專(zhuān)利名稱(chēng)：用于制備感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞與其用途、新穎的大腸桿菌與其用途以及制備感受態(tài)細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于制備感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞，且特別涉及一種具備在細(xì)胞內(nèi)自發(fā)性累積自體產(chǎn)生的(self-producing)海藻糖能力的細(xì)胞，以及以此細(xì)胞來(lái)制備感受態(tài)細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
使帶有遺傳信息的DNA分子進(jìn)入宿主細(xì)胞的過(guò)程即所謂的“轉(zhuǎn)化 (transformation) ”。而宿主細(xì)胞經(jīng)過(guò)物理或化學(xué)方式處理而因此具有容易讓DNA分子進(jìn)入胞內(nèi)的特性，即稱(chēng)為“感受態(tài)細(xì)胞(competent cell)”。在分子生物學(xué)領(lǐng)域及遺傳工程操作上，為了使宿主細(xì)胞進(jìn)行特定DNA或蛋白質(zhì)的復(fù)制或表達(dá)，獲得具有易于轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，即成了重要而不可或缺的步驟。由于大腸桿菌(Escherichia coli)具有生長(zhǎng)快速、容易培養(yǎng)與研究較透徹等優(yōu)勢(shì)，目前已成為所有生物技術(shù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)中最廣泛地用作宿主細(xì)胞的微生物。在近代遺傳工程技術(shù)演進(jìn)的歷程上，已有許多制備具轉(zhuǎn)化能力的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法及轉(zhuǎn)化程序，例如，最早 1970 年 Mandel，M.和 Higa A. (J. Mol. Biol. 53 159)發(fā)表的 CaCl2 化學(xué)轉(zhuǎn)化法，以及之后 1983 年 Hanahan，D. (J. Mol. Biol. 166 :557)禾Π 1990 年 Inoue，H. (Gene 96 23)相繼通過(guò)在轉(zhuǎn)化試劑中加入其它不同濃度的陽(yáng)離子和抗凍劑進(jìn)行改良。而目前較佳的轉(zhuǎn)化效率已可達(dá)約IO8轉(zhuǎn)化子/微克質(zhì)粒DNA(transformants/ μ g plasmid DNA)。而根據(jù)上述制備具轉(zhuǎn)化能力的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法所產(chǎn)生的感受態(tài)細(xì)胞， 其后續(xù)所需的儲(chǔ)藏溫度仍皆需為-70至-80°C左右，才能使感受態(tài)細(xì)胞在保存數(shù)月后轉(zhuǎn)化效率不至于明顯降低。近幾年美國(guó)Life Technologies公司研發(fā)出一種對(duì)溫度相對(duì)穩(wěn)定型的感受態(tài)細(xì)胞的相關(guān)技術(shù)(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7，648，83 ，其突破傳統(tǒng)上感受態(tài)細(xì)胞必需保存于-70至-80°C 左右的低溫才能維持穩(wěn)定轉(zhuǎn)化效率的限制。該實(shí)施方式是在制備和保存感受態(tài)細(xì)胞的試劑中添加特定糖類(lèi)或化學(xué)聚合物分子作為抗凍保護(hù)劑，因而可將制備完成的感受態(tài)細(xì)胞置于較高溫度(例如-20°C )保存，且又不會(huì)明顯降低原有的轉(zhuǎn)化效率。前述技術(shù)雖然在保存條件的要求上較先前傳統(tǒng)制備方法節(jié)能及方便運(yùn)送，然而額外添加的特定抗凍保護(hù)劑相對(duì)地也提高了制備上的成本。因此目前亟需開(kāi)發(fā)出一種應(yīng)用于感受態(tài)細(xì)胞的制備的新穎物件及方法，使因此產(chǎn)生的感受態(tài)細(xì)胞可于較高溫進(jìn)行保存并同時(shí)達(dá)到節(jié)能、低成本與易于運(yùn)送等優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)而使生物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的實(shí)施更為簡(jiǎn)易且經(jīng)濟(jì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種用于制備感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞，其中該細(xì)胞具備在細(xì)胞內(nèi)自發(fā)性累積自體產(chǎn)生的海藻糖的能力，且該細(xì)胞用于感受態(tài)細(xì)胞的制備。
