專利名稱：碭山酥梨果實單果重主效qtl的分子標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子遺傳育種領域，提供了 ‘碭山酥梨’果實單果重主效QTL的分子標 記及其應用，可用于梨果實單果重性狀的早期分子輔助選擇，以提高育種效率。
背景技術：
梨(Pyrus L.)原產我國，是我國第三大果樹樹種。梨因其果實營養(yǎng)價值高，香甜 多汁，而深受消費者喜愛。梨果個大小即通常所說的單果重，是梨果實外觀品質和商品性狀 的重要指標之一，也是構成梨品種產量和經濟效益的重要因素，因此，梨果實單果重的大小 對梨品種至關重要。培育具有理想單果重的品種已經成為梨育種的重要目標之一。由于梨為多年生木本果樹作物，與果實品質相關的性狀大都是由多基因控制、易 受環(huán)境影響的數量性狀，在分離后代表現為廣泛的表型變異，其基因型與表現型間的對應 關系難以確定。而以往的傳統(tǒng)育種是基于經典數量遺傳學理論，把控制某一性狀的多個基 因作為整體進行研究和選擇，在現有基礎上改良目標性狀難度越來較大。近年來，隨著分子 標記技術的迅速發(fā)展、高密度的分子遺傳圖譜的出現，以及數量性狀作圖方法的不斷完善， 使得數量性狀基因座(Quantitative trait loci, QTL)定位變成了現實，也為提高目標數 量性狀優(yōu)良基因型選擇的可能性、準確性及預見性奠定了基礎。利用分子標記定位數量性 狀QTL，其實質就是分析分子標記與目標性狀QTL之間的連鎖關系，即利用已知座位的分子 標記來定位未知座位的QTL，通過計算分子標記與QTL之間的交換率，來確定QTL的具體位 置?；讷@得的標記基因型分離與數量性狀的量之間的關系，可直接把握數量性狀基因，并 開發(fā)可應用于分子標記輔助選擇(Molecular-assisted selection,MAS)育種的技術，這已 在許多重要農作物上取得了成功應用。目前有關梨數量性狀的QTL定位研究仍屬起步階段，已有的研究主要是針對一些 病害或生長性狀，對重要性狀梨單果重的QTL定位及分子標記的研究尚沒有開展。因此，開 展梨果實單果重主效基因的QTL定位，篩選緊密連鎖的分子標記，建立雜交后代早期輔助 選擇技術體系，對于提高梨果單果重品質改良效率，縮短育種進程，節(jié)約生產成本顯得尤為重要。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種‘碭山酥梨’果實單果重主效QTL的分子標記。本發(fā)明的另一目的在于提供一種‘碭山酥梨’果實單果重主效QTL的分子標記引 物。本發(fā)明的另一目的在于提供一種‘碭山酥梨’果實單果重主效QTL的分子標記方法。本發(fā)明的又一目的在于提供一種‘碭山酥梨’果實單果重主效QTL的分子標記在 梨分子育種中的應用。本發(fā)明定位梨果實單果重主效QTL，并提供與QTL位點緊密連鎖的分 子標記，通過檢測這些分子標記可以預測梨果實單果重，為實現對該性狀的早期鑒定和篩選提供分子輔助選擇技術支持。本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現一種‘碭山酥梨’果實單果重主效QTL的分子標記，是通過下列步驟獲得a)利用梨品種‘八月紅’梨和‘碭山酥梨’雜交獲得F1后代單株；b)用SSR、SRAP和AFLP三種分子標記方法分析兩個親本及其F1群體，統(tǒng)計分析在 親本間具有多態(tài)性的位點在后代群體中的遺傳類型。獲得多態(tài)性標記位點，然后對其進行 連鎖分析，構建‘碭山酥梨’的遺傳連鎖圖譜?？刹捎肑oinmap3.0作圖軟件對所獲得的多 態(tài)性標記位點進行連鎖分析。c)對‘八月紅’和‘碭山酥梨’雜交后代的F1群體單株的果實單果重進行測定， 利用區(qū)間作圖法(可利用MapQTL5.0作圖軟件)，將？工群體每個單株的果實單果重與‘碭 山酥梨’遺傳連鎖圖譜中的分子標記進行連鎖和QTL分析，以LOD值> 2. 5為標準，大于 2. 5說明存在一個QTL位點，在母本‘碭山酥梨’的第7連鎖群上檢測到單果重的QTL位 點Pfw-I，其LOD值為4. 