專利名稱：人猴通用動(dòng)脈粥樣硬化檢測引物組、檢測芯片及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能用于分析人類和食蟹猴外周靜脈血白細(xì)胞中動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基 因表達(dá)情況的檢測引物組、熒光定量PCR檢測芯片及檢測方法。
背景技術(shù)：
基因診斷誕生于20世紀(jì)70年代末，基因診斷是現(xiàn)代分子生物學(xué)的理論和技術(shù)與 醫(yī)學(xué)相結(jié)合的范例?；蛟\斷是病因的診斷，既特異又靈敏，其優(yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方 面可以揭示尚未出現(xiàn)癥狀時(shí)與疾病相關(guān)的基因狀態(tài)，從而可以對(duì)表型正常的攜帶者及某 種疾病的易感者做出診斷和預(yù)測；也可以結(jié)合常規(guī)的臨床診斷指標(biāo)在臨床診斷和預(yù)后評(píng)價(jià) 中起重要作用；此外基因診斷指標(biāo)還可用于新藥評(píng)價(jià)。美國SuperArray公司新近推出的第二代功能分類基因芯片(Real-time PCR芯 片)基于第一代功能分類Oligo基因芯片，結(jié)合了實(shí)時(shí)定量PCR和第一代功能分類基因芯片 的優(yōu)點(diǎn)，可在一次實(shí)驗(yàn)中準(zhǔn)確定量檢測上百個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平，不僅克服了實(shí)時(shí)定量 PCR檢測基因表達(dá)工作量大、耗時(shí)久的缺點(diǎn)，而且將基因芯片的檢測精度提高到了與實(shí)時(shí)定 量PCR相當(dāng)?shù)乃?。?dòng)脈粥樣硬化存在著發(fā)生與發(fā)展的自然病程，在其發(fā)生、發(fā)展的過程中動(dòng)脈粥樣 硬化相關(guān)基因的表達(dá)變化往往要早于傳統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)因素，且更能揭示疾病自然病程的本質(zhì)。 美國SuperArray公司研究人員已經(jīng)開發(fā)出人和小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化PCR芯片，目前，該芯 片已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)脈粥樣硬化臨床診斷和研究當(dāng)中。但是上述動(dòng)脈粥樣硬化PCR芯片都有以下不足之處
1.上述動(dòng)脈粥樣硬化PCR芯片沒有明確適用于那種組織，考慮到基因表達(dá)的時(shí)空性， 我們利用這些芯片進(jìn)行高流通量檢測時(shí)會(huì)有較大浪費(fèi)；
2.目前尚缺乏適用于猴的動(dòng)脈粥樣硬化PCR芯片，這為我們利用猴，特別是模型猴作 為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行動(dòng)脈粥樣硬化基因診斷研究帶來不便。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，本發(fā)明一方面提供了 一種能用于分析人類和食蟹 猴外周靜脈血白細(xì)胞中動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因表達(dá)情況的PCR檢測引物組；另一方面還提 供了包含有上述引物組的熒光定量PCR檢測芯片；同時(shí)本發(fā)明還提供了利用上述引物組對(duì) 人和/或猴外周靜脈血白細(xì)胞中動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測的方法。本發(fā)明通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)確定了人類和食蟹猴外周靜脈血白細(xì)胞中均能有效和特異 性表達(dá)的動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因，然后通過比對(duì)人和食蟹猴的上述基因在GeneBank中公 布的序列，針對(duì)共有的特異性序列分別設(shè)計(jì)引物，通過篩選最終獲得本發(fā)明的能夠在同樣 條件下擴(kuò)增并用于分析人類和/或食蟹猴外周靜脈血白細(xì)胞中動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因表 達(dá)情況的引物組。所述人類和食蟹猴外周靜脈血白細(xì)胞中均能有效和特異性表達(dá)的動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因包括應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因。