本發(fā)明另外提供一種將具備在細(xì)胞內(nèi)自發(fā)性累積自體產(chǎn)生的海藻糖的能力的細(xì)胞用于制備感受態(tài)細(xì)胞的用途。本發(fā)明還提供一種大腸桿菌(Escherichia coli)，命名為大腸桿菌EcDTreOOl， 其保藏于中國(guó)臺(tái)灣食品工業(yè)發(fā)展研究所生物資源保存及研究中心，保藏編號(hào)為BCRC No. 910491，其中該大腸桿菌具備在細(xì)胞內(nèi)自發(fā)性累積自體產(chǎn)生的海藻糖的能力。所述大腸桿菌(命名為大腸桿菌(Escherichia coli)EcDTreOOl)也于2010年11 月11日保藏在德國(guó)微生物菌種保藏中心(DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)，Inhoffenstr. 7B, D-38124 不倫瑞克)，保藏號(hào)為 DSM 24175。本發(fā)明還提供一種將上述大腸桿菌用于制備感受態(tài)細(xì)胞的用途。本發(fā)明又提供一種制備感受態(tài)細(xì)胞的方法，包括培養(yǎng)上述用于制備感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞以獲得細(xì)胞懸浮液；將該細(xì)胞懸浮液置于冰浴中；離心該細(xì)胞懸浮液以獲得細(xì)胞沉淀；混合轉(zhuǎn)化試劑和該細(xì)胞沉淀；以及獲得感受態(tài)細(xì)胞懸浮液。為了讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征、和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉優(yōu)選具體實(shí)施方案，并配合所附圖式，詳細(xì)說(shuō)明如下


圖1為曲線(xiàn)圖，其顯示W(wǎng)T和TG兩種感受態(tài)細(xì)胞懸浮液在以_20°C保存6個(gè)月間的轉(zhuǎn)化效率的穩(wěn)定度差異。圖2為長(zhǎng)條圖，其顯示W(wǎng)T(a)、TG(a)、WT(b)和TG(b)四種感受態(tài)細(xì)胞懸浮液以-80°C及-20°C保存6個(gè)月間的轉(zhuǎn)化效率的穩(wěn)定度差異。圖3A顯示，在實(shí)施例3中形成WT-B和TG-B組的感受態(tài)細(xì)胞懸浮液的過(guò)程。圖;3B為長(zhǎng)條圖，其顯示W(wǎng)T、WT_B、TG和TG-B四組感受態(tài)細(xì)胞懸浮液在以_20°C保存6個(gè)月后的轉(zhuǎn)化效率的差異。主要組件符號(hào)說(shuō)明
301 -、鋁珠；
303 -、感受態(tài)細(xì)胞懸浮液；
305 -、試管；
307 -、感受態(tài)細(xì)胞懸浮液與鋁珠的混合物
309 -、質(zhì)粒；
311 - W水??；
313 -、熱休克；
315 -、瓊脂培養(yǎng)基。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中，本發(fā)明提供一種具備在細(xì)胞內(nèi)自發(fā)性累積自體產(chǎn)生的 (self-producing)海藻糖(trehalose)的能力的細(xì)胞，并將此細(xì)胞用于感受態(tài)細(xì)胞的制備。在細(xì)胞內(nèi)累積的海藻糖可幫助細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)避免因低溫造成的變性與聚集，同時(shí)也具有穩(wěn)定細(xì)胞膜的功能。因此，由本發(fā)明細(xì)胞所制備出的感受態(tài)細(xì)胞，相對(duì)于先前技術(shù)具有可在相對(duì)于較高溫且不需外加特定糖類(lèi)或化學(xué)聚合物分子為抗凍劑的環(huán)境中進(jìn)行保存等優(yōu)點(diǎn)，且具有高轉(zhuǎn)化效率。另外此處使用的措辭“自體產(chǎn)生的海藻糖”是指細(xì)胞內(nèi)(within a cell)所產(chǎn)生的海藻糖，而非額外添加于細(xì)胞培養(yǎng)基的海藻糖。上述本發(fā)明的細(xì)胞可通過(guò)對(duì)微生物進(jìn)行隨機(jī)突變篩選或遺傳工程改造而獲得，但不限于此。微生物可包括，但不限于大腸桿菌(Escherichia coli)、酵母菌或霉菌。大腸桿菌可包括，但不限于 DH5 α、JM109、XL1-Blue、HBlOl 或 BL21 等。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞通過(guò)對(duì)微生物進(jìn)行遺傳工程改造而獲得。 