專利名稱：能防治茄子青枯病的拮抗菌及其微生物有機(jī)肥料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能防治茄子青枯病的拮抗菌及其微生物有機(jī)肥料，屬于農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)技術(shù)，專用于防治茄子青枯病問題。背景技術(shù)：
茄子青枯病是由茄科勞爾氏菌Ofehtoflia solanacearum)侵染所致，是一種細(xì)菌性土傳疾病。茄子在世界各地均有栽培，茄子青枯病已成為影響茄子高產(chǎn)的主要障礙，在我國，主要是長江流域普遍受其為害，一般可減產(chǎn)20 9Γ30 %，嚴(yán)重時(shí)損失50 9Γ60 %。特別是近年來隨著蔬菜生產(chǎn)集約化程度的提高，該病已成為茄子的主要病害，而且很難根除，迄今為止還沒有發(fā)現(xiàn)有效的殺菌劑。另一方面，水稻、小麥、玉米、油菜等作物秸稈就地焚燒、規(guī)模化養(yǎng)殖后的畜禽糞便隨地棄置等，使大量的養(yǎng)分資源流失于土壤-植物系統(tǒng)之外，不僅嚴(yán)重污染了環(huán)境，也極大地浪費(fèi)了能作為有機(jī)肥和生物有機(jī)肥生產(chǎn)原料的有機(jī)物資源，不利于我國農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。如何將從土壤中因作物收獲而取走的營養(yǎng)元素最大限度地歸還到土壤中去，唯一的途徑就是將這些固體有機(jī)廢棄物制成商品有機(jī)肥料再施入土壤。將這些固體有機(jī)廢棄物經(jīng)過高溫發(fā)酵合成高品位的有機(jī)堆肥，再用作功能菌的載體，制成功能明確的微生物有機(jī)肥料， 具有廣闊的應(yīng)用前景。三
發(fā)明內(nèi)容
1.技術(shù)問題
本發(fā)明的目的在于研制一種能防治茄子青枯病的微生物有機(jī)肥料，對(duì)茄子青枯病的防治效率達(dá)到80%以上，使大量的茄子連作障礙土壤得到生物修復(fù)，確保集約化農(nóng)業(yè)的順利發(fā)展。技術(shù)方案
一株能克服或消除連作茄子青枯病的拮抗菌菌株II-36，屬于枯草芽孢桿菌iBacillus subtilis\保藏日期2010年9月14日，保藏號(hào)分別為CGMCC NO. 4158 ；地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)。菌株11-36的主要生物學(xué)特性為革蘭氏染色陽性G+，細(xì)胞為桿狀，過氧化氫酶陽性，淀粉水解陽性，V. P.反應(yīng)陽性，甲基紅試驗(yàn)陰性，纖維素分解陰性，明膠水解陽性，硝酸鹽還原陽性，吲哚試驗(yàn)陽性，能利用檸檬酸鹽，能產(chǎn)氨，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，發(fā)酵L-阿拉伯糖、甘露糖只產(chǎn)酸。用上述能防治茄子青枯病的拮抗菌菌株11-36所生產(chǎn)的微生物有機(jī)肥料中拮抗菌含量達(dá)IXlO8 cfu · g—1以上，全氮含量為4 5% (90%以上為有機(jī)氮)，總氮磷鉀養(yǎng)分為 6 10%、有機(jī)質(zhì)含量為30 35%。其生產(chǎn)方法包括
1)將拮抗菌II-36接種到改良牛肉膏液體培養(yǎng)基，分別進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵生產(chǎn)的條件為培養(yǎng)溫度范圍3(T35°C，攪拌速度為18(T300 rpm，發(fā)酵中后期形成芽孢，使發(fā)酵液中含菌或芽孢量> IXIOki Cfu-HiF10所用改良牛肉膏培養(yǎng)液配制方法為玉米粉5g，牛肉
3膏2g，氯化鈉5g，麩皮5g，土豆淀粉5g，定容至1000 ml, pH值調(diào)至7. 2-7. 4，121°C滅菌20
min。2)將拮抗菌菌株11-36與腐熟后的豬糞堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物進(jìn)行固體發(fā)酵，每噸固體有機(jī)物料中加入拮抗菌液50L，固體發(fā)酵過程中每天翻堆1次，使固體發(fā)酵溫度不超過50°C，一般發(fā)酵5天后結(jié)束，使拮抗菌含量達(dá)到1 X IO8 cfu .g-1以上，獲得豬糞堆肥和菜粕微生物酶解混合物的拮抗菌11-36微生物有機(jī)肥料。其中
腐熟后的豬糞堆肥發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量> 35%，有機(jī)氮質(zhì)量比含量為1. 2-2%，含水量質(zhì)量比25-30%。菜粕的微生物酶解物制備方法為，將保藏號(hào)為CGMCC NO. 1543的嗜麥芽寡養(yǎng)單 rnMQStenotrophomorms maltophiIia)菌株37_1發(fā)酵液加入到菜粕原料中，調(diào)節(jié)含水量 55-65%和pH 6. 0-7. 5，進(jìn)行開放式固體發(fā)酵，待發(fā)酵溫度上升至50°C時(shí)立即開始翻堆，以后每天翻堆，使堆溫始終維持在35-50°C共5天，固體發(fā)酵開始后，堆物的pH會(huì)不斷上升，每次翻堆時(shí)用含酸液體調(diào)節(jié)含水量和PH，使它們分別維持在55-65%和6. 0-7. 0，發(fā)酵終止時(shí)再用含酸液體進(jìn)行噴灑，直至堆物PH調(diào)整為5. 0，再進(jìn)行低溫干燥或自然涼干，即為菜粕的微生物酶解物；
