一種檢測(cè)化合物對(duì)人Ⅰ型PI3Ks抑制活性的方法

專利名稱：一種檢測(cè)化合物對(duì)人Ⅰ型PI3Ks抑制活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明 涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及檢測(cè)化合物對(duì)人I型PI3K抑制活性的方法。
背景技術(shù)：
在腫瘤治療領(lǐng)域，分子靶向藥物的開(kāi)發(fā)是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)之一。PI3Ks(磷脂酰肌醇3-激酶)被認(rèn)為是一個(gè)有效的治療靶分子，在人類中有I、II、III三類共8個(gè)亞型的同工酶，其中與腫瘤發(fā)生發(fā)展最為密切的是I型PI3K的四個(gè)亞型。因此，開(kāi)發(fā)出針對(duì)這四個(gè)亞型的有效的單一的抑制劑有可能提高療效、降低毒性，是目前國(guó)際上各大研究機(jī)構(gòu)和制藥公司研發(fā)的熱點(diǎn)領(lǐng)域和前沿領(lǐng)域。人I型PI3K為異源二聚體，由一個(gè)調(diào)節(jié)亞基和一個(gè)催化亞基組成。調(diào)節(jié)亞基含有SH2和SH3結(jié)構(gòu)域，與含有相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)的靶蛋白相作用。該亞基通常稱為p85，參考于第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的亞型(isotype),然而目前已知的6種調(diào)節(jié)亞基,大小從50至IlOkDa不等。催化亞基有4種，即I型PI3K的四個(gè)亞型ρ110α、ρ110β、ρ110 δ和pllO Y，其中pllO δ僅限于白細(xì)胞，其余則廣泛分布于各種細(xì)胞中。ΡΙ3Κ抑制劑體外活性檢測(cè)是藥物研發(fā)過(guò)程中非常關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)，主要包括分子水平和細(xì)胞水平活性檢測(cè)。在分子水平的檢測(cè)方法有多種，包括基于ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)、突光偏振(fluorescence polarization)、TRFRET(時(shí)間分辨的突光共振能量轉(zhuǎn)
移)、AlphaScreen (美國(guó)珀金埃爾默公司專利技術(shù))、HTRF (均相時(shí)間分辨熒光)等平臺(tái)的競(jìng)爭(zhēng)性活性檢測(cè)方法和基于檢測(cè)ATP (腺嘌呤核苷三磷酸)或ADP (腺嘌呤核苷二磷酸)含量的通用型ATP酶檢測(cè)方法以及基于同位素標(biāo)記的檢測(cè)方法或者應(yīng)用熒光標(biāo)記底物的方法等。在細(xì)胞水平活性檢測(cè)包括用PI3K下游Akt (—種信號(hào)蛋白，亦稱為蛋白激酶B)的磷酸化改變來(lái)顯示化合物對(duì)人PI3K的泛抑制活性和利用不同細(xì)胞因子作用于不同的細(xì)胞觀察由此產(chǎn)生的不同下游細(xì)胞效應(yīng)來(lái)指示化合物對(duì)人I型PI3K的四個(gè)亞型的抑制活性。在對(duì)這些方法的研究和實(shí)踐過(guò)程中，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)首先，分子水平的檢測(cè)方法中，競(jìng)爭(zhēng)性方法包括酶反應(yīng)過(guò)程和產(chǎn)物競(jìng)爭(zhēng)過(guò)程兩個(gè)步驟，較為繁瑣；而基于檢測(cè)ATP或ADP含量的方法對(duì)參與反應(yīng)的酶純度要求高以減低背景提高信噪比；同位素的應(yīng)用則對(duì)人體有實(shí)質(zhì)性或潛在的傷害；熒光標(biāo)記底物需要最終分離產(chǎn)物和底物，這需要依賴于特定的機(jī)器，價(jià)格昂貴。其次，細(xì)胞水平活性檢測(cè)中，常用的以Akt磷酸化作為指標(biāo)的方法只能顯示泛抑制效果而無(wú)法區(qū)分化合物對(duì)I型PI3Ks的四個(gè)亞型的選擇性；而利用不同細(xì)胞因子作用于不同的細(xì)胞觀察由此產(chǎn)生的不同下游細(xì)胞效應(yīng)來(lái)指示化合物對(duì)人I型PI3Ks的四個(gè)亞型的抑制活性的方法需要依賴于上游細(xì)胞因子，其觀察指標(biāo)亦不統(tǒng)一，平行比較性欠佳。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種可以檢測(cè)化合物對(duì)人I型PI3K抑制活性的方法，該方法能夠在分子水平和/或細(xì)胞水平觀察化合物對(duì)人I型PI3K四個(gè)亞型的單一抑制效果。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)目的，提供了一種檢測(cè)化合物對(duì)人I型PI3K抑制活性的方法，該方法包括(I)使用激酶體外反應(yīng)體系在分子水平測(cè)定化合物對(duì)人I型PI3K的四種亞型的抑制活性，其中，使用生物素標(biāo)記的磷脂酰肌醇_4，5- 二磷酸作為底物進(jìn)行體外反應(yīng)；和/或(2)構(gòu)建Grpl-PH-EGFP高表達(dá)細(xì)胞株以綠色熒光在細(xì)胞膜上聚集程度為指標(biāo)在細(xì)胞水平檢測(cè)化合物對(duì)人I型PI3K的抑制活性；和/或(3)構(gòu)建表達(dá)持續(xù)活化的人I型ΡΙ3Κα、ΡΙ3Κ β、ΡΙ3Κ Y和ΡΙ3Κ δ的各亞型細(xì)胞株，以磷酸化的Akt為指標(biāo)，在細(xì)胞水平檢測(cè)所述化合物對(duì)人I型ΡΙ3Κ各亞型的選擇性。