24，是主效QTL，距離最近的一個SRAP分子標記為fe;3em4-242p*， 大小為M2bp JgPfV-I的距離為OcM，該標記可以作為梨果實單果重的標記，所篩選的 分子標記 fe!3em4-M2p* 的 SRAP 引物為 fe3 5 ' -GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3 ‘和 em4 5' -GACTGCGTACGAATTTGA-3‘。上述的‘碭山酥梨’果實單果重主效QTL的分子標記，其所述QTL位點PfV-I位于 ‘碭山酥梨’第13連鎖群上，其解釋48. 8%的單果重特征。一種‘碭山酥梨’果實單果重主效QTL的SRAP分子標記引物，其特征在于該引物 序列為fe3:5' -GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3‘禾Π em4 :5' -GACTGCGTACGAATTTGA-3‘。一種‘碭山酥梨’果實單果重主效QTL的分子標記方法，用梨基因組DNA，采用SRAP 引物 fe3:5' -GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3 ‘禾Pem4:5' -GACTGCGTACGAATTTGA-3 ‘擴增，擴 增產物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，如果獲得一個分子標記大小為M2bp，則 表明與梨果實單果重的主效QTL位點相連鎖的分子標記存在，該QTL位點PfV-I位于‘碭 山酥梨’第13連鎖群上，其解釋48. 8%的單果重特征。其PCR擴增體系為總體積20ul 其 中包含 0. 2mmol · L—dNTP，0. 3 μ mol · Γ1 上下游引物，2. Ommol · I^MgCl2,1 個單位的 daq 酶，DNA 模板 50ng, IXBuffer ；PCR 反應程序為94°C 3min ；35 個循環(huán)94°C 40s, 55°C 50s, 72°C Imin ；72°C IOmin, 10°C IOmin0上述‘碭山酥梨’果實單果重主效QTL的分子標記在梨分子育種中的應用。上述應用，其應用方法為用梨基因組DNA，采用SRAP引物fe3 5' -GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3 ’禾Pem4:5' -GACTGCGTACGAATTTGA-3 ‘擴增，擴增產物在 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，如果獲得一個分子標記大小為M2bp，則表明與 梨果實單果重的主效QTL位點相連鎖的分子標記存在，可預測該梨品種果實具有較低的單 果重。PCR擴增體系為總體積20ul 其中包含0. 2謹ol · L^dNTPjO-Sumol · L-1上下游引 物，2. Ommol · L4MgCl2,1 個單位的 rTaq 酶，DNA 模板 50ng，1 XBuffer ；PCR 反應程序為 940C 3min ；35 個循環(huán)94°C 40s, 55°C 50s, 72°C Imin ；72°C IOmin, 10°C IOmin0本發(fā)明的有益效果(1)本發(fā)明首次對決定‘碭山酥梨’果實單果重的數量性狀位點進行了 QTL定位， 這為實現基于分子育種的多基因控制性狀改良奠定了重要的基礎和必要的前提。
(2)本發(fā)明中確定了 ‘碭山酥梨’果實單果重的主效QTL位點，對該數量性狀決定 的貢獻率較高，位點的貢獻率為48. 8 %。因此，基于此位點篩選連鎖分子標記對目標性狀判 斷的準確性大大提高。(3)目前普遍認為可應用于分子輔助選擇的連鎖標記與目標性狀的距離需 彡5cM，本發(fā)明中與QTL位點連鎖的標記距離為OcM，與目標位點表現為緊密連鎖，這對于提 高分子標記輔助選擇的準確性和效率具有重要意義。因此，以上標記具有良好的應用價值， 可加快對梨果實單果重性狀改良的進度。


