SEQ ID No. 28、SEQ ID No. 29、SEQ ID No. 30 和 SEQ ID No. 31 所示的核苷酸組成，其中，SEQ ID No. 26的5'端標(biāo)記有FAM熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基團(tuán)；SEQ ID No. 29 的5'端標(biāo)記有HEX熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基團(tuán)；SEQ ID No.31的5'端標(biāo)記有ROX熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQ2熒光淬滅基團(tuán)；B 反應(yīng)液由 SEQ ID No. 32、SEQ ID No. 33、SEQ ID No. 34、SEQ IDNo. 35、SEQ ID No. 36、SEQ ID No. 37、SEQ ID No. 38、SEQ ID No. 39 和 SEQ ID No. 40 所示的核苷酸組成， 其中，SEQ ID No. 34的5'端標(biāo)記有FAM熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基團(tuán)； SEQ ID No. 37的5'端標(biāo)記有HEX熒光報告基團(tuán)，3‘端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基團(tuán)；SEQ ID No. 40的5'端標(biāo)記有ROX熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQ2熒光淬滅基團(tuán)；H反應(yīng)液SEQ ID No. 4USEQ ID No. 42和SEQ ID No. 43所示的核苷酸組成，其中， SEQ ID No. 43的5'端標(biāo)記有FAM熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基團(tuán)；F 反應(yīng)液由 SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 45、SEQ ID No. 46、SEQ IDNo. 47、SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 49、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 51 和 SEQ ID No. 52 所示的核苷酸組成， 其中，SEQ ID No. 44的5'端標(biāo)記有HEX熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基團(tuán)； SEQ ID No. 49的5'端標(biāo)記有ROX熒光報告基團(tuán)，3‘端標(biāo)記有BHQ2熒光淬滅基團(tuán)；SEQ ID No.52的5'端標(biāo)記有FAM熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基團(tuán)；G 反應(yīng)液由 SEQ ID No. 53、SEQ ID No. 54、SEQID No. 55、SEQ IDNo. 56、SEQ ID No. 57、SEQ ID No. 58、SEQ ID No. 59、SEQ ID No. 60 和 SEQ ID No. 61 所示的核苷酸組成， 其中，SEQ ID No. 55的5'端標(biāo)記有FAM熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基團(tuán)； SEQ ID No. 58的5'端標(biāo)記有HEX熒光報告基團(tuán)，3‘端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基團(tuán)；SEQ ID No. 61的5'端標(biāo)記有ROX熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQ2熒光淬滅基團(tuán)；所述的PCR反應(yīng)液包括Taq DNA聚合酶、10 X PCR緩沖液、Mg2+、dNTPs和UNG酶； 各成分均購自普洛麥格(promega)公司；所述陽性參考品為HPV73亞型質(zhì)粒；陽性參考品原濃度質(zhì)粒購自上海捷瑞生物工 程有限公司；所述細(xì)胞裂解液的主要組成成分為EDTA和Tris-HCl ；購自西格瑪(SIGMA)公司；本發(fā)明試劑盒需采用各種市售的熒光定量PCR儀進(jìn)行分析和檢測，所述的熒光定 量PCR儀可以是ABI 系列熒光定量PCR儀、BIORADiCycler、Roche 4800,Qiagen Rotor Gene寸。本發(fā)明試劑盒對檢測樣本的要求宮頸脫落細(xì)胞。樣本采集后應(yīng)及時檢測，也可一 20°C保存待測，保存期一般不超過4個月，長期保存請置于-70°C。樣本避免反復(fù)凍融，采用 干冰或冰袋低溫運輸。作為一個具體的實施方案，本發(fā)明所述試劑盒的組成見表1和表2。表 權(quán)利要求
1.一種檢測人乳頭狀瘤病毒21種亞型的熒光PCR試劑盒，包括以下各組分PCR反應(yīng) 液，由探針與引物組成的混合液，細(xì)胞裂解液，陰性參考品和陽性參考品；其中，所述的探針 或由探針與引物組成的混合液包括以下8種反應(yīng)液用于檢測人乳頭狀瘤病毒16/18/31 亞型的A反應(yīng)液；用于檢測人乳頭狀瘤病毒59/66/53亞型的B反應(yīng)液；用于檢測人乳頭狀 瘤病毒33/58/45亞型的C反應(yīng)液；用于檢測人乳頭狀瘤病毒亞型56/52/35的D反應(yīng)液； 用于檢測人乳頭狀瘤病毒68/51/39亞型的E反應(yīng)液；H反應(yīng)液；用于檢測人乳頭狀瘤病毒 82/73/26亞型的F反應(yīng)液；用于檢測人乳頭狀瘤病毒6/11/81亞型的G反應(yīng)液。
2.按照權(quán)利要求1所述的熒光PCR試劑盒，其特征在于所述A反應(yīng)液由SEQID No. 1、 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ IDNo. 5、SEQ ID No. 6 和 SEQ ID No. 7 所示 的核苷酸組成；其中，SEQ ID No.3的5'端標(biāo)記有FAM熒光報告基團(tuán)，3 ‘端標(biāo)記有BHQl熒 光淬滅基團(tuán)，SEQID No. 4的5'端標(biāo)記有HEX熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基 團(tuán)，SEQ ID No. 7的5'端標(biāo)記有ROX熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQ2熒光淬滅基團(tuán)。
3.按照權(quán)利要求1所述的熒光PCR試劑盒，其特征在于所述C反應(yīng)液由SEQID No. 8、 SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11、SEQ IDNo. 12、SEQ ID No. 13 和 SEQ ID No. 14 所示的核苷酸組成；其中，SEQ IDNo. 10的5'端標(biāo)記有FAM熒光報告基團(tuán)，3 ‘端標(biāo)記有 BHQl熒光淬滅基團(tuán)，SEQ ID No. 11的5'端標(biāo)記有HEX熒光報告基團(tuán)，3‘端標(biāo)記有BHQl熒 光淬滅基團(tuán)，SEQ ID No. 14的5'端標(biāo)記有ROX熒光報告基團(tuán)，3 ‘端標(biāo)記有BHQ2熒光淬滅 基團(tuán)。
