專利名稱：城市垃圾堆肥微生物組分的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，涉及城市垃圾堆肥微生物組分的提取方法。本發(fā)明為今后將采用生活垃圾堆肥分離培養(yǎng)的這些菌種應(yīng)用于草坪植物建植體系中提供了有力的技術(shù)支持。
背景技術(shù)：
堆肥化(composting)是利用自然界廣泛存在的微生物(細(xì)菌、放線菌、真菌等) 或商業(yè)菌株，有控制地促進(jìn)可被生物降解的有機(jī)物向穩(wěn)定的腐殖質(zhì)〔humicsubstance，HS) 轉(zhuǎn)化的生物化學(xué)過(guò)程。這一過(guò)程也是地球表面生態(tài)過(guò)程的一部分，它參與地球表面的物質(zhì)和能量循環(huán)。在人為控制條件下，通過(guò)堆肥化可以將固體廢物中的有機(jī)物轉(zhuǎn)化成為有機(jī)肥料一堆肥(compost)，這種有機(jī)肥料作為堆肥化的最終產(chǎn)物，不僅性能穩(wěn)定，并且對(duì)環(huán)境的危害甚小。因此，堆肥化是固體廢物，尤其是城市生活垃圾無(wú)害化、穩(wěn)定化和資源化的有效途徑之一。堆肥化發(fā)展至今，已經(jīng)歷了漫長(zhǎng)的歷史，對(duì)其產(chǎn)生和發(fā)展的歷史過(guò)程進(jìn)行回顧和分析，可為今后開發(fā)新的堆肥工藝技術(shù)提供理論和實(shí)踐上的借鑒和幫助。陳世和等(1989)采用垃圾培養(yǎng)基，在城市生活垃圾堆肥處理過(guò)程中，溫度達(dá) 45°C和55°C時(shí)，對(duì)堆肥菌株進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)在45°C時(shí)曲霉菌[Aspergillus]、芽孢桿菌屬[Bacillus]、假單孢菌屬[Pseudomonas]禾Π 芽孢乳桿菌屬[Sporolactobaci Ilus] 等是堆肥中的優(yōu)勢(shì)菌群。而到55°C時(shí)則有所不同，除了芽孢桿菌屬[Bacillus]和假單孢菌屬Pseudomonas]仍然為優(yōu)勢(shì)菌群外，乳酸桿菌屬[LactcAacilIus]、鏈球菌屬 [Streptococcus]和小單孢菌[Micromonospora]屬則成為新的優(yōu)勢(shì)菌群，替代了其它種微生物，表明在堆肥化過(guò)程中，微生物種群處在一個(gè)不斷變化的動(dòng)態(tài)平衡之中。從城市生活垃圾中分離出大量參與高溫好氧堆肥的微生物，經(jīng)鑒定分別為芽孢桿菌屬、假單孢菌屬，乳酸桿菌屬、葡萄球菌屬、埃希氏菌屬等5屬細(xì)菌；曲霉屬，毛霉屬、紅曲霉屬，青霉屬、地霉屬、霉屬、脈孢苗屬、頭孢霉屬等8屬霉菌；鏈霉菌屬1屬放線菌；酵母菌屬，裂殖酵母菌等2屬酵母菌。該研究結(jié)果有力地促進(jìn)了對(duì)垃圾堆肥中微生物的研究和利用。Hassen (2001)對(duì)城市垃圾堆肥過(guò)程誒生物變化的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，分解有機(jī)物產(chǎn)生的高溫引起微生物群落的重要變化，使致病菌、酵母菌及中溫菌大量減少，而產(chǎn)芽孢的桿菌大量存在，在堆肥過(guò)程中，高溫階段初期和中期階段細(xì)菌均占主要地位。馬文漪等也報(bào)道了嗜熱真菌，嗜熱褐色放線菌等參與垃圾堆肥的微生物種群。從城市生活垃圾中有機(jī)物的組成來(lái)看，而被微生物所分解利用。但各種微生物對(duì)各種物質(zhì)的分解能力和分解速度是不盡相同的，不同溫度下(中溫、高溫)堆肥過(guò)程中出現(xiàn)的微生物種群和數(shù)量上亦截然不同。近期的相關(guān)文獻(xiàn)及實(shí)際生產(chǎn)表明目前如何提高城市生活垃圾堆肥處理的技術(shù)水平、提高處理效率、改善產(chǎn)品質(zhì)量，一直是相關(guān)科研人員所重點(diǎn)關(guān)注的研究?jī)?nèi)容；在堆肥物料中針對(duì)特定物質(zhì)有目的的添加一些人工微生物制劑，已經(jīng)被很多研究所證實(shí)是可以加快堆肥腐熟，提高堆肥效率的方法?？紤]到在很多研究和生產(chǎn)實(shí)踐中，合理配比的復(fù)合菌劑往往較單一菌株更具好的效果，于是如何將堆肥中提取和篩選出來(lái)的各種功能菌株結(jié)合起來(lái)開發(fā)高效堆肥復(fù)合菌劑，從根本上優(yōu)化和合理配制使用城市垃圾堆肥基質(zhì)便成了相關(guān)科研人員研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。盡管植物接種微生物的效應(yīng)研究報(bào)道較多，但大部分研究工作涉及的微生物菌劑只限于從土壤中提取。