CCL2chemokiiie (C-C motif) Iigand 2趨化E子配體2ILlSInterleukin ISIpl A'^ 1 Q Id .,5 ！ MIL6interleukin 6白介素6IL6STinterleukin 6 signal transducer Interleukin 1 β白介素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)體 1·"·"1 ι 1 ^^ILiRX ntei'leukin 1 receptor antagonist白介素1受體拮抗 荊ILS1X1. t Sl J. € 1 Xl S白介素SCD40LGQMO IigandCMO配體XFK 8 1nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B~cells 1B細(xì)臉ic輕 基因Jf 強(qiáng)子核囡子KplOSjFASTXF receptor superfaroib't member 6腫死S子受體6FASLGTXF receptor superfami Iy. member 6 1igand腫瘤ff死S子受體6 配體LTA腫Ifff死S子家族1LTBTNF superfamiIy， member 3腫痗壞死因子家族3TN 下RSFlBtumor necrosis factor receptor >s U-jp1^JL- 0· ο ι ·!》· .，β c^xn i IL瘤環(huán)死S子超家 族1βtumor necrosis factor (TXF s upe ris.ni i 1 y · tnember 2)腫瘤壞死因子家族2 所述人類和食蟹猴外周靜脈血白細(xì)胞中均能有效和特異性表達(dá)的動(dòng)脈粥樣硬化 相關(guān)基因還包括粘附分子相關(guān)基因。
ICiMlintercellular adhesion molecule 1^016! si K 分子 1IIGg 2 0 ntegi'in, alpha 2b整合素σ 2 βITG α 4χ π ι θι η sli^hc 4SSα 4ITGaG ntegrin, alpha 6攀會(huì)奢ι! fi nlW O ..爾 ^ WITG α Hintegrin, alpha M整合素《ΜITGaVintegrin, alpha V整合素s VITG β 1i me grin, beta 1整合素PlITG β 2 ■ _ 1 ^ Λ s W 會(huì) ."u 'ijii isψ^.^η,'Φ' js, J 1Π.“ .e gl I Π；. Dc- L 丄整合紫β 2SELLselectin L選擇素LSELPselectin Pji擇素PSELPGselect in P ligand選擇素P配！拿 所述人類和食蟹猴外周靜脈血白細(xì)胞中均能有效和特異性表達(dá)的動(dòng)脈粥樣硬化 相關(guān)基因還包括血栓相關(guān)基因。
權(quán)利要求
1.人猴通用動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因檢測引物組，其特征在于包括分別用于擴(kuò)增動(dòng)脈 粥樣硬化相關(guān)基因 ACE、APOAl、APOCl、APOF、CCL2、CD40LG、DBP、EDNl、FAS、FASLG, FGG、 GLGUGRN,ICAM1、IL18、ILl β、IL1RN、IL6、IL6ST、IL8、ITG α 2 β、ITG α 4、ITG α 6、ITG α Μ、 ITGa V、ΙΤ6β U ITGβ 2, LTA, LTB, MTHFR、NFK^ 1、OLRU PLAUR, PLTP, Ρ0Ν2、SELL, SELP, SELPG,SERPINEUTIMPUTNF,TNFRSF1B的擴(kuò)增引物對(duì)，上述基因擴(kuò)增引物對(duì)序列分別為SEQ ID NO :1-84所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人猴通用動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因檢測引物組，其特征在于 還包括分別用于擴(kuò)增GAPDH、RPL13A、YffHAZ基因的擴(kuò)增引物對(duì)中的至少一對(duì)，擴(kuò)增GAPDH、 RPL13A、YWHAZ基因的擴(kuò)增引物對(duì)序列分別為SEQ ID NO :85-90所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人猴通用動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因檢測引物組，其特征在 于還包括用于檢測是否有DNA污染的擴(kuò)增引物對(duì)，該擴(kuò)增引物對(duì)序列為SEQ ID NO :91-92 所示的核苷酸序列；還包括用于檢測反轉(zhuǎn)錄效率的擴(kuò)增引物對(duì)，該擴(kuò)增引物對(duì)序列為SEQ ID NO :93-94所示的核苷酸序列；還包括用于檢測PCR效率的擴(kuò)增引物對(duì)，該擴(kuò)增引物對(duì)序 列為SEQ ID NO 95-96所示的核苷酸序列。