該方法中，步驟(I)中，所述人I型ΡΙ3Κ可以是純化的人I型ΡΙ3Κ的分子亞型ΡΙ3Κα、ΡΙ3Κβ、ΡΙ3ΚΥ和ΡΙ3Κ δ中的任一種，并且采用ELISA方法測(cè)定所述體外反應(yīng)的產(chǎn)物。所述生物素標(biāo)記的磷脂酰肌醇_4，5-二磷酸可以從美國(guó)Cayman Chemical公司購(gòu)買。所述激酶體外反應(yīng)體系可以由緩沖劑PH6. 5的M0PS(3-(N-嗎啡啉)丙磺酸)，ATP及激酶PI3K、MgCl2 (氯化鎂)、NaCl (氯化鈉)、NaCholate (膽酸鈉)、DTT ( 二硫蘇糖醇)，底物生物素標(biāo)記的磷脂酰肌醇_4，5- 二磷酸組成。步驟(2)中，所述的在細(xì)胞水平檢測(cè)化合物對(duì)人I型PI3K抑制活性，主要為在Grpl-PH-EGFP高表達(dá)細(xì)胞株處于無(wú)上游信號(hào)激活PI3K時(shí)先用所述化合物對(duì)其作用再通過(guò)細(xì)胞因子激活人I型PI3K，以EGFP所產(chǎn)生的綠色熒光在細(xì)胞膜表面聚集程度來(lái)指示化合物對(duì)PI3K的抑制活性。具體包括(2-1)使用Rh30(人橫紋肌肉瘤細(xì)胞株)構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)GrpI-PH-EGFP蛋白的細(xì)胞株，命名為Rh30-Grpl-PH-EGFP，將這種細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)；(2-2)將步驟(2-1)中所述的細(xì)胞貼壁過(guò)夜后換無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，去除上游信號(hào)對(duì)內(nèi)源性PI3K激活的干擾；(2-3)加入待測(cè)化合物處理細(xì)胞之后，再通過(guò)細(xì)胞因子激活人I型PI3K ;以及(2-4)觀察EGFP所產(chǎn)生的綠色熒光信號(hào)。其中，步驟(2-1)中所述的Rh30-Grp I-PH-EGFP的構(gòu)建，具體包括將含有Grpl-PH和熒光蛋白融合序列的質(zhì)粒(如質(zhì)粒pEGFP-Cl-Grpl-PH)轉(zhuǎn)入Rh30細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)篩選(如通過(guò)G418 (遺傳霉素)進(jìn)行篩選)得到單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株Rh30-GrpI-PH-EGFP。步驟(2-3)進(jìn)一步包括采用4%的多聚甲醛室溫固定細(xì)胞。步驟(3)中，所述的在細(xì)胞水平檢測(cè)化合物對(duì)人I型PI3K各亞型的選擇性，主要為應(yīng)用持續(xù)活化的人I型PI3K高表達(dá)的細(xì)胞株在無(wú)上游信號(hào)激活內(nèi)源性PI3K時(shí)，以磷酸化的Akt為指標(biāo)檢測(cè)化合物的抑制活性。具體包括(3-1)分別構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)氮端或碳端融合了豆蘧?；蛄谢蚍峄蛄械娜薖llOa、PllO β、PllO Y或PllO δ的Rh30細(xì)胞株，使之成為表達(dá)持續(xù)活化的人I型ΡΙ3Κ的細(xì)胞株，將這四種細(xì)胞分別接種于細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)；(3-2)使步驟(3-1)中所述的細(xì)胞貼壁過(guò)夜后換無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)，去除上游信號(hào)對(duì)內(nèi)源性PI3K激活的干擾；(3-3)加入待測(cè)化合物處理細(xì)胞之后，裂解細(xì)胞；以及(3-4)用Western blot (蛋白質(zhì)印跡)的方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)對(duì)Akt的磷酸化的影響。
其中，步驟3-1)中所述的表達(dá)持續(xù)活化的人I型PI3K的細(xì)胞株為豆蘧?；蛄腥诤显谌薎型PI3K的PllOa、PllO β、PllO Y或PllO δ的氮端的Rh30細(xì)胞，或者法尼基化序列融合在人I型PI3K的PllO a、PllO β、PllO Y或PllO δ的碳端的Rh30細(xì)胞。所述穩(wěn)定表達(dá)氮端或碳端融合了豆蘧?；蛄谢蚍峄蛄械娜薖llO a、Pl 10 β、Pl 10 Y或PllO δ的Rh30細(xì)胞株的建立，具體包括a.豆蘧酰化序列融合在人I型PI3K的催化亞基PllOa、PllO β、PllO Y或PllO δ 的氮端的 Rh30 細(xì)胞(即 Rh30-Myr-P110 a、Rh30_Myr_P110 β、Rh30_Myr_P110 γ 和Rh30-Myr-P110S)，其構(gòu)建過(guò)程是:分別在 PllO α、Ρ110β、Ρ110γ 和 PllO δ 的 ORF (開(kāi)放閱讀框)5’ 端加入豆蘧?；瘔A基序列 5’ -ATGGGGTCTTCAAAATCTAAACCAAAGGACCCCAGCCAGCGCCGGCGCAGAATCCGAGGT-3’ 及標(biāo)簽序列(如 HA (血凝素)標(biāo)簽序列 5’ -ACCCATACGACGTGCCA