生活垃圾堆肥化是利用自然界廣泛存在的微生物(細(xì)菌、放線菌、真菌等)或商業(yè)菌株，有控制地促進(jìn)可被生物降解的有機(jī)物向穩(wěn)定腐殖質(zhì)轉(zhuǎn)化的生物化學(xué)過(guò)程，是由群落結(jié)構(gòu)演替非常迅速的多個(gè)微生物群體共同作用而實(shí)現(xiàn)有機(jī)廢棄物資源化、無(wú)害化的動(dòng)態(tài)過(guò)程。研究表明，單一的細(xì)菌、真菌、放線菌群體，無(wú)論其活性多高，在加快堆肥化進(jìn)程中的作用都比不上復(fù)合微生物菌群的共同作用。Ros和Wrez-Piqueres等人研究了接種外源微生物復(fù)合菌劑對(duì)堆肥化過(guò)程中微生物的影響，有利于了解堆肥過(guò)程的生物化學(xué)過(guò)程及加入微生物制劑對(duì)堆肥的影響。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)堆肥過(guò)程中的微生物現(xiàn)象進(jìn)行了一系列理論和實(shí)踐研究，Vaz-Moreira等人對(duì)堆肥中細(xì)菌的群落多樣性進(jìn)行分析，以期深入認(rèn)識(shí)堆肥過(guò)程的本質(zhì)，為堆肥技術(shù)和工藝的研究提供理論基礎(chǔ)。鑒于此，從生活垃圾堆肥中分離微生物，在用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)將無(wú)疑具有重要重要作用，而這方面尚無(wú)細(xì)致和系統(tǒng)的開展工作。本技術(shù)就是為生活垃圾堆肥中微生物的應(yīng)用開辟前景。但在復(fù)合微生物菌劑研究過(guò)程中，有關(guān)堆肥內(nèi)部微生物種類的鑒定和分類，堆肥菌種之間共生及相互影響關(guān)系具有模糊性和復(fù)雜性，以及將堆肥微生物菌劑應(yīng)用于正常條件下對(duì)植物生長(zhǎng)的影響方面，相關(guān)研究也鮮為報(bào)道。而有關(guān)堆肥內(nèi)部微生物種類的鑒定和分類，堆肥菌種之間共生及相互影響關(guān)系具有模糊性和復(fù)雜性，以及從城市生活垃圾堆肥中提取篩選和配制堆肥復(fù)合有益微生物菌劑，并應(yīng)用于草坪建植體系，以改善草坪植物生長(zhǎng)、 生理特性方面的作用還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是公開了一種從堆肥原液中取出菌液，在適合不同菌種生長(zhǎng)的固體培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)分離，分離后的純菌種接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，從而鑒定堆肥有效微生物的組成，而應(yīng)用于草坪建植中。為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明公開了如下的技術(shù)內(nèi)容
一種從生活垃圾堆肥原液中提取微生物組分的方法，它是將城市垃圾堆肥在含高氏 Gause—號(hào)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的固體培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)分離，分離后的純菌種接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，從而鑒定堆肥中有效微生物的組成，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行
(1)配制固體培養(yǎng)基燒杯中加一定量的蒸餾水、去離子水或自來(lái)水，按配方稱取營(yíng)養(yǎng)成分，加入濃度為0. lg/L EDTA ；待全部營(yíng)養(yǎng)成分配齊后，用質(zhì)量濃度為100g/L的NaOH或質(zhì)量濃度為100g/L的HCHMfpH 4. 5-7. 2，然后加入緩沖劑，分裝，置高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌，冷卻備用；
(2)菌種分離培養(yǎng)
1)到平板每種培養(yǎng)基倒入3個(gè)皿中；
2)制備堆肥稀釋液稱取新鮮堆肥10克，放入盛90ml無(wú)菌水，振搖約20min，制成ΙΟ—1- 10_6稀釋度的堆肥溶液；
3)涂布將上述每種培養(yǎng)基的平板底部或培養(yǎng)基周邊用記號(hào)筆分別寫上10_4，10_5， 和10_6 3種稀釋度字樣，每種培養(yǎng)基每稀釋度標(biāo)記3皿，然后用滅過(guò)菌的量程為2(T200ul 的移液槍分別由10_4，10_5和10_6 3管堆肥稀釋液中吸取適量對(duì)號(hào)放入已寫好稀釋度的平板中央位置，每皿放入0. ani，用無(wú)菌玻璃涂棒，在培養(yǎng)基表面皿輕輕地涂布均勻，室溫下靜置 5 IOmin ；
