專利名稱：人miR-1229的反義寡聚核苷酸及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域和藥物領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及ー種microRNAs (miRNA)反義寡聚核苷酸,尤其是涉及人microRNA-1229 (人miR-1229)反義寡聚核苷酸及其應(yīng)用。該反義寡聚核酸可與人miR-1229互補(bǔ)，從而抑制人miR-1229的表達(dá)而起到抗腫瘤的作用。本發(fā)明還涉及包含該miRNA反義寡聚核苷苷酸的藥物組合物。
背景技術(shù)：
miRNAs (又稱為microRNA或微小RNA)是小的非編碼RNA，長(zhǎng)度為20_25bp，通常是由RNA聚合酶II (Pol II)轉(zhuǎn)錄的，一般最初產(chǎn)物為大的具有帽子結(jié)構(gòu)(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的 pri-miRNA(primary miRNA,初級(jí) miRNA)。這些 pri-miRNA在RNase III Drosha和其輔助因子Pasha的作用下被處理成70個(gè)核苷酸組成的前體miRNA(precursormiRNA,pre-miRNA)。RAN-GTP 和 exportin 5(輸出蛋白 5)將這種前體分子輸送到細(xì)胞質(zhì)中。隨后，另ー個(gè)RNase III Dicer (核糖核酸內(nèi)切酶)將其剪切產(chǎn)生約為22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的雙鏈。這種雙鏈很快被引導(dǎo)進(jìn)入miRISC(miRNA-induced silencingcomplex,miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物)復(fù)合體中，其中含有Argonaute蛋白(AGO蛋白)，并且成熟的單鏈miRNA保留在這ー復(fù)合物中。成熟的miRNA結(jié)合到與其互補(bǔ)的mRNA的位點(diǎn)通過(guò)兩種依賴于序列互補(bǔ)性的機(jī)制負(fù)調(diào)控基因表達(dá)，與祀mRNA不完全互補(bǔ)的miRNA在蛋白質(zhì)翻譯水平上抑制其表達(dá)。然而，最近也有證據(jù)表明，這些miRNA也有可能影響mRNA的穩(wěn)定性。使用這種機(jī)制的miRNA結(jié)合位點(diǎn)通常在mRNA的3’端非翻譯區(qū)。如果miRNA與靶位點(diǎn)完全互補(bǔ)(或者幾乎完全互補(bǔ))，那么這些miRNA的結(jié)合往往引起靶分子mRNA的降解。miRNAs在物種進(jìn)化中相當(dāng)保守，在動(dòng)物，植物和真菌等中發(fā)現(xiàn)的miRNAs表達(dá)均有嚴(yán)格的組織特異性和時(shí)序性。目前，只有很小一部分miRNAs的生物學(xué)功能得到闡明。這些miRNAs調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和組織分化，與生物生長(zhǎng)發(fā)育有夫。一系列的研究表明miRNAs在細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡、血細(xì)胞分化、同源異形盒基因調(diào)節(jié)、神經(jīng)元的極性、胰島素分泌、大腦形態(tài)形成、心臟發(fā)生和胚胎后期發(fā)育等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。例如，miR-273參與線蟲(chóng)的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程;miR-430參與斑馬魚(yú)的大腦發(fā)育；miR-181控制哺乳動(dòng)物造血細(xì)胞分化為B細(xì)胞；miR-375調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物胰島細(xì)胞發(fā)育和胰島素分泌；miR-143在脂肪細(xì)胞分化起作用；miR-196參與了哺乳動(dòng)物四肢形成，miR-1與心臟發(fā)育有夫。另有研究人員發(fā)現(xiàn)許多神經(jīng)系統(tǒng)的miRNAs在大腦皮層培養(yǎng)中受到時(shí)序調(diào)節(jié)，表明其可能控制著區(qū)域化的mRNA翻譯。miRNA表達(dá)與多種癌癥相關(guān)，并且這些基因可能起到腫瘤抑制基因或是癌基因作用。最先在B細(xì)胞慢性淋巴性白血病(CLL)中發(fā)現(xiàn)有miRNA表達(dá)水平的改變，隨后陸續(xù)在各種人類腫瘤中均檢測(cè)到miRNA表達(dá)水平的變化。