圖1為‘碭山酥梨’單果重QTL位點Pfw-I在Β 113上的位置。BYH代表的是‘碭山酥梨’連鎖群，BYH后的數字代表連鎖群數。連鎖群上左側的數字是標記之間的遺傳距離，單位為cM，右側則表示的是分子標 記的名稱。共有4種分子標記，“E-M-”為AFLP標記，E和M分別指限制性內切酶Eco I和 Mse I酶切，其后的數字是該標記多態(tài)性條帶的編號；其它為SRAP、SSR標記和一個自交不 親和S位點。連鎖群右側的實心長方形指示QTL作圖區(qū)間Pfw-I。圖2為SRAP引物組合fe;3em4對‘八月紅’梨和‘碭山酥梨’ Fl后代PCR擴增結果 在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測圖。箭頭所指的條帶即fe;3em4-M2p*，M 為 pBR322DNA/Msp I ladder。
具體實施例方式實施例1 a)利用我國的兩個梨品種‘八月紅’梨和‘碭山酥梨’雜交組合，獲得其97株F1群 體。b)用 SSR(Simple sequence repeat)、 SRAP(Sequence related amplified polymorphism)禾口AFLP(Amplified fragment length polymorphism)三禾中分子標記方法分 析兩個親本及其F1群體，統(tǒng)計分析在親本間具有多態(tài)性的位點在后代群體中的遺傳類型。 最終獲得了 23個SSRs、S基因位點、2 個SRAPs和482個AFLPs等共732個多態(tài)性標記 位點，然后利用Jionmap3. 0作圖軟件對其進行連鎖分析，構建了一張共包含240個多態(tài)性 標記的‘碭山酥梨’的遺傳連鎖圖譜。利用SSR、SRAP, AFLP分子標記方法，對‘八月紅’梨和‘碭山酥梨’及后代進行分 析，并統(tǒng)計分析在親本間具有多態(tài)性的位點在后代群體中的遺傳類型。SSR標記的實驗操作程序參考 Yomamoto T.等(Euphytica，2002，124 :129-137)的 方法；SRAP標記的實驗操作程序參考Li等(Theor Appl Genet, 2001,103 =455-461)的方 法；AFLP標記分別使用Eco I和Mes I兩種內切酶，具體實驗操作程序參考Vos等(Nucleic Acids Res，1995，23 :4407-4414)的方法。所用引物由上海英駿生物技術有限公司合成。S SR和SRAP標記用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠強堿銀染法檢測，AFLP標記用6%變性聚丙烯 酰胺凝膠銀染檢測。將SSR、SRAP、AFLP電泳圖譜上清晰出現的多態(tài)性條帶記為“ 1 ”，無帶記為“0”，不清楚的帶或缺失記為“_”，根據已知分子量的Marker (IOObp DNA Ladder)計算各多態(tài)性條 帶的分子量。將分離條帶按親本來源歸類，確定其來源及遺傳類型。利用χ 2測驗分析各 標記分離是否符合3 1或1 1的孟德爾分離比例，偏分離的在標記末尾用“*”標注。c)用Joinmap3. 0分析軟件構建‘碭山酥梨’的分子遺傳連鎖圖譜。將第b)步驟中得到的多態(tài)性標記位點按Joinmap3. 0分析軟件中適于cp群體構 圖的格式導入Joinmap3. 0，排除缺失數據過多的位點和顯著偏分離的位點，以LOD = 4. 0 7. 0，重組率=0. 4，選擇Kosambi作圖函數構建遺傳連鎖圖(Van Ooi jen, 2001)。d)對該F1群體單株的果實單果重進行了測定。將單果重的表型值和‘碭山酥梨’ 連鎖圖譜的相關文件導入MapQTL5. 0作圖軟件，選擇區(qū)間作圖法，以LOD值彡2. 5為標準， 對梨的單果重在‘碭山酥梨’的連鎖圖譜上進行QTL分析和定位。結果表明，在‘碭山酥梨’的第7連鎖群上檢測到單果重的QTL位點Pfw-I (圖1)， LOD值為4. 24，為主效QTL位點，與最近的SRAP分子標記fe;3em4-242p*的連鎖距離為lcM， 對該性狀的貢獻率為48.8%。該QTL位點與其最近標記的距離遠小于可應用于分子輔助選 擇的連鎖標記與目標性狀的所要求的最大距離。其中SRAP分子標記方法為，以梨DNA為模板，采用SRAP引物fe3 5' -GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3‘