4)培養(yǎng)將含高氏Gause—號(hào)培養(yǎng)基的平板倒置于溫室下培養(yǎng)5 7天，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的平板倒置于溫室下培養(yǎng)3飛天，牛肉膏蛋白胨平板倒置于37°C溫室中培養(yǎng)廣2天；
(3)配制液體培養(yǎng)基
1)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏1.258;蛋白胨2.58;妝(11.258;水250m ;PH 7. 0 7· 2,0. IMPa 滅菌 20min ；
2)馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基馬鈴薯40g，葡萄糖4g，水200mL，自然pH，0.IMPa滅菌20分
鐘；
3)高氏合成一號(hào)培養(yǎng)基可溶性淀粉4g;硝酸鉀0.28;氯化鈉0.^;三水合磷酸氫二鉀0. Ig ；七水合硫酸鎂0. Ig ；七水合硫酸亞鐵0. 002g ；瓊脂4g加入5%的酚溶液2滴，蒸溜水 200ml ；pH7. 2 7. 4,0. IMPa 滅菌 20 分鐘；
(4)接種純菌種用灼燒過(guò)的接種環(huán)取菌種，先將接種環(huán)接觸一下沒(méi)長(zhǎng)菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻以免燙死菌種，然后用接種環(huán)輕輕取菌少許，將取有菌種的接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基中，并使接種環(huán)在液體與瓶壁接觸的部位輕輕摩擦，使菌體分散于液體中，接種后塞上棉塞，使液體培養(yǎng)基輕輕搖動(dòng)，使菌體均勻分布于培養(yǎng)基中，以利生長(zhǎng)；
(5)菌種的增值培養(yǎng)將液體培養(yǎng)基放入旋轉(zhuǎn)式搖床進(jìn)行微生物振蕩培養(yǎng)，固定在搖床上的錐形瓶隨搖床以200-250r/min的速度運(yùn)動(dòng)，由此帶動(dòng)培養(yǎng)物圍繞著錐形瓶?jī)?nèi)壁平穩(wěn)轉(zhuǎn)動(dòng)，搖床恒溫30°C，培養(yǎng)Μ、》ι后，各培養(yǎng)基變混濁，表明各菌種已在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，置于冰箱中保存，得出堆肥微生物的組成菌種。本發(fā)明所述提取微生物組分的方法，其中的固體培養(yǎng)基為
(1)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏5. Og ；蛋白胨IOg ；NaCL 5g ；瓊脂20g ；水IOOOml ；PH 7. 0-7. 2,0. IMPa 滅菌 20min ；
(2)馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基馬鈴薯200g；葡萄糖(蔗糖)20g ；瓊脂15_20g ；水 IOOOml ；PH 自然，0. IMPa 滅菌 20min ；
(3)高氏合成一號(hào)培養(yǎng)基可溶性淀粉20g;硝酸鉀18;氯化鈉0.58;三水合磷酸氫二鉀0. 5g ；七水合硫酸鎂0. 5g ；七水合硫酸亞鐵0. Olg ；瓊脂20g，蒸餾水IOOOml ； ρΗ7· 2-7. 4,0. IMPa 滅菌 20min。本發(fā)明所述提取微生物組分的方法，其中所述的緩沖劑為=K2HPO4 , KH2PO4, Na2CO3、NaHCO3 或 NaOH。本發(fā)明所述提取微生物組分的方法，其中所述的KT1- 10_6稀釋度的堆肥溶液在測(cè)定
A.細(xì)菌數(shù)量時(shí)，采用10-4，10_5，10-6稀釋度；
B.放線菌數(shù)量時(shí)，采用10-3，10_4，10-5稀釋度；C.真菌數(shù)量時(shí)，采用10-2，10_3，10-4稀釋度。


圖1為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的細(xì)菌生長(zhǎng)情況； 圖2為高氏一號(hào)培養(yǎng)基上的放線菌生長(zhǎng)情況； 圖3為土豆培養(yǎng)基上的酵母菌生長(zhǎng)情況； 圖4為土豆培養(yǎng)基上的霉菌生長(zhǎng)情況； 圖5，圖6為枯草芽孢桿菌劃線分離和純化培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況； 圖7，圖8為放線菌劃線分離和純化培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況； 圖9，圖10為酵母菌劃線分離和純化培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況。