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs與腫瘤形成相關(guān)，既能發(fā)揮腫瘤抑制基因的作用(如miR-15a和miR-16-l)，又能起到癌基因的作用(如miR-155和miR-17-92簇)。目前認(rèn)為，在腫瘤細(xì)胞中，有些miRNA成熟體或前體表達(dá)水平異常，而表達(dá)異常的miRNA通過(guò)影響靶mRNA翻譯發(fā)揮作用，參與腫瘤形成過(guò)程，并起重要作用。如Ras原癌基因受let-7家族的調(diào)控，BCL2抗凋亡基因受miR-15a-miR-16_l簇調(diào)控，E2F1轉(zhuǎn)錄因子受miR-17-92簇調(diào)控，BCL6抗凋亡基因受miR-127的調(diào)控等。miRNAs的表達(dá)下調(diào)也和腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系，這預(yù)示著miRNA具有癌基因的功能。例如，miR-143和miR-145在結(jié)腸癌中明顯下調(diào)。有趣的是，其發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體分子在腫瘤和正常組織中含量相似，這表明,miRNAs的表達(dá)下調(diào)可能是由于其加工過(guò)程受到破壞。但是,miR-143和miR-145的腫瘤抑制基因功能可能不僅僅局限于結(jié)腸癌，在乳腺癌、前列腺癌、子宮癌、淋巴癌等細(xì)胞系中其表達(dá)量也明顯下調(diào)。另ー個(gè)報(bào)道表明，miR-21在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)增加。這個(gè)基因在腫瘤組織中的表達(dá)量比在正常組織中高5-100倍。
miRNAs是天然的反義作用因子，能夠調(diào)控與真核生物生存和増殖相關(guān)的多種基因。在腫瘤治療方面，miRNA的應(yīng)用前景光明。在利用miRNA作為治療靶點(diǎn)方面，已有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持如在吉西他濱(gemcitabine)治療的過(guò)程中，出現(xiàn)miRNA表達(dá)譜的變化；調(diào)控部分miRNA的表達(dá)水平(如使miR-21過(guò)表達(dá))，能增進(jìn)膽管癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。通過(guò)引入與具有癌基因特性的miRNA互補(bǔ)的合成的反義寡聚核苷酸——抗miRNA寡聚核苷酸
(AMOs)-可能有效的滅活腫瘤中的miRNAs,延緩其生長(zhǎng)。臨床上,可以通過(guò)經(jīng)常的或者持
續(xù)的2’ -0-甲基化或者鎖核酸(LNA)等修飾的反義寡聚核苷酸給藥使miRNA失活。這些修飾使得寡核苷酸更穩(wěn)定，比其他治療手段毒性更低。使用antagomirs (與膽固醇偶聯(lián)的AMOs)，注射小鼠后可以在不同器官有效抑制miRNA活性，因而可能成為ー種有希望的治療藥物。相反的，過(guò)表達(dá)那些具有腫瘤抑制基因作用的miRNAs，如let-7家族，也可以用于治療某些特定的腫瘤。反義寡聚核苷酸(FlanaganWM. Antisense comes of age. Cancer&MetastasisReviews 1998 ;17 (2) :169-76)是指一段可以與其靶基因的堿基互補(bǔ)的核苷酸。反義寡聚核苷酸可以抑制相應(yīng)基因的表達(dá)。人microRNA-1229 (hsaiiR-1229)位于 5 號(hào)染色體，前體序列為 GUGGGUAGGGUUUGGGGGAGAGCGUGGGCUGGGGUUCAGGGACACCCUCUCACCACUGCCCUCCCACAG(SEQ ID No. 1)，含有 I 個(gè)成熟 microRNA hsa-miR-1229 (MIMAT0005584,序列為 CUCUCACCACUGCCCUCCCACAG(SEQ IDNo. 2))。Dudziec等利用芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)在尿路上皮細(xì)胞癌中5_azacytidine (5_氮雜胞卩密唳核苷)處理后一部分miRNA表達(dá)上調(diào)，提示部分miRNA收到甲基化影響。經(jīng)研究表明其中的miR-1229的啟動(dòng)子區(qū)域出現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，且miR-1229的表達(dá)也與尿路上皮細(xì)胞癌的診斷密切相關(guān)(Dudziec等,2010)。但在膠質(zhì)瘤中還沒(méi)有關(guān)于miR-145的功能和表達(dá)水平的研究報(bào)道。近三十年,盡管臨床上腫瘤的綜合治療已很普遍,但以手術(shù)為主,放化療為輔的綜合治療對(duì)腫瘤患者的生存率提高并不明顯，5年總體生存率仍然較低，徘徊在30% 55%左右，并沒(méi)有顯著提高，中晩期患者的5年生存率更低，約為20%。