上述遺傳工程改造可包括使微生物過(guò)表達(dá)至少一個(gè)內(nèi)源性編碼海藻糖合成相關(guān)酶的基因、 和/或敲除微生物基因組中至少一個(gè)內(nèi)源性編碼海藻糖分解相關(guān)酶的基因、和/或?qū)⒅辽僖粋€(gè)編碼外源性海藻糖合成相關(guān)酶的基因引入微生物的基因組中。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，使微生物過(guò)表達(dá)至少一個(gè)內(nèi)源性編碼海藻糖合成相關(guān)酶的基因是通過(guò)將至少一個(gè)與目標(biāo)微生物基因組中的特定基因的核苷酸序列相同或相似的核苷酸序列插入目標(biāo)微生物中實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)一般重組技術(shù)可實(shí)現(xiàn)上述微生物遺傳工程改造(參見(jiàn)，例如Sambrook等人， Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press·)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，微生物遺傳工程改造可以下述方法來(lái)進(jìn)行。通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction)從與目標(biāo)微生物同種的細(xì)胞獲得上述至少一個(gè)編碼海藻糖合成相關(guān)酶的基因的核苷酸序列，和/或通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從一種與目標(biāo)微生物不同種的細(xì)胞獲得上述至少一個(gè)編碼海藻糖合成相關(guān)酶的基因的核苷酸序列。待獲得的酶基因的信息可從例如GenBank檢索。若需要的話(huà)，可根據(jù)所使用的目標(biāo)微生物的不同，將所獲得的序列進(jìn)行編碼最佳化以使其以后在宿主微生物中獲得最佳使用。之后，將由此制備的至少一個(gè)編碼出海藻糖合成相關(guān)酶基因的核苷酸序列，和/ 或至少一個(gè)編碼出海藻糖合成相關(guān)酶基因的核苷酸序列插入適合其表達(dá)的載體以產(chǎn)生表達(dá)上述酶的DNA構(gòu)建體(DNAconstruct)。或者，進(jìn)一步將上述DNA構(gòu)建所形成的基因表達(dá)盒的兩端，再各連結(jié)一段可與編碼出海藻糖分解相關(guān)酶基因的核苷酸序列進(jìn)行重組交換進(jìn)而刪除此海藻糖分解相關(guān)酶基因的核苷酸序列。或是制備出至少一段可與目標(biāo)微生物基因組中編碼出海藻糖分解相關(guān)酶的基因的核苷酸序列進(jìn)行重組交換進(jìn)而刪除此基因的核苷酸序列。然后，將包含于表達(dá)構(gòu)建體中的上述基因表達(dá)盒或上述可與目標(biāo)細(xì)胞基因組中編碼出海藻糖分解相關(guān)酶的基因的核苷酸序列進(jìn)行重組交換進(jìn)而刪除此海藻糖分解相關(guān)酶基因的核苷酸序列引入目標(biāo)細(xì)胞中，并選擇陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子(positive transformant)以獲得本發(fā)明的經(jīng)遺傳工程改造的細(xì)胞。又通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域所知的方法，例如，免疫印跡或酶活性分析，可確認(rèn)上述基因的過(guò)表達(dá)或沉默刪除，或者基因的插入。此處使用的措辭“海藻糖合成相關(guān)酶”是指參與海藻糖合成的酶(例如，敘述于 Seo 等人，Appl. Environ. Microbiol. ,66(6) :2484_2490，2000 中的大腸桿菌(Escherichia coli)海藻糖合成相關(guān)酶)，其可為將其它分子經(jīng)過(guò)至少一步的反應(yīng)而轉(zhuǎn)換為海藻糖 (trehalose)的單一酶或酶群或其功能等同物(functional equivalents)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，上述海藻糖合成相關(guān)酶可包括，但不限于海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase, TPS) (EC2. 4. 1. 15)、海藻糖 _6_ 磷酸 舞酸 Bl (trehalose-6-phosphate phosphatase, TPP)(EC 3. 1.3.12)> α , α _ 海藻 || 磷酸合成酶(UDP 形成)(α，α -trehalose-phosphate synthase (UDP-forming)) (EC 2.4.1.15)、α , α-海藻糖合成酶(α，α -trehalose synthase) (EC 2. 4. 1. 245)、海藻糖磷酸酶(trehalose-phosphatase) (EC 3. 1. 3. 12)、4_ α -D- ((1 — 4) - α -D-葡萄糖酸)