GATTACGCC-3’ )后，分別插入到載體(例如pBabe-Puro質(zhì)粒)中，然后與質(zhì)粒pE-ampho、PGP共轉(zhuǎn)入293FT細(xì)胞獲取病毒，用該病毒感染Rh30細(xì)胞后再通過(guò)篩選(如通過(guò)嘌呤霉素篩選)得到目的細(xì)胞株，所得細(xì)胞株分別命名為Rh30-Myr-P110 α、Rh30-Myr_P110 β、Rh30-Myr-P110 γ 和 Rh30_Myr_P110 δ ;以及b.法尼基化序列融合在人I型ΡΙ3Κ的PllOa、PllO β、PllO Y或PllO δ的碳端的 Rh30 細(xì)胞(即 Rh30-P110a-CAAX、Rh30_P110 β-CAAX、Rh30-Pl 10 y-CAAX 和他30- 110 6-044乂)，其構(gòu)建過(guò)程是分別在？110 0、？110 0、？110丫和 PllO δ 的 ORF 3’端去掉終止密碼子并加入標(biāo)簽序列(如HA標(biāo)簽序列5’-ACCCATACGACGTGCCAGATTACGCC-3’)和法尼基化序列 5’ -CAGCATGCTTTGAACGAGCTCGGCGCCTCCAAAGATGGCAAAAAGAAGAAGAAGAAGTCCAAGACCAAGTGCGTGATCATGTGA-3 ’或 5 ’ -CAGCATGCTTTGAACGAGCTCGGGGGCGCCAGCGGCCCCGGCTGCATGAGCTGCAAGTGCGTGCTGAGCTGA-3’ 后，分別插入到載體(例如 pBabe-Puro 質(zhì)粒)中，然后與質(zhì)粒pE-ampho、pGP共轉(zhuǎn)入293FT細(xì)胞獲取病毒，用該病毒感染Rh30細(xì)胞后再通過(guò)篩選(如通過(guò)嘌呤霉素篩選)得到目的細(xì)胞株，所得細(xì)胞株分別命名為Rh30-P110 a -CAAX、Rh30-P110 β -CAAX、Rh30_P110 y -CAAX 和 Rh30_P110 δ -CAAX。優(yōu)選地，豆蘧?；蛄腥诤显谌薎型PI3K的PllOa、Ρ110β、Ρ110γ或ΡΙΙΟδ的氮端。由于每種細(xì)胞株只高表達(dá)人I型ΡΙ3Κ四種亞型中的一種亞型的豆蘧?；蛄谢蚍峄蛄腥诤系鞍仔问?，因此可以獨(dú)立觀察化合物對(duì)每個(gè)亞型的抑制效果。本發(fā)明中，由于分子反應(yīng)中采用的底物是之前未有報(bào)道過(guò)的生物素標(biāo)記的磷脂酰肌醇_4，5- 二磷酸，產(chǎn)物可以用ELISA法直接檢出，因此不需要競(jìng)爭(zhēng)過(guò)程，沒(méi)有同位素的應(yīng)用，產(chǎn)物也不需要分離就可以直接被檢出，在一定程度上克服了激酶純度不高帶來(lái)的高背景的缺點(diǎn)，操作也更方便快捷安全。本發(fā)明中，在細(xì)胞水平上，Rh30-Grp I-PH-EGFP細(xì)胞株中Grpl-PH (generalreceptor for phosphoinositides I-Pleckstrin homology domain,憐月旨酉先肌酉享 I 一般受體的普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域)對(duì)PI3K的直接產(chǎn)物PIP3 (磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸)具有高特異的親和力，因此融合蛋白Grpl-PH-EGFP可以指示細(xì)胞內(nèi)PIP3的位置和含量，以EGFP (增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)所產(chǎn)生的綠色熒光在細(xì)胞膜表面聚集程度來(lái)指示化合物對(duì)PI3K的抑制活性，比用其它下游信號(hào)效應(yīng)分子作為指標(biāo)更能直接的體現(xiàn)對(duì)PI3K的抑制活性。
本發(fā)明中，當(dāng)豆蘧酰化序列或法尼基化序列融合在人I型PI3K的各pllO催化亞基(ΡΙΙΟα、Ρ110β、Ρ110γ和ΡΙΙΟδ)的氮端或碳端并高表達(dá)于哺乳細(xì)胞內(nèi)時(shí)，可以體現(xiàn)出其持續(xù)活化的狀態(tài)，即這種細(xì)胞株無(wú)需上游信號(hào)激活就可以體現(xiàn)出ΡΙ3Κ活性。而Akt被證明是響應(yīng)ΡΙ3Κ活性的一個(gè)很好的信號(hào)分子，響應(yīng)方式是Akt的磷酸化，所以用磷酸化Akt為作為統(tǒng)一指標(biāo)指示化合物對(duì)人I型ΡΙ3Κ的抑制活性，平行比較性更好。本發(fā)明提供的檢測(cè)化合物對(duì)人I型ΡΙ3Κ抑制活性的方法可以系統(tǒng)的定性定量地顯示化合物在分子和細(xì)胞水平對(duì)人I型ΡΙ3Κ的抑制活性以及對(duì)人I型ΡΙ3Κ各個(gè)亞型的選擇性，同時(shí)也可以用于ΡΙ3Κ抑制劑高通量的化合物篩選。


圖I是顯示本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中使用激酶反應(yīng)體系在分子水平上檢測(cè)ΡΙ3Κ抑制劑ΡΙ103對(duì)ΡΙ3Κα的抑制效果的圖。圖2是顯示本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中用ΡΙ3Κ抑制劑處理無(wú)上游信號(hào)激活ΡΙ3Κ時(shí)表 達(dá)Grpl-PH-EGFP的Rh30細(xì)胞后在受到IGF-I刺激后細(xì)胞內(nèi)綠色熒光在膜上的聚集程度的圖。圖3是顯示本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中PI3K抑制劑對(duì)四個(gè)表達(dá)持續(xù)活化的人I型PI3K細(xì)胞株Rh30內(nèi)磷酸化Akt的影響的圖。