具體實(shí)施例方式為了更充分的解釋本發(fā)明的實(shí)施，提供下述制備方法實(shí)施實(shí)例。這些實(shí)施實(shí)例僅僅是解釋、而不是限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1
1研制材料與方法 1. 1試驗(yàn)材料
菌種來(lái)源天津六里臺(tái)實(shí)驗(yàn)基地垃圾堆肥原料。采土方式在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，先由人工撿去垃圾堆肥中的各類木頭、塑料、玻璃、 金屬等雜物。用小薩子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時(shí)分離。采好的樣應(yīng)及時(shí)處理，暫不能處理的也應(yīng)貯存于4°C冰箱中，但貯存時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，取天津市西青區(qū)天津師范大學(xué)的土壤基質(zhì)為對(duì)照。1. 2微生物的營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)
微生物的營(yíng)養(yǎng)要素
微生物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)應(yīng)滿足機(jī)體生長(zhǎng)、繁殖和完成各種生理活動(dòng)的需要。它們的作用可概括為形成結(jié)構(gòu)(參與細(xì)胞組成)，提供能量(機(jī)體進(jìn)行各種生理活動(dòng)所需要的能量)和調(diào)節(jié)作用(構(gòu)成酶的活性成分和物質(zhì)運(yùn)輸系統(tǒng))。微生物細(xì)胞的化學(xué)組成從一個(gè)側(cè)面反映了微生物生長(zhǎng)繁殖的物質(zhì)需要。雖然，隨微生物種類、生理狀態(tài)及環(huán)境的不同，其組成也有變化，但通過(guò)對(duì)細(xì)胞元素組成的分析可大體看出微生物所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。表1顯示細(xì)菌、酵母菌和霉菌的主要元素組成。這些元素主要以水、有機(jī)物和鹽的形式存在與細(xì)胞中；有機(jī)物主要是以蛋白質(zhì)、糖、核酸、維生素以及激素等形式存在。表1細(xì)菌、酵母菌和霉菌的元素組成(干重％)
權(quán)利要求
1.一種從生活垃圾堆肥原液中提取微生物組分的方法，它是將城市垃圾堆肥在含高氏 Gause—號(hào)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的固體培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)分離，分離后的純菌種接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，從而鑒定堆肥中有效微生物的組成，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行(1)配制固體培養(yǎng)基燒杯中加一定量的蒸餾水、去離子水或自來(lái)水，按配方稱取營(yíng)養(yǎng)成分，加入濃度為0. lg/L EDTA ；待全部營(yíng)養(yǎng)成分配齊后，用質(zhì)量濃度為100g/L的NaOH或質(zhì)量濃度為100g/L的HCHMfpH 4. 5-7. 2，然后加入緩沖劑，分裝，置高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌，冷卻備用；(2)菌種分離培養(yǎng)1)到平板每種培養(yǎng)基倒入3個(gè)皿中；2)制備堆肥稀釋液稱取新鮮堆肥10克，放入盛90ml無(wú)菌水，振搖約20min，制成 ΙΟ—1- 10_6稀釋度的堆肥溶液；3)涂布將上述每種培養(yǎng)基的平板底部或培養(yǎng)基周邊用記號(hào)筆分別寫上10_4，10_5，和 10_6 3種稀釋度字樣，每種培養(yǎng)基每稀釋度標(biāo)記3皿，然后用滅過(guò)菌的量程為2(T200ul的移液槍分別由10_4，10_5和10_6 3管堆肥稀釋液中吸取適量對(duì)號(hào)放入已寫好稀釋度的平板中央位置，每皿放入0. anl，用無(wú)菌玻璃涂棒，在培養(yǎng)基表面皿輕輕地涂布均勻，室溫下靜置 5 IOmin ；4)培養(yǎng)將含高氏Gause —號(hào)培養(yǎng)基的平板倒置于溫室下培養(yǎng)5 7天，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的平板倒置于溫室下培養(yǎng)3飛天，牛肉膏蛋白胨平板倒置于37°C溫室中培養(yǎng)廣2天；(3)配制液體培養(yǎng)基1)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏1.258;蛋白胨2.58;妝(11.258;水250m ;PH 7. 