而且這些方法都存在各自的局限性，特別是對(duì)中晚期和復(fù)發(fā)患者療效不佳，對(duì)伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者療效更差。因此，尋找更安全有效的治療途徑是提高腫瘤患者生存率和生存質(zhì)量所亟待解決的難題。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一系列可以結(jié)合于miR-1229不同位置的反義寡聚核苷酸分子，在培養(yǎng)細(xì)胞U87/MG中，驗(yàn)證對(duì)miR-1229表達(dá)特異性抑制的反義寡聚核苷酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)能力、増殖能力的影響，反義寡聚核苷酸分子長(zhǎng)度可以包含13 23個(gè)核苷酸殘基，均有不同程度的抑制人腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)能力、増殖能力的特性，其中最短的反義寡聚核酸長(zhǎng)度為13個(gè)堿基，不同長(zhǎng)度的反義寡聚核苷酸均具有良好的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及増殖抑制活性。因此，上述反義寡聚核苷酸均可用來(lái)制備抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)能力、増殖能力的制齊U，其中優(yōu)選miR-1229高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明要解決的主要問(wèn)題就是提供一組新的人miR-1229的反義寡聚核苷酸(抑制劑)，用于高效、低毒或無(wú)毒地抑制miR-1229的表達(dá)，進(jìn)而治療由miR-1229過(guò)度表達(dá)引發(fā)的疾病，包括腫瘤，尤其為腦膠質(zhì)瘤。本發(fā)明要解決的另ー問(wèn)題就是提供上述反義寡聚核苷酸在制備治療mir-1229過(guò) 度表達(dá)的相關(guān)疾病的藥物中的用途。本發(fā)明要解決的再一問(wèn)題是提供ー種包含上述反義寡聚核苷酸的藥物組合物。本發(fā)明人通過(guò)廣泛而深入的研究，設(shè)計(jì)并合成了一系列專ー性針對(duì)miR-1229不同區(qū)域的長(zhǎng)度不同的反義核酸(反義寡聚核苷酸)，并在培養(yǎng)細(xì)胞中驗(yàn)證具有抑制效果的反義核酸。研究顯示，這些反義核酸能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和惡性増殖能力。本發(fā)明的第一方面，提供了ー種人miR-1229的反義寡聚核苷酸，所述反義寡聚核苷酸抑制人細(xì)胞內(nèi)miR-1229的表達(dá)。通常，所述反義寡聚核苷酸與5’ -⑶⑶CACCACUGCCXUCCCACAG-3’中連續(xù)13 23個(gè)核苷酸序列互補(bǔ)。通常反義寡聚核苷酸的長(zhǎng)度為13 35bp，對(duì)于miRNA成熟體來(lái)說(shuō)，較佳的反義寡聚核苷酸長(zhǎng)度為18 22bp。本發(fā)明的反義寡聚核苷酸的長(zhǎng)度沒(méi)有特別限制，一般來(lái)說(shuō)，為了達(dá)到雜交的專ー性，反義寡聚核苷酸需要至少13個(gè)單體組成的核苷酸。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述反義寡聚核苷酸的長(zhǎng)度為18 23個(gè)核苷酸。更佳地，所述反義寡聚核苷酸的序列是5’ -CUGUGGGAGGGCAGUGGUGAGAG-3’ (SEQ IDNo. 3)。在本發(fā)明的另ー個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的反義寡聚核苷酸中的核苷酸可以為核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸的嵌合體。從目前來(lái)看，核酸雜交中RNA與miRNA的雜交親和力比DNA與miRNA雜交的親和カ要高，具有很高的藥用價(jià)值。但是人工合成DNA的成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)比合成RNA的成本低，也具有很好的市場(chǎng)潛力。而且也可以采用核糖RNA単體與脫氧核糖DNA単體嵌合相連而成的反義核酸作為藥物進(jìn)行開(kāi)發(fā)。本發(fā)明設(shè)計(jì)的一系列反義核酸分子，既包括DNA分子,也包括RNA分子,兩種分子均具有抑制miR-1229表達(dá)的活性。