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分優(yōu)選的實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明實(shí)施例提供一種檢測(cè)化合物對(duì)人I型PI3KS酶抑制活性的方法，能夠在分子和細(xì)胞水平考察化合物對(duì)人I型PI3Ks的四個(gè)亞型的抑制效果，以下分別進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例實(shí)驗(yàn)材料及儀器材料含PllO α 和 P85 α 的質(zhì)粒(pBabe puro HA PIK3CA 和 pBV human p85alpha (HA tag))購(gòu)自美國(guó) Addgene 組織，含 PllO β 的質(zhì)粒(pBabe puro HA PIK3CB)由美國(guó)哈佛大學(xué)Thomas M. Roberts教授提供，含PllO Y或ΡΙΙΟδ的質(zhì)粒(pBSFI-ΡΙΙΟγ和pBSFI-PllO δ )由美國(guó)Peter K. Vogt教授提供，質(zhì)粒pEGFP_Cl-Grpl_PH由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院的Tamas Balla教授贈(zèng)送,質(zhì)粒pE-ampho、pGP購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，質(zhì)粒pGEX 4T-1為GEHealthcare公司產(chǎn)品，質(zhì)粒pFastBacHTB、昆蟲(chóng)細(xì)胞T. ni和轉(zhuǎn)染試劑lipofect amine 2000購(gòu)自美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司，PBS(磷酸緩沖液)購(gòu)自上海迪生生物有限公司，BSA(牛血清白蛋白)等常規(guī)試劑購(gòu)自上海生工。遺傳霉素和嘌呤霉素購(gòu)自applied chemical 公司，化合物 PI103 (CAS :371935-74-9)、TGX_221(CAS :663619-89-4)和 AS604850(CAS :648449-76-7)購(gòu)自美國(guó) Cayman Chemical 公司，⑶C0941(CAS :957054-30-7)和 IC87114(CAS :371242-69-2)購(gòu)自 Symansis 公司。RPMI 1640 等細(xì)胞培養(yǎng)基及所用血清均購(gòu)自美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司。Glutathione Sepharose 4B Beads ( —種蛋白純化用顆粒)為GE Healthcare公司產(chǎn)品，Ni-NTA Superflow( 一種蛋白純化用顆粒)為美國(guó)Qiagen公司產(chǎn)品，細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物(Yeast Extract)、胰蛋白胨(Trypton)為Oxoid公司(Hampshire, England)產(chǎn)品，大腸桿菌B121為北京鼎國(guó)生物公司產(chǎn)品。HRP標(biāo)記的抗GST抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，TMB購(gòu)自碧云天公司，IGF-I (生長(zhǎng)因子I)購(gòu)自美國(guó)R&D systems公司。Rh30細(xì)胞為美國(guó)St. Jude兒童研究醫(yī)學(xué)院來(lái)源，293FT細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司。本發(fā)明中所涉及的核苷酸序列的合成均由上海生工完成。儀器細(xì)胞培養(yǎng)用超凈工作臺(tái)是美國(guó)Heal force公司產(chǎn)品，細(xì)胞培養(yǎng)箱及恒溫?fù)u床是Thermo Fisher公司產(chǎn)品，SHJ潔凈工作臺(tái)為上海匯龍儀表電子有限責(zé)任公司產(chǎn)品；TY-20型脫色搖床為上海西巴斯生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品；SCS-24水平搖床為上海市離 心機(jī)械研究所產(chǎn)品；Envision MultilabelPlate Readers 為 PERKIN ELMER 公司產(chǎn)品；Eppendorf centrifuge 5417R 為 EppendorfHanburg 公司產(chǎn)品。實(shí)施例IGrpl-PH-EGFP高表達(dá)細(xì)胞株Rh3O-Grpi-PH-EGFP的建立將質(zhì)粒pEGFP-Cl-Grpl-PH、轉(zhuǎn)染試劑Lipofenctamine 2000依試劑說(shuō)明操作轉(zhuǎn)入Rh30細(xì)胞內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后加入800μ g/mL終濃度的G418(遺傳霉素)篩選兩周，所得細(xì)胞重新接種至96孔板中培養(yǎng)。兩周后，于熒光顯微鏡下觀察得到的高表達(dá)EGFP-Grpl-PH的單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株Rh30-GrpI-PH-EGFP。之后，將該細(xì)胞在含500 μ g/mL終濃度的G418培養(yǎng)基(即RPMI 1640+10%牛血清+G418)中培養(yǎng)。