M 7K 0 S$ (4-alpha-D-((l 4) -alpha-D-glucano)trehalosetrehalohydrolase) (EC 3. 2. 1. 141)、(1 — 4)-a -D-葡聚糖 1_ a -D-葡糖基變位酶((1 — 4) - a -D-glucan 1-a -D-glucosylmutase) (EC 5· 4· 99· 15)、α -D-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 (α -D-glucosyltransferase) (EC 5. 4. 99. 16)和/或前述酶的功能等同物等。上述海藻糖合成相關(guān)酶的詳細(xì)資料如表1所示。表1、示范的海藻糖合成相關(guān)酶
權(quán)利要求
1.一種用于制備感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞，其中該細(xì)胞具備在細(xì)胞內(nèi)自發(fā)性累積自體產(chǎn)生的海藻糖的能力，且該細(xì)胞用于感受態(tài)細(xì)胞的制備。
2.如權(quán)利要求1所述的用于制備感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞，其中該細(xì)胞通過(guò)對(duì)微生物進(jìn)行隨機(jī)突變篩選或遺傳工程改造而獲得。
3.如權(quán)利要求2所述的用于制備感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞，其中所述微生物包括大腸桿菌、 酵母菌或霉菌。
4.如權(quán)利要求3所述的用于制備感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞，其中所述大腸桿菌包括DH5α、 JM109、XL1-Blue、HBlOl 或 BL21。
5.如權(quán)利要求2所述的用于制備感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞，其中所述遺傳工程改造包括使所述微生物過(guò)表達(dá)至少一個(gè)內(nèi)源性編碼海藻糖合成相關(guān)酶的基因、和/或敲除所述微生物基因組中至少一個(gè)內(nèi)源性編碼海藻糖分解相關(guān)酶的基因、和/或?qū)⒅辽僖粋€(gè)編碼外源性海藻糖合成相關(guān)酶的基因引入該微生物的基因組中。
6.如權(quán)利要求5所述的用于制備感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞，其中該海藻糖合成相關(guān)酶包括海藻糖-6-磷酸合成酶(EC 2. 4. 1. 15)、海藻糖-6-磷酸磷酸酶(EC 3. 1. 3. 12)、α，α -海藻糖磷酸合成酶(UDP形成)(EC 2. 4. 1.15), α, α -海藻糖合成酶(EC 2. 4. 1. 245)、海藻糖磷酸酶(EC 3. 1.3. 12)、4-0-0-((1 — 4)-(1-0-葡萄糖酸)海藻糖水解酶(EC 3.2. 1. 141)、 (1 — 4)-α-D-葡聚糖1-α-D-葡糖基變位酶(EC 5.4.99.15)、α-D-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 (EC5. 4. 99. 16)和/或前述酶的功能等同物。
7.如權(quán)利要求5所述的用于制備感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞，其中所述海藻糖分解相關(guān)酶包括細(xì)胞質(zhì)海藻糖酶、周質(zhì)海藻糖酶和/或前述酶的功能等同物。
8.如權(quán)利要求1所述的用于制備感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞，其中該細(xì)胞通過(guò)使大腸桿菌 DH5a的細(xì)胞過(guò)表達(dá)至少一個(gè)內(nèi)源性編碼海藻糖合成相關(guān)酶的基因和敲除該大腸桿菌 DH5 α的細(xì)胞基因組中至少一個(gè)內(nèi)源性編碼海藻糖分解相關(guān)酶的基因來(lái)獲得。
9.如權(quán)利要求8所述的用于制備感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞，其中所述海藻糖合成相關(guān)酶包括海藻糖-6-磷酸合成酶和海藻糖-6-磷酸磷酸酶。
10.如權(quán)利要求9所述的用于制備感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞，其中所述海藻糖-6-磷酸合成酶的氨基酸序列和該海藻糖-6-磷酸磷酸酶的氨基酸序列分別為序列辨識(shí)號(hào)1的序列和序列辨識(shí)號(hào)2的序列。