em4 5' -GACTGCGTACGAATTTGA-3‘擴增條件SRAP分析的PCR擴增體系為總體積20ul 其中包含0. 2mmol ·ΓΜΝΤΡ, 0. 3 μ mol · L—1 上下游引物，2. (toimol · L^1MgCl2,1 個單位的 rTaq 酶，DNA 模板 50ng， IX Buffer。PCR 反應程序為94 "C 3min ；35 個循環(huán)94 "C 40s, 55 "C 50s, 72 "C Imin ； 72°C IOmin,10°C IOmin ；擴增產物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，能擴增出14條多態(tài)性條 帶，其中M2bp大小的一條就是目標條帶fe;3em4-242p*，則表明與QTL位點Pfw-I (圖1)相 連鎖的分子標記存在，該QTL位點與SRAP分子標記fe;3em4-242p*的連鎖距離為OcM，對該 性狀的貢獻率為48.8%。實施例2利用篩選到的與‘碭山酥梨’果實單果重主效QTL相連鎖的分子標記對‘八月紅’ 梨與‘碭山酥梨’的97株F1雜交后代進行初步檢測，以檢測該方法在梨果實單果重分子標 記輔助選擇中的實用價值。用該97株后代的基因組DNA及SRAP引物fe3和em4進行PCR 反應，SRAP分析的PCR擴增體系為總體積20ul 其中包含0. 2mmol · ΓΜΝΤΡ, 0. 3 μ mol · Γ1 上下游引物，2. Ommol · L^1MgCl2,1 個單位的 rTaq 酶，DNA 模板 50ng, 1 XBuffer。PCR 反應 程序為94°C 3min ；；35 個循環(huán)94°C 40s, 55°C 50s, 72°C Imin ；72°C IOmin, 10°C lOmin。PCR 擴增結果在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(結果如圖2~)，電泳后根據fe:3em4-242p*條帶 的有無來確定是否存在相應的標記，如果存在標記，說明該植株的果實單果重低，不存在則 說明高，同時用實際測得的果實單果重結果與分子標記檢測結果進行驗證。結果顯示，在‘八月紅，梨與‘碭山酥梨，的97株F1雜交后代中，共有80株的DNA 擴增結果出現fe:3em4-242p*條帶，這80株當中有35株的果實單果重小于160g，所有這80 株的果實單果重平均值為176. 46g ；共有12株后代的DNA擴增結果不出現fe;3em4-242p*條 帶，其中10株的單果重大于160g，所有這12株的果實單果重的平均值為184. 06g ;5個單株條帶缺失。用fe:3em4-242p*預測單果重有較好的預測效果。
權利要求
1.一種‘碭山酥梨’果實單果重主效QTL的分子標記，其特征在于是通過下列步驟獲得a)利用梨品種‘八月紅’梨和‘碭山酥梨’雜交獲得F1后代單株；b)用SSR、SRAP和AFLP三種分子標記方法分析兩個親本及其F1群體，統(tǒng)計分析在親本 間具有多態(tài)性的位點在后代群體中的遺傳類型。獲得多態(tài)性標記位點，然后對其進行連鎖 分析，構建‘碭山酥梨’的遺傳連鎖圖譜。c)對‘八月紅’梨和‘碭山酥梨’雜交后代的F1群體單株的果實單果重進行測定，利用 區(qū)間作圖法，將&群體每個單株的果實單果重與‘碭山酥梨’遺傳連鎖圖譜中的分子標記進 行連鎖和QTL分析，以LOD值> 2. 5為標準，大于2. 5說明存在一個QTL位點，在母本‘碭 山酥梨’的第7連鎖群上檢測到單果重的QTL位點Pfw-Ι，其LOD值為4. 24，是主效QTL， 距離最近的一個SRAP分子標記為fe;3em4-242p*，大小為M^pJg Pfw-I的距離為OcM，該 標記可以作為梨果實單果重的標記，所篩選的分子標記fe:3em4-242p*的SRAP引物為fe3 5' -GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3’禾Π em4 :5' -GACTGCGTACGAATTTGA-3‘。