4.一種熒光定量PCR檢測芯片，其特征在于，包括權(quán)利要求1至3任一所述的人猴通 用動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因檢測引物組。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的熒光定量PCR檢測芯片，其特征在于所述引物組中的各擴(kuò) 增引物對(duì)分別單獨(dú)存在于96孔PCR板的孔中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的熒光定量PCR檢測芯片，其特征在于所述動(dòng)脈粥樣硬化相 關(guān)基因的擴(kuò)增引物對(duì)分別單獨(dú)存在于96孔PCR板的2個(gè)孔中；用于擴(kuò)增GAPDH、RPL13A、 YWHAZ基因的擴(kuò)增引物對(duì)分別單獨(dú)存在于96孔PCR板的2個(gè)孔中；用于檢測PCR效率的擴(kuò) 增引物對(duì)單獨(dú)存在于96孔PCR板的2個(gè)孔中；用于檢測反轉(zhuǎn)錄效率的擴(kuò)增引物對(duì)單獨(dú)存在 于96孔PCR板的2個(gè)孔中；用于檢測是否有DNA污染的擴(kuò)增引物對(duì)單獨(dú)存在于96孔PCR 板的2個(gè)孔中。
7.一種利用權(quán)利要求1至3任一所述的人猴通用動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因檢測引物組進(jìn) 行動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因表達(dá)情況檢測的方法。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因表達(dá)情況檢測的方法，其特征在于 所述引物組中的各擴(kuò)增引物對(duì)分別在96孔PCR板的各個(gè)孔中進(jìn)行單重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因表達(dá)情況檢測的方法，其特征在于 所述檢測方法中還設(shè)有管家基因?qū)φ?，所述管家基因?yàn)镚APDH、RPL13A YWHAZ，該管家基因 對(duì)照為上述管家基因中的至少一個(gè)；還設(shè)有分別用于檢測PCR效率、用于檢測反轉(zhuǎn)錄效率 和用于檢測是否有DNA污染的對(duì)照。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因表達(dá)情況檢測的方法，其特征在于 所述熒光定量PCR反應(yīng)的條件為(1)95°C變性30s ;(2)95°C變性k ；60°C退火延伸34s， 重復(fù)40個(gè)循環(huán)；(3)熔解曲線分析，95°C，lk ；60°C，lmin;按0.3°C /s的升溫速度升到 95°C，然后 95°C，15s。
全文摘要
本發(fā)明涉及能用于分析人類和食蟹猴動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因表達(dá)情況的檢測引物組、PCR檢測芯片及檢測方法。人猴通用動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因檢測引物組，包括分別用于擴(kuò)增動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因ACE、APOA1、APOC1、APOF、CCL2、CD40LG、DBP、EDN1、FAS、FASLG、FGG、GLG1、GRN、ICAM1、IL18、IL1β、IL1RN、IL6、IL6ST、IL8、ITGα2β、ITGα4、ITGα6、ITGαM、ITGαV、ITGβ1、ITGβ2、LTA、LTB、MTHFR、NFKβ1、OLR1、PLAUR、PLTP、PON2、SELL、SELP、SELPG、SERPINE1、TIMP1、TNF、TNFRSF1B的擴(kuò)增引物對(duì)，上述擴(kuò)增引物對(duì)序列分別為SEQ ID NO1-84所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了包含上述引物組的PCR檢測芯片及檢測方法。本發(fā)明能對(duì)人猴動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因的表達(dá)情況進(jìn)行準(zhǔn)確定量、檢測，對(duì)于促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)研究、預(yù)防檢測和臨床治療具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102146473SQ20111006764
公開日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2011年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月21日
發(fā)明者劉曉明, 夏機(jī)良, 季芳, 彭白露, 郝香芬 申請(qǐng)人:廣東藍(lán)島生物技術(shù)有限公司