本發(fā)明設(shè)計(jì)的反義核酸，其序列具有特異性生物學(xué)活性，其對(duì)于某一基因互補(bǔ)的位點(diǎn)的反義核酸所互補(bǔ)的長(zhǎng)度有很大關(guān)系，如互補(bǔ)的長(zhǎng)些，則生物學(xué)活性會(huì)更高些，抑制效果也會(huì)更好ー些，在増加或減少ー個(gè)至數(shù)個(gè)堿基而互補(bǔ)于同一基因位點(diǎn)的反義核酸，同樣也具有不同程度的生物學(xué)活性，也可達(dá)到不同程度的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與増殖的作用，本發(fā)明的研究表明，最短可達(dá)13個(gè)堿基仍然具有抑制miR-1229表達(dá)的作用。在本發(fā)明的反義核酸研究中，各種化學(xué)修飾方法很多，包括選自核糖修飾、堿基修飾和磷酸骨架修飾中的一種或幾種的組合等。應(yīng)當(dāng)明確的是，任何能夠增加反義核酸穩(wěn)定性和生物利用度的修飾方法都可以應(yīng)用，如選自膽固醇修飾、PEG修飾、硫代修飾和2’ -甲氧基修飾中的一種或幾種等。本文中所述反義寡聚核苷酸經(jīng)過(guò)2’ -甲氧基取代修飾。本發(fā)明的上述反義核酸具有抑制miR-1229表達(dá)的效果。當(dāng)將上述反義核酸轉(zhuǎn)染到miR-1229高表達(dá)的細(xì)胞株U87中后，能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和惡性増殖能力。
本發(fā)明還提供了ー種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明寡聚核苷酸以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括但不限于鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、こ醇及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。所述“有效量”是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性且可被人和/或動(dòng)物所接受的量。所述“藥學(xué)上可接受的”成分是適用于人和/或動(dòng)物而無(wú)過(guò)度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變 態(tài)反應(yīng))的，即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。在本發(fā)明的第三方面，提供了本發(fā)明的反義寡聚核苷酸在用于制備治療以下疾病的藥物中的用途，其中，所述反義寡聚核苷酸與其他治療藥物聯(lián)合施用；所述疾病為與人體miR-1229過(guò)表達(dá)有關(guān)的疾病，包括腫瘤，優(yōu)選為腦膠質(zhì)瘤。如本文所用，“反義寡聚核苷酸”指反義的核苷酸寡聚物。反義寡聚核苷酸通過(guò)堿基互補(bǔ)(A-T，A-U, G-C)配對(duì)與雙鏈DNA形成三鏈(反基因)，或與單鏈RNA形成雜交雙鏈(反義)，從而阻斷基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后mRNA的加工和翻譯。同時(shí)，雙鏈RNA能被細(xì)胞內(nèi)的核糖核酸酶H(RNaseH)所降解，從而更有效地阻斷靶基因的表達(dá)。由于反義核苷酸只能與反向互補(bǔ)的靶序列結(jié)合，因此具有專ー性高，副作用小的特點(diǎn)。本發(fā)明提供的人miR-1229的反義寡聚核苷酸可與人miR-1229補(bǔ)，從而抑制人miR-1229的表達(dá)而起到抗腫瘤的作用，其具有如下優(yōu)點(diǎn)I、本發(fā)明提供的反義寡聚核苷酸作用于特異性的靶位點(diǎn)，非特異性結(jié)合的位點(diǎn)很少，專一‘丨生高；2、本發(fā)明提供的反義寡聚核苷酸經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾，具有毒性低、副作用小和半衰期長(zhǎng)等特點(diǎn)；3、本發(fā)明提供的反義寡聚核苷酸具有很好的抑制效果，對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率超過(guò)85%。


圖I顯示了 miR-1229反義寡聚核苷酸抑制腫瘤細(xì)胞U87/MG細(xì)胞的生長(zhǎng)和増殖，其中，圖IA為轉(zhuǎn)染了 FAM標(biāo)記的陰性對(duì)照后的U87/MG細(xì)胞顯微圖(20X);圖IB為轉(zhuǎn)染了 FAM標(biāo)記的陰性對(duì)照后的U87/MG細(xì)胞顯微圖(20 X，熒光下)圖IC 為轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照(5’ -CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’ )后 U87/MG 細(xì)胞狀態(tài)的顯微圖(IOX);圖 ID 為轉(zhuǎn)染miR-1229反義寡聚核苷酸(5’-CUGUGGGAGGGCAGUGGUGAGAG-3’)后U87/MG細(xì)胞狀態(tài)的顯微圖(IOX)0