11.如權(quán)利要求9所述的用于制備感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞，其中編碼所述海藻糖-6-磷酸合成酶基因的核苷酸序列和編碼所述海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因的核苷酸序列分別為序列辨識(shí)號(hào)3的序列和序列辨識(shí)號(hào)4的序列，或與前述序列具有至少80%序列相似性的序列。
12.如權(quán)利要求8所述的用于制備感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞，其中該海藻糖分解相關(guān)酶包括細(xì)胞質(zhì)海藻糖酶。
13.如權(quán)利要求12所述的用于制備感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞，其中編碼該細(xì)胞質(zhì)海藻糖酶基因的核苷酸序列為序列辨識(shí)號(hào)5的序列，或與前述序列具有80%序列相似性的序列。
14.如權(quán)利要求8所述的用于制備感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞，其中所述海藻糖分解相關(guān)酶包括周質(zhì)海藻糖酶。
15.如權(quán)利要求14所述的用于制備感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞，其中編碼出該周質(zhì)海藻糖酶基因的核苷酸序列為序列辨識(shí)號(hào)6的序列，或與前述序列具有80%序列相似性的序列。
16.如權(quán)利要求1所述的用于制備感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞于2010年11月 11日保藏在德國(guó)微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)為DSM 24175.
17.一種將具備在細(xì)胞內(nèi)自發(fā)性累積自體產(chǎn)生的海藻糖的能力的細(xì)胞用于制備感受態(tài)細(xì)胞的用途。
18.一種新穎的大腸桿菌，其保藏于德國(guó)微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)為DSM 24175, 其中該大腸桿菌具備在細(xì)胞內(nèi)自發(fā)性累積自體產(chǎn)生的海藻糖的能力。
19.一種將權(quán)利要求18所述的大腸桿菌用于制備感受態(tài)細(xì)胞的用途。
20.一種制備感受態(tài)細(xì)胞的方法，包括培養(yǎng)如權(quán)利要求1所述的用于制備感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞以獲得細(xì)胞懸浮液；將該細(xì)胞懸浮液置于冰浴中；離心該細(xì)胞懸浮液以獲得細(xì)胞沉淀；混合轉(zhuǎn)化試劑和該細(xì)胞沉淀；以及獲得感受態(tài)細(xì)胞懸浮液。
21.如權(quán)利要求20所述的制備感受態(tài)細(xì)胞的方法，其中所述感受態(tài)細(xì)胞懸浮液保存于-10°C以下。
22.如權(quán)利要求20所述的制備感受態(tài)細(xì)胞的方法，其中所述感受態(tài)細(xì)胞懸浮液保存于-20"C。
23.如權(quán)利要求20所述的制備感受態(tài)細(xì)胞的方法，另外包括將至少一個(gè)固體球狀物加至所述感受態(tài)細(xì)胞懸浮液中。
24.如權(quán)利要求23所述的制備感受態(tài)細(xì)胞的方法，其中所述固體球狀物的形成材料包括玻璃、陶瓷、不銹鋼、鐵或鋁。
25.如權(quán)利要求23所述的制備感受態(tài)細(xì)胞的方法，其中所述固體球狀物的粒徑為約 2-6mm。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于制備感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞與其用途、新穎的大腸桿菌與其用途以及制備感受態(tài)細(xì)胞的方法。本發(fā)明提供了一種用于制備感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞，其中該細(xì)胞具備在細(xì)胞內(nèi)自發(fā)性累積自體產(chǎn)生的海藻糖的能力，且該細(xì)胞用于感受態(tài)細(xì)胞的制備。
文檔編號(hào)C12N1/19GK102559507SQ20111002131
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月14日
發(fā)明者洪婷婷, 王嘉宏, 蔡孟吟, 鄧克立 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人工業(yè)技術(shù)研究院