4.按照權(quán)利要求1所述的熒光PCR試劑盒，其特征在于所述E反應(yīng)液由SEQID No. 15、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 18、SEQ IDNo. 19、SEQ ID No. 20、SEQ ID No. 2USEQ ID No. 22和SEQ ID No. 23所示的核苷酸組成；其中，SEQ ID No. 17的5'端標(biāo) 記有FAM熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基團(tuán)；SEQ ID No. 18的5'端標(biāo)記有 ROX熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQ2熒光淬滅基團(tuán)；SEQ ID No. 19的5'端標(biāo)記有ROX熒 光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQ2熒光淬滅基團(tuán)；SEQ ID No. 23的5'端標(biāo)記有HEX熒光報告 基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基團(tuán)。
5.按照權(quán)利要求1所述的熒光PCR試劑盒，其特征在于所述D反應(yīng)液由SEQID No. 24、SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 26、SEQ ID No. 27、SEQ IDNo. 28、SEQ ID No. 29、SEQ ID No. 30和SEQ ID No. 31所示的核苷酸組成，其中，SEQ ID No. 26的5'端標(biāo)記有FAM熒光 報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基團(tuán)；SEQ ID No. 29的5'端標(biāo)記有HEX熒光報告基 團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基團(tuán)；SEQ ID No. 31的5'端標(biāo)記有ROX熒光報告基團(tuán)，3' 端標(biāo)記有BHQ2熒光淬滅基團(tuán)。
6.按照權(quán)利要求1所述的熒光PCR試劑盒，其特征在于所述B反應(yīng)液由SEQID No. 32、SEQ ID No. 33、SEQ ID No. 34、SEQ ID No. 35、SEQ IDNo. 36、SEQ ID No. 37、SEQ ID No. 38,SEQ ID No. 39和SEQ ID No. 40所示的核苷酸組成，其中，SEQ ID No. 34的5'端標(biāo) 記有FAM熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基團(tuán)；SEQ ID No. 37的5'端標(biāo)記有 HEX熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基團(tuán)；SEQ ID No. 40的5'端標(biāo)記有ROX熒 光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQ2熒光淬滅基團(tuán)。
7.按照權(quán)利要求1所述的熒光PCR試劑盒，其特征在于所述H反應(yīng)液SEQID No. 41、 SEQ ID No. 42和SEQ ID No. 43所示的核苷酸組成，其中，SEQ ID No. 43的5'端標(biāo)記有FAM熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基團(tuán)。
8.按照權(quán)利要求1所述的熒光PCR試劑盒，其特征在于所述F反應(yīng)液由SEQID No. 44、SEQ ID No. 45、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 47、SEQID No. 48、SEQ ID No. 49、SEQ ID No. 50,SEQ ID No. 51和SEQ ID No. 52所示的核苷酸組成，其中，SEQ ID No. 44的5'端標(biāo) 記有HEX熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基團(tuán)；SEQ ID No. 49的5'端標(biāo)記有 ROX熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQ2熒光淬滅基團(tuán)；SEQ ID No. 52的5'端標(biāo)記有FAM熒 光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基團(tuán)。
9.按照權(quán)利要求1所述的熒光PCR試劑盒，其特征在于所述G反應(yīng)液由SEQID No. 53、SEQ ID No. 54、SEQ ID No. 55、SEQ ID No. 56、SEQ IDNo. 57、SEQ ID No. 58、SEQ ID No. 59,SEQ ID No. 60和SEQ ID No. 61所示的核苷酸組成，其中，SEQ ID No. 55的5'端標(biāo) 記有FAM熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基團(tuán)；SEQ ID No. 58的5'端標(biāo)記有 HEX熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQl熒光淬滅基團(tuán)；SEQ ID No. 61的5'端標(biāo)記有ROX熒 光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有BHQ2熒光淬滅基團(tuán)。
10.按照權(quán)利要求1所述的熒光PCR試劑盒，其特征在于所述的PCR反應(yīng)液包括Taq DNA聚合酶、10 XPCR緩沖液、Mg2+、dNTPs和UNG酶；所述陽性參考品為人乳頭狀瘤病毒73 亞型質(zhì)粒；所述細(xì)胞裂解液的主要組成成分為EDTA和Tris-HCl。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測人乳頭狀瘤病毒21種亞型的熒光PCR試劑盒，包括以下各組分PCR反應(yīng)液，探針與特異性引物組成的混合液，細(xì)胞裂解液，陰性參考品和陽性參考品。特異性和靈敏性實驗表明，本發(fā)明試劑盒能夠準(zhǔn)確的從待測樣品中檢測出人乳頭狀瘤病毒的21種亞型，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK102140554SQ20111008760
公開日2011年8月3日 申請日期2011年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月8日
發(fā)明者劉中華, 孔祥賓, 張旭, 張蓉 申請人:江蘇碩世生物科技有限公司