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的反義寡聚核苷酸，其序列與5 ’ -⑶⑶CACCACUGCCXUCCCACAG-3，中連續(xù)13 23個(gè)核苷酸序列互補(bǔ)，并且亦不與其他基因的RNA序列互補(bǔ)。在本發(fā)明的ー個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述反義寡聚核苷酸的序列為5’ -CUGUGGGAGGGCAGUGGUGAGAG-3’。本發(fā)明提供的反義寡聚核苷酸可以為修飾產(chǎn)物，它含有至少兩個(gè)，通常至少4個(gè)，較佳的至少6個(gè)，更佳的至少8個(gè)核苷酸沒(méi)有毒性副作用的修飾的核苷酸，所述修飾方式包括2位甲氧基取代、硫代修飾等。為了增加反義寡聚核苷酸的細(xì)胞攝取率，還可以在上述修飾的基礎(chǔ)上對(duì)反義寡聚核苷酸進(jìn)行膽固醇修飾或者PEG化修飾。上述修飾后的寡聚核苷酸能繼續(xù)與靶序列有效配對(duì)，而且比普通的未經(jīng)修飾的核糖核酸或者脫氧核糖核酸在體內(nèi)具有更長(zhǎng)的半衰期。下面將結(jié)合實(shí)施例及附圖進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而應(yīng)當(dāng)理解，列舉這些實(shí)施例只是為了起說(shuō)明作用，而并不是用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例人miR-1229的反義寡聚核苷酸對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87/MG抑制活性檢測(cè)首先，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成miR-1229反義寡聚核苷酸，序列為5' -CUGUGGGAGGGCAGUGGUGAGAG-3'。在實(shí)施例中涉及的所用序列均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。細(xì)胞培養(yǎng)將U87/MG細(xì)胞(人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù))在10% FBS-DMEM培養(yǎng)基(FBS (胎牛血清)購(gòu)自Gibco，DMEM( 一種常規(guī)培養(yǎng)基)購(gòu)自Hyclone)中，于37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)。收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的U87/MG細(xì)胞，離心計(jì)數(shù)，以2 X IO3每孔鋪于96孔板內(nèi)，37。。，5 % CO2培養(yǎng)24h。轉(zhuǎn)染I)轉(zhuǎn)染前一天，在96孔板中用適量不含抗生素的培養(yǎng)基接種培養(yǎng)細(xì)胞，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的匯合度達(dá)到30 50% ;2)轉(zhuǎn)染樣品按照如下方法準(zhǔn)備寡聚物-Lipofecta mine 2000 (—種轉(zhuǎn)染試劑)復(fù)合物a.用25 ill不含血清的Opti-MEM I培養(yǎng)基(Gibco)分別稀釋miR-1229反義寡聚核苷酸(5’ -CUGUGGGAGGGCAGUGGUGAGAG-3’)、陰性對(duì)照(SEQID No. 4 5’ -CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’)、FAM標(biāo)記的陰性對(duì)照，加入孔內(nèi)后終濃度為50nM，輕輕混勻，每個(gè)轉(zhuǎn)染設(shè)3個(gè)復(fù)孔；b.使用前輕輕混勻 Lipofecta mine 2000 (Invitrogen),然后取 0. 25 ii I 用Opti-MEM I培養(yǎng)基將其稀釋到25 u 1，輕輕混勻后在室溫下孵育5min ；c.孵育5min后，稀釋的Lipofecta mine 2000分別與稀釋的反義核苷酸及對(duì)照混合，輕輕混勻后在室溫下孵育20min，以允許復(fù)合物的形成；3)將復(fù)合物加入到每ー個(gè)包含細(xì)胞和培養(yǎng)基的孔中，輕輕地前后搖動(dòng)培養(yǎng)板混合；反義核苷酸及対照的終濃度為50nM。4) 37°C ,5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育72小時(shí)后，顯微鏡觀察U87/MG細(xì)胞，照相。