2.根據權利要求1所述的‘碭山酥梨’果實單果重主效QTL的分子標記，其特征在于 所述QTL位點PfV-I位于‘碭山酥梨’第13連鎖群上，其解釋48. 8%的單果重特征。
3.—種‘碭山酥梨’果實單果重主效QTL的SRAP分子標記引物，其特征在于該引物序 列為fe3:5' -GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3‘禾Π em4 :5' -GACTGCGTACGAATTTGA-3‘。
4.一種‘碭山酥梨’果實單果重主效QTL的分子標記方法，其特征在于用 梨基因組 DNA，采用 SRAP 弓丨物 fe3 :5 ' -GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3 ‘禾Π em4 5 ‘ -GACTGCGTACGAATTTGA-3 ‘擴增，擴增產物在8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離， 如果獲得一個分子標記大小為M2bp，則表明與梨果實單果重的主效QTL位點PfV-I相連鎖 的分子標記存在，Pfw-I位于‘碭山酥梨’第13連鎖群上，其解釋48. 8%的單果重特征。
5.根據權利要求4所述的‘碭山酥梨’果實單果重主效QTL的分子標記方法，其特征 在于PCR擴增體系為總體積20ul 其中包含0. 2mmol · Ι7ΜΝΤΡ，0. 3 μ mol · L-1上下游引 物，2. Ommol · L4MgCl2,1 個單位的 rTaq 酶，DNA 模板 50ng，1 XBuffer ；PCR 反應程序為 940C 3min ；35 個循環(huán)94°C 40s, 55°C 50s, 72°C Imin ；72°C IOmin, 10°C IOmin0
6.權利要求1或2中任意一項所述‘碭山酥梨’果實單果重主效QTL的分子標記在梨 分子育種中的應用。
7.根據權利要求6所述應用，其特征在于用梨基因組DNA，采用SRAP引物fe3 5' -GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3 ’禾Π em4 :5 ‘ -GACTGCGTACGAATTTGA-3 ‘擴增，擴增產物在 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，如果獲得一個分子標記大小為M2bp，則表明與 梨果實單果重的主效QTL位點相連鎖的分子標記存在，可預測該梨品種果實具有較低的單果重。
8.根據權利要求7所述應用，其特征在于PCR擴增體系為總體積20ul其中包含 0. 2mmol .I^dNTP，0. 3 μ mol ·Γ1 上下游引物，2. Ommol .I^MgCl2,1 個單位的 daq 酶，DNA 模 板 50ng，IXBuffer ；PCR 反應程序為-MV 3min ；35 個循環(huán)94°C 40s, 55°C 50s, 72°C Imin ； 72°C IOmin,10°C IOmin0
全文摘要
本發(fā)明屬于遺傳育種領域，涉及‘碭山酥梨’果實單果重主效QTL的分子標記及其應用。利用SRAP、SSR、AFLP構建‘碭山酥梨’的遺傳連鎖圖譜，結合對果實單果重的表型鑒定，采用區(qū)間作圖法對此群體進行分析，在‘碭山酥梨’的第13連鎖群上檢測到主效QTL的存在，可解釋48.8％的單果重特征。距離主效QTL位點Pfw-1距離最近的標記為fe3em4-242p*，其距離為0cM。所獲得的單果重主效QTL分子標記對于加快梨品種的遺傳改良進程，提高育種選擇效率具有重要的理論和實踐指導意義。
文檔編號C12N15/10GK102140455SQ20111003184
公開日2011年8月3日 申請日期2011年1月29日 優(yōu)先權日2011年1月29日
發(fā)明者吳俊 , 吳華清, 張瑞萍, 張紹鈴, 陶書田, 齊開杰 申請人:南京農業(yè)大學