實(shí)施例2表達(dá)持續(xù)活化的人I型PI3K的四種亞型的細(xì)胞株的建立豆蘧酰化序列分別融合在人I型PI3K的PllOa、ΡΙΙΟβ、PllO Y和PllO δ的氮端的 Rh30-Myr-P110 a、Rh30_Myr_P110 β、Rh30_Myr_P110 γ 和 Rh30_Myr_P110 δ，其構(gòu)建過(guò)程是用常規(guī)分子生物學(xué)方法(J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)》，科學(xué)出版社)分別在PllO a、PllO β、PllO Y和ΡΙΙΟδ的ORF 5’端加入豆■?；瘔A基序列 5，-ATGGGGTCTTCAAAATCTAAACCAAAGGACCCCAGCCAGCGCCGGCGCAGAATCCGAGGΤ-3’ 及 HA 標(biāo)簽序列 5’ -ACCCATACGACGTGCCAGATTACGCC-3’ 后，插入質(zhì)粒 pBabe-Puro 中，然后與質(zhì)粒pE-ampho、pGP共轉(zhuǎn)入293FT細(xì)胞獲取病毒，用該病毒感染Rh30細(xì)胞48小時(shí)后，再通過(guò)I μ g/mL終濃度的嘌呤霉素篩選得到目的細(xì)胞株，所得細(xì)胞株分別命名為Rh30-Myr-P110α、Rh30-Myr_P110 β、Rh30-Myr_P110 γ 和 Rh30-Myr_P110 δ。法尼基化序列分別融合在人I型ΡΙ3Κ的Pl 10 α、PllO β、Pl 10 Y和ΡΙΙΟδ的碳端的 Rh30-P110 a -CAAX、Rh30_P110 β -CAAX、Rh30_P110 y -CAAX 和 Rh30_P110 δ -CAAX，其構(gòu)建過(guò)程是分別在Ρ110α、Ρ110β、Ρ110γ和ΡΙΙΟδ的ORF 3’端去掉終止密碼子，并加入 HA 標(biāo)簽序列 5’ -ACCCATACGACGTGCCAGATTACGCC-3’ 和法尼基化序列 5’ -CAGCATGCTTTGAACGAGCTCGGCGCCTCCAAAGATGGCAAAAAGAAGAAGAAGAAGTCCAAGACCAAGTGCGTGATCATGTGA-3，或 5，-CAGCATGCTTTGAACGAGCTCGGGGGCGCCAGCGGCCCCGGCTGCATGAGCTGCAAGTGCGTGCTGAGCTGΑ-3’后,插入質(zhì)粒pBabe-Puro中，然后與質(zhì)粒pE_ampho、pGP共轉(zhuǎn)入293FT細(xì)胞獲取病毒，用該病毒感染Rh30細(xì)胞48小時(shí)后,再通過(guò)I μ g/mL終濃度的嘌呤霉素篩選得到目的細(xì)胞株，所得細(xì)胞株分別命名為 Rh30-P110 a -CAAX、Rh30_P110 β -CAAX、Rh30_P110 y -CAAX 和Rh30-P110δ-CAAX。
實(shí)施例3使用激酶體外反應(yīng)體系在分子水平測(cè)定化合物對(duì)人I型PI3K的亞型ΡΙ3Κα的抑制活性GST-Grpl-PH蛋白的表達(dá)及純化用常規(guī)分子生物學(xué)方法(J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)》，科學(xué)出版社)將Grpl-PH片段從質(zhì)粒pEGFP-Cl-Grpl-PH中克隆進(jìn)質(zhì)粒pGEX 4T-1形成新質(zhì)粒pGEX4T-l-Grpl_PH，再將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌B121中。然后將目的轉(zhuǎn)化子在2XYT-Amp培養(yǎng)基(O. 5%酵母提取物，I. 6%胰蛋白胨，O. 5% NaCl，50 μ g/mL氨芐青霉素)中培養(yǎng)至0D600為O. 6時(shí)，采用100 μ M的IPTG (異丙基硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)表達(dá)4h，離心取菌體，加入PBS重懸后超聲破碎，離心取上清。隨后加入Glutathione Sepharose 4B Beads孵育2小時(shí)，離心取Beads, PBS洗漆數(shù)次，用PH8. O的25mM終濃度的還原型谷胱甘肽洗脫即得目的蛋白GST_Grpl-PH。ΡΙ3Κα的表達(dá)和純化用常規(guī)分子生物學(xué)方法(J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)》，科學(xué)出版社)將PllOa片段從質(zhì)粒pBabe puro HA PIK3CA克隆到質(zhì)粒pGEX 4T-1后，再將GST-pllOa片段克隆進(jìn)質(zhì)粒pFastBacHTB中，同時(shí)將p85 a 片段從質(zhì)粒pBV human p85alpha (HAtag)克隆進(jìn)pFastBacHTB中，將這兩個(gè)最終目的質(zhì)粒通過(guò)英杰生命技術(shù)有限公司的Bac-to-Bac技術(shù)，依其說(shuō)明操作得到兩種桿狀病毒。將這兩種桿狀病毒共轉(zhuǎn)昆蟲(chóng)細(xì)胞T.ni表達(dá)出蛋白ΡΙ3Κα，這種蛋白用Ni-NTA superflow依其說(shuō)明書(shū)操作得到最終所需激酶PI3KCI。激酶活性檢測(cè)I、將親和鏈霉素加入96孔蛋白高結(jié)合力的透明酶標(biāo)板中孵育過(guò)夜。2、用PBST清洗板孔后，換含5% BSA的PBS封閉液于室溫放置2h以封閉板孔。3、化合物PI103對(duì)PI3K α的抑制效果檢測(cè)反應(yīng)在96孔聚苯丙烯板中進(jìn)行，用激酶反應(yīng)液配制不同濃度的ΡΙ103，2. 5 μ M最高濃度，兩倍稀釋共7個(gè)濃度梯度。激酶反應(yīng)液組分為50mMM0PS，pH 6. 5 ；10mM MgCl2 ；25mMNaCl ;0. 5mMNaCholate (膽酸鈉)以及ImM DTT。然后在每孔加入10 μ L由激酶反應(yīng)液配置的不同濃度的 PI103 (2. 5 μ Μ，I. 25 μ Μ, O. 625 μ Μ，O. 31 μ Μ，O. 16 μ Μ, O. 08 μ Μ,