如圖I所示，轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，超過(guò)80%的U87/MG細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染了 FAM標(biāo)記的陰性對(duì)照(圖1A，圖1B);轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照后，U87/MG細(xì)胞完整，透光性強(qiáng)(圖1C);轉(zhuǎn)染miR-1229反義寡聚核苷酸后大部分U87/MG細(xì)胞死亡(圖1D)?；贛TT的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)向上一步驟中得到的細(xì)胞,加入配制好的MTT(Sigma) 5mg/ml (用0.9%的生理鹽水配制)，每孔加入20 iil，37°C，5% CO2孵育4小時(shí)后吸去培養(yǎng)基及MTT，每孔加入DMSO100 u I并通過(guò)酶標(biāo)儀讀取0D570-0D630的吸光度值(如表I)。 表I
權(quán)利要求
1.ー種人micix)RNA-1229的反義寡聚核苷酸，其特征在于，所述反義寡聚核苷酸包含與下述核苷酸序列中13 23個(gè)連續(xù)的核苷酸互補(bǔ)的序列5， -CUCUCACCACUGCCCUCCCACAG-3，。
2.如權(quán)利要求I所述的反義寡聚核苷酸，其特征在于，所述反義寡聚核苷酸序列為5，-C腳GGGAGGGCA⑶G⑶GAGAG-3，。
3.如權(quán)利要求I所述的反義寡聚核苷酸，其特征在于，所述反義寡聚核苷酸為核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸的嵌合體。
4.如權(quán)利要求I 3中任一項(xiàng)所述的反義寡聚核苷酸，其特征在于，所述反義寡聚核苷酸進(jìn)ー步被修飾。
5.如權(quán)利要求4所述的反義寡聚核苷酸，其特征在于，所述修飾選自核糖修飾、堿基修飾和磷酸骨架修飾中的ー種或幾種。
6.如權(quán)利要求5所述的反義寡聚核苷酸，其特征在于，所述修飾選自硫代修飾、2’-甲氧基修飾和膽固醇修飾中的ー種或幾種。
7.如權(quán)利要求I 3中任一項(xiàng)所述的反義寡聚核苷酸在用于制備治療miR-1229過(guò)度表達(dá)的相關(guān)疾病的藥物中的用途。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在干，所述反義寡聚核苷酸與其他治療藥物聯(lián)合施用。
9.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述miR-1229過(guò)度表達(dá)的相關(guān)疾病為腫瘤。
10.如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述miR-1229過(guò)度表達(dá)的相關(guān)疾病為腦膠質(zhì)瘤。
11.ー種藥物組合物，其特征在于，包含治療有效量的權(quán)利要求I 3中任一項(xiàng)所述的反義寡聚核苷酸以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種抑制人microRNA-1229表達(dá)的反義寡聚核苷酸及其應(yīng)用。該反義寡聚核苷酸特異性結(jié)合于人miR-1229，包含與下述核苷酸序列中13～23個(gè)連續(xù)核苷酸互補(bǔ)的序列5’-CUCUCACCACUGCCCUCCCACAG-3’，特別是其包含序列5’-CUGUGGGAGGGCAGUGGUGAGAG-3’。本發(fā)明的反義寡聚核苷酸可以為核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸的嵌合體，并可對(duì)鏈中任一核苷酸進(jìn)行修飾。本發(fā)明的miR-1229反義寡聚核苷酸能夠有效抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-1229表達(dá)，抑制其生長(zhǎng)和增殖，從而有效治療腦膠質(zhì)瘤及其他miR-1229高表達(dá)的腫瘤。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102643811SQ201110040809
公開(kāi)日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2011年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月18日
發(fā)明者丁侃, 張佩琢, 李捷, 沈孝坤 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所, 蘇州吉瑪基因藥物科技有限公司