0 7· 2,0. IMPa 滅菌 20min ；2)馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基馬鈴薯40g，葡萄糖4g，水200mL，自然pH，0.IMPa滅菌20分鐘；3)高氏合成一號(hào)培養(yǎng)基可溶性淀粉4g;硝酸鉀0.28;氯化鈉0.^;三水合磷酸氫二鉀0. Ig ；七水合硫酸鎂0. Ig ；七水合硫酸亞鐵0. 002g ；瓊脂4g加入5%的酚溶液2滴，蒸溜水 200ml ；pH7. 2 7. 4,0. IMPa 滅菌 20 分鐘；(4)接種純菌種用灼燒過(guò)的接種環(huán)取菌種，先將接種環(huán)接觸一下沒(méi)長(zhǎng)菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻以免燙死菌種，然后用接種環(huán)輕輕取菌少許，將取有菌種的接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基中，并使接種環(huán)在液體與瓶壁接觸的部位輕輕摩擦，使菌體分散于液體中，接種后塞上棉塞，使液體培養(yǎng)基輕輕搖動(dòng)，使菌體均勻分布于培養(yǎng)基中，以利生長(zhǎng)；(5)菌種的增值培養(yǎng)將液體培養(yǎng)基放入旋轉(zhuǎn)式搖床進(jìn)行微生物振蕩培養(yǎng)，固定在搖床上的錐形瓶隨搖床以200-250r/min的速度運(yùn)動(dòng)，由此帶動(dòng)培養(yǎng)物圍繞著錐形瓶?jī)?nèi)壁平穩(wěn)轉(zhuǎn)動(dòng)，搖床恒溫30°C，培養(yǎng)Μ、》ι后，各培養(yǎng)基變混濁，表明各菌種已在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，置于冰箱中保存，得出堆肥微生物的組成菌種。
2.權(quán)利要求1所述提取微生物組分的方法，其中的固體培養(yǎng)基為(1)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏5. Og ；蛋白胨IOg ；NaCL 5g ；瓊脂20g ；水IOOOml ；PH 7. 0-7. 2,0. IMPa 滅菌 20min ；(2)馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基馬鈴薯200g；葡萄糖(蔗糖)20g ；瓊脂15_20g ；水 IOOOml ；PH 自然，0. IMPa 滅菌 20min ；(3)高氏合成一號(hào)培養(yǎng)基可溶性淀粉20g;硝酸鉀18;氯化鈉0.58;三水合磷酸氫二鉀0. 5g ；七水合硫酸鎂0. 5g ；七水合硫酸亞鐵0. Olg ；瓊脂20g，蒸餾水IOOOml ； ρΗ7· 2-7. 4，0. IMPa 滅菌 20min。
3.權(quán)利要求1所述提取微生物組分的方法，其中所述的緩沖劑為=K2HPO4、KH2PO4, Na2CO3、NaHCO3 或 NaOH。
4.權(quán)利要求1所述提取微生物組分的方法，其中所述的ΙΟ—1-10_6稀釋度的堆肥溶液在測(cè)定Α.細(xì)菌數(shù)量時(shí)，采用10-4，10_5，10-6稀釋度； B.放線菌數(shù)量時(shí)，采用10-3，10_4，10-5稀釋度；C.真菌數(shù)量時(shí)，采用10-2，10_3，10-4稀釋度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從生活垃圾堆肥原液中提取微生物組分的方法，它是將城市垃圾堆肥在適合不同菌種生長(zhǎng)的固體培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)、分離，以及分離后的純菌種接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，從而鑒定堆肥中有效微生物的組成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在城市垃圾堆肥中的優(yōu)勢(shì)菌種為枯草芽孢桿菌、放線菌及酵母菌，這些菌種不僅數(shù)量多而且有的種類也很多。本發(fā)明為今后將采用生活垃圾堆肥分離培養(yǎng)的這些菌種應(yīng)用于草坪植物建植體系中提供了有力的技術(shù)支持。
文檔編號(hào)C12N1/16GK102174404SQ201110037030
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月14日
發(fā)明者多立安, 王晶晶, 趙樹蘭 申請(qǐng)人:天津師范大學(xué)