0.0411|0，再加入用激酶反應(yīng)液配制的人1型？131(中的？131((1 (30 μ L/孔)。隨后，每孔再加入10 μ L包含250 μ M ATP和50ηΜ底物(生物素標(biāo)記的磷脂酰肌醇_4，5- 二磷酸)的激酶反應(yīng)液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)。同時(shí)設(shè)置無(wú)酶對(duì)照孔和DMSO溶劑對(duì)照孔，室溫作用I小時(shí)后用終濃度為20mM的EDTA終止反應(yīng)。終止后的反應(yīng)液體轉(zhuǎn)入棄去封閉液的酶標(biāo)板孔中，酶標(biāo)板放于濕盒內(nèi)室溫孵育2小時(shí)。4、將GST-Grpl-PH蛋白稀釋于封閉液(5% BSA的PBS)中，其終濃度2nM。棄去孔中液體，PBST洗板后加入IOOyL/孔的稀釋后的GST-Grpl-PH蛋白，室溫孵育2小時(shí)。5、以 I : 10000 的稀釋度將 HRP-conjugated anti-GST (HRP 標(biāo)記的抗 GST)抗體稀釋于封閉液中。棄去孔中液體，PBST洗板后加入80 μ L/孔的稀釋后的抗體，室溫孵育I小時(shí)。6、棄去孔中液體，PBST洗板后加入100 μ L/孔的TMB顯色劑，避光顯色至藍(lán)色明顯為止。用2Μ H2SO4 5(^17孔來(lái)終止顯色，讀取00450值。抑制率的計(jì)算公式如下 抑制率(％ ) = 100 X (DMS0對(duì)照孔0D450-化合物孔0D450) / (DMS0對(duì)照孔0D450-無(wú)酶孔 0D450)。
結(jié)果分析最終PI103對(duì)PI3K α的抑制效果如圖I所示，其IC50 = 31. 2ηΜ，與文獻(xiàn) 艮道相"(以(Horiuchi KY, Ma H. , Fluorescence polarization and time-resolvedfluorescence resonance energy transfer techniques for PI3K assays. Methods MolBiol. 2009 ；572 :161-76.)，表明該方法的可靠性。實(shí)施例4細(xì)胞水平考察化合物對(duì)高表達(dá)Grpl-PH-EGFP細(xì)胞株綠色熒光在細(xì)胞膜表面聚集的影響將實(shí)施例I中的Rh30_GrpI-PH-EGFP細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)，貼壁過(guò)夜后，換無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)以去除上游信號(hào)對(duì)內(nèi)源性PI3Ks激活的干擾。然后，力口入待測(cè)化合物⑶C0941或DMSO對(duì)照處理細(xì)胞I小時(shí)，再加入IGF-I或溶劑對(duì)照刺激細(xì)胞10分鐘來(lái)激活人I型PI3K，用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15分鐘，然后在熒光顯微鏡下觀
察綠色熒光信號(hào)。結(jié)果如圖2所示，表明150ng/mL終濃度的IGF-I在10分鐘內(nèi)可以促使綠色熒光在細(xì)胞膜表面成點(diǎn)狀聚集，而化合物GDC0941在I μ M的濃度下可以有效抑制這一過(guò)程的發(fā)生，這與文獻(xiàn)報(bào)道的⑶C0941是一個(gè)ΡΙ3Κ抑制劑的結(jié)果一致(Folkes A. J. etal., The identification of 2-(lH-indazol-4-yl)-6-(4-methanesulfonyl-piperazin-l-ylmethyl)-4-morphoIin-4-yI-thieno[3，2_d]pyrimidine(GDC-0941) as a potent,selective,orally bioavailable inhibitor of class I PI3 kinase for the treatmentof cancer. J Med Chem. 2008Sep 25 ；51 (18) :5522-32.)。實(shí)施例5細(xì)胞水平考察化合物對(duì)高表達(dá)持續(xù)活化的人I型PI3K細(xì)胞株磷酸化Akt的影響將實(shí)施例2 中的 Rh30-Myr_P110a、Rh30_Myr_Pl 10 β、Rh30-Myr-P110 y 和Rh30-Myr-P110 δ四種細(xì)胞分別接種于細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)，貼壁過(guò)夜后，換無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)以去除上游信號(hào)對(duì)內(nèi)源性PI3Ks激活的干擾。然后，加入待測(cè)化合物或DMSO對(duì)照處理細(xì)胞I小時(shí)，棄去培養(yǎng)液后裂解細(xì)胞，用Western blot的方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抑制劑對(duì)Akt磷酸化的影響，結(jié)果如圖3所示，其中化合物GDC0941顯示出對(duì)PI3Ka有較高的選擇性抑制，化合物TGX221顯示出對(duì)ΡΙ3Κβ有較高的選擇性抑制，化合物AS604850顯示出對(duì)ΡΙ3Κ Y有較高的選擇性抑制，化合物IC87114顯示出對(duì)ΡΙ3Κ δ有較高的選擇性抑制，這個(gè)結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致(Folkes A. J. et al. , The identi fixation of 2- (ΙΗ-indazo
1-4-yl)-6-(4-methanesulfonyl-piperazin-l-ylmethyl)-4-morpholin-4-yl_thieno[3,
2-d]pyrimidine(GDC-0941)asa potent,selective,orally bioavailable inhibitor ofclass I PI3 kinase for the treatment of cancer. J Med Chem. 2008Sep 25 ；51 (18)5522-32. Straub A.et al, Selective inhibition of the platelet phosphoinositide
3-kinasepllObeta as promising new strategy for platelet protection duringextracorporeal circulation. Thromb Haemost. 2008Mar ；99(3) :609-15. M. Camps etal.Blockade of PI3Kg suppresses joint inflammation and damage in mouse modelsof rheumatoid arthritis. Nature Medicine, 2005,11,936-943.以及 Sadhu, C. et al.，Selective role of PI3K delta in neutrophil inflammatory responses. BiochemBiophys Res Commun. 2003Sep 5 ；308 (4) :764-9.)。以上對(duì)本發(fā)明所提供的檢測(cè)化合物對(duì)人I型PI3K抑制活性的方法進(jìn)行了詳細(xì)介紹，本文中應(yīng)用了具體個(gè)例對(duì)本發(fā)明的原理及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想；同時(shí)，對(duì)于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā) 明的思想，在具體實(shí)施方式
及應(yīng)用范圍上均會(huì)有改變之處，綜上所述，本說(shuō)明書(shū)內(nèi)容不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)化合物對(duì)人I型PI3K抑制活性的方法，該方法包括 1)使用激酶體外反應(yīng)體系在分子水平測(cè)定化合物對(duì)人I型PI3K的四種亞型的抑制活性，其中，使用生物素標(biāo)記的磷脂酰肌醇-4，5- 二磷酸作為底物進(jìn)行體外反應(yīng)；和/或 2)構(gòu)建Grpl-PH-EGFP高表達(dá)細(xì)胞株以綠色熒光在細(xì)胞膜上聚集程度為指標(biāo)在細(xì)胞水平檢測(cè)化合物對(duì)人I型PI3K的抑制活性；和/或 3)構(gòu)建表達(dá)持續(xù)活化的人I型PI3Kα、ΡΙ3Κ β、ΡΙ3Κ Y或ΡΙ3Κ δ的各亞型細(xì)胞株，以磷酸化的Akt為指標(biāo)，在細(xì)胞水平檢測(cè)所述化合物對(duì)人I型ΡΙ3Κ各亞型的選擇性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟I)中，所述人I型ΡΙ3Κ是純化的人I型ΡΙ3Κ的分子亞型ΡΙ3Κα、ΡΙ3Κβ、ΡΙ3Κγ和ΡΙ3Κ δ中的任一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟I)中，采用ELISA方法測(cè)定所述體外反應(yīng)的產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟I)中，所述激酶體外反應(yīng)體系包括緩沖劑=PH 6. 5的MOPS，底物生物素標(biāo)記的磷脂酰肌醇-4,5- 二磷酸，以及ATP、ΡΙ3Κ、MgCl2, NaCl, NaCholate 和 DTT。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟2)包括以下步驟 2-1)構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)Grpl-PH-EGFP蛋白的細(xì)胞株Rh30_GrpI-PH-EGFP，將該細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)； 2-2)將步驟2-1)中所述細(xì)胞貼壁過(guò)夜后換無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，去除上游信號(hào)對(duì)內(nèi)源性PI3K激活的干擾； 2-3)加入待測(cè)化合物處理細(xì)胞之后，再通過(guò)細(xì)胞因子激活人I型PI3K ;以及 2-4)觀察EGFP所產(chǎn)生的綠色熒光信號(hào)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2-1)中所述的Rh30-Grpl-PH-EGFP細(xì)胞株的構(gòu)建包括將含有Grpl-PH和熒光蛋白融合序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rh30細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)篩選得到單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)的所述Rh30-GrpI-PH-EGFP細(xì)胞株。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟3)包括以下步驟 3-1)分別構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)氮端或碳端融合了豆蘧酰化序列或法尼基化序列的人PllOa、PllO β、PllO Y或PllO δ的Rh30細(xì)胞株，使之成為表達(dá)持續(xù)活化的人I型ΡΙ3Κ的細(xì)胞株，將這四種細(xì)胞分別接種于細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)； 3-2)使步驟3-1)中所述的細(xì)胞貼壁過(guò)夜后換無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)，去除上游信號(hào)對(duì)內(nèi)源性PI3K激活的干擾； 3-3)加入待測(cè)化合物處理細(xì)胞之后，裂解細(xì)胞；以及 3-4)用Western blot的方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)對(duì)Akt的磷酸化的影響。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟3-1)中所述的表達(dá)持續(xù)活化的人I型PI3K的細(xì)胞株為豆蘧酰化序列融合在人1型？131(的？110 0、？110 0、？110￥或PllO δ的氮端的Rh30細(xì)胞,或者 法尼基化序列融合在人I型PI3K的Ρ110α、Ρ110β、Ρ110γ或PllO δ的碳端的Rh30細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述豆蘧?；蛄腥诤显谌薎型PI3K的PllO a、PllO β、PllOy或PllO δ的氮端的Rh30細(xì)胞的構(gòu)建過(guò)程是分別在PllO a、PllO β、PllO γ和PllO δ的ORF的5’端加入豆蘧?；瘔A基序列及標(biāo)簽序列后，分別插入到載體中，然后與質(zhì)粒pE-ampho、pGP共轉(zhuǎn)入293FT細(xì)胞獲取病毒，用該病毒感染Rh30細(xì)胞后再通過(guò)篩選得到目的細(xì)胞株Rh30-Myr-P110 a、Rh30-Myr_P110 β、Rh30-Myr_P110 γ 或Rh30-Myr-P110 δ ； 所述法尼基化序列融合在人I型ΡΙ3Κ的PllOa、PllO β、PllO Y或PllO δ的碳端的Rh30細(xì)胞的構(gòu)建過(guò)程是分別在PllO a、PllO β、PllO Y和PllO δ的ORF的3’端去掉終止密碼子并加入標(biāo)簽序列以及法尼基化序列后，分別插入到載體中，然后與質(zhì)粒pE-ampho、PGP共轉(zhuǎn)入293FT細(xì)胞獲取病毒，用該病毒感染Rh30細(xì)胞后再通過(guò)篩選得到目的細(xì)胞株Rh30-P110 a -CAAX、Rh30_P110 β -CAAX、Rh30_P110 y -CAAX 或 Rh30_P110 δ -CAAX ； 其中，所述豆蘧?；瘔A基序列為5 ’ -ATGGGGTCTTCAAAATCTAAACCAAAGGACCCCAGCCAGCGCCGGCGCAGAATCCGAGGT-3， 所述法尼基化序列為5 ’ -CAGCATGCTTTGAACGAGCTCGGCGCCTCCAAAGATGGCAAAAAGAAGAAGAAGAAGTCCAAGACCAAGTGCGTGATCATGTGA-3，或?yàn)?5，-CAGCATGCTTTGAACGAGCTCGGGGGCGCCAGCGGCCCCGGCTGCATGAGCTGCAAGTGCGTGCTGAGCTGA-3，。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述人Ρ110α、Ρ110β、Ρ110γ或PllO δ的Rh30細(xì)胞株為豆蘧?；蛄腥诤显谌薎型PI3K的PllO a、PllO β、PllO Y或PllO δ的氮端的Rh30細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)化合物對(duì)人I型PI3K抑制活性的方法，該方法包括使用激酶體外反應(yīng)體系在分子水平測(cè)定化合物對(duì)人I型PI3K的四種亞型的抑制活性，其中，使用生物素標(biāo)記的磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸作為底物進(jìn)行體外反應(yīng)；和/或構(gòu)建Grp1-PH-EGFP高表達(dá)細(xì)胞株以綠色熒光在細(xì)胞膜上聚集程度為指標(biāo)在細(xì)胞水平檢測(cè)化合物對(duì)人I型PI3K的抑制活性；和/或構(gòu)建表達(dá)持續(xù)活化的人I型PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kγ或PI3Kδ的各亞型細(xì)胞株，以磷酸化的Akt為指標(biāo)，在細(xì)胞水平檢測(cè)所述化合物對(duì)人I型PI3K各亞型的選擇性。本發(fā)明的PI3K抑制劑的活性檢測(cè)方法系統(tǒng)、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)且安全性好。
文檔編號(hào)C12Q1/48GK102719517SQ201110077540
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2011年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月29日
發(fā)明者丁健, 王祥, 蒙凌華 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所