腐熟的豬糞堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物制備方法將腐熟的豬糞堆肥與菜粕微生物酶解物按體積比5(Γ70% 5(Γ30%的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟過程中翻堆2 次。上述微生物有機(jī)肥料可專用于防治茄子青枯病。有益效果
本發(fā)明涉及能防治茄子青枯病拮抗菌及其微生物有機(jī)肥產(chǎn)品，該產(chǎn)品具有如下優(yōu)點(diǎn) 1)肥料產(chǎn)品中含有抑制茄子青枯病病原細(xì)菌生長的專一性高效菌株(11-36)，其抑制效果顯著，肥料中該高效菌株的含量達(dá)到IXlO8 cfu - g-1以上，施入土壤后能形成優(yōu)勢群， 并在土壤中存活下來。2)肥料產(chǎn)品中含有豐富的可溶性有機(jī)碳和有機(jī)氮，能給功能菌提供十分優(yōu)越的生長環(huán)境，極大地提高了功能菌在土壤中的定殖和活力。3)本發(fā)明產(chǎn)品全磷和全氮含量較高，均達(dá)到4%。本產(chǎn)品原料之一為腐熟的豬糞堆肥，全磷和有效磷含量高，在制成的微生物有機(jī)肥料產(chǎn)品中無需添加任何含磷化肥，使用本產(chǎn)品后能使作物順利度過苗期磷素敏感期。本產(chǎn)品原料之一為菜粕微生物酶解物，不僅全氮含量高，而且含有豐富的氨基酸和小分子多肽，確保了肥料氮素持續(xù)穩(wěn)定的供應(yīng)，使作物生長和抗逆能力大大增強(qiáng)。4)試驗(yàn)結(jié)果表明，在青枯病發(fā)生嚴(yán)重的土壤上施用本產(chǎn)品后，能顯著降低青枯病的發(fā)病率，防治效率達(dá)80%以上。施用本肥料的土壤，茄子青枯病能夠得到有效防治。四

圖1拮抗菌株對(duì)病原菌(茄科勞爾氏菌)的抑菌圈圖2馬鈴薯盆栽試驗(yàn)各處理的發(fā)病率圖3馬鈴薯盆栽各處理的生物量五具體實(shí)施方式
(一)菌株的分離和鑒定拮抗菌的獲得從茄子青枯病發(fā)病田塊中的健康茄子植株根際土壤中分離拮抗菌。再通過盆栽試驗(yàn)和大田試驗(yàn)最終復(fù)篩出高效拮抗菌菌株11-36，鑒定到屬種，菌種于30%甘油中-70°C保存。拮抗菌菌株11-36的抑菌圈如圖1所示。拮抗菌菌株11-36屬于枯草芽孢桿菌UaciBm subtil is )，其主要生物學(xué)特性為革蘭氏染色陽性(G+)，細(xì)胞形狀為桿狀，過氧化氫酶陽性，淀粉水解陽性，V. P.反應(yīng)陽性，甲基紅試驗(yàn)陰性，纖維素分解陰性，明膠水解陽性，硝酸鹽還原陽性，吲哚試驗(yàn)陰性，能利用檸檬酸鹽，能產(chǎn)氨，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，發(fā)酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露糖只產(chǎn)酸。(二)菌劑生產(chǎn)
1)將拮抗菌菌株11-36接種到改良牛肉膏液體培養(yǎng)基，進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵生產(chǎn)的條件為培養(yǎng)溫度范圍3(T35°C，攪拌速度為18(T300 rpm，發(fā)酵中后期形成芽孢，使發(fā)酵液中含菌或芽孢量> IXIOki cfi^mr1。所用改良牛肉膏培養(yǎng)液配制方法為，以配制IL培養(yǎng)基為例稱取玉米粉5g，牛肉膏2g，氯化鈉5g，麩皮5g，土豆淀粉5g，定容至1000 ml，pH值調(diào)至 7. 2-7. 4，121°C 滅菌 20 min。2)將拮抗菌菌株11-36分別與腐熟后的豬糞堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物進(jìn)行固體發(fā)酵，每噸固體有機(jī)物料中加入拮抗菌液50L，固體發(fā)酵過程中每天翻堆1次，使固體發(fā)酵溫度不超過50°C，一般發(fā)酵5天后結(jié)束，使拮抗菌含量達(dá)到1 X IO8 cfu .g-1以上， 獲得豬糞堆肥和菜粕微生物酶解混合物的拮抗菌Π-36微生物有機(jī)肥料。其中
腐熟后的豬糞堆肥由江蘇新天地生物肥料工程中心有限公司提供，本品發(fā)芽指數(shù)為 98%以上，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量> 35%，有機(jī)氮質(zhì)量比含量為1. 2-2%，含水量質(zhì)量比25-30%。菜粕的微生物酶解物制備方法為，將保藏號(hào)為CGMCC NO. 1543的嗜麥芽寡養(yǎng)單 rnMQStenotrophomorms maltophiIia)菌株37_1發(fā)酵液加入到菜粕原料中，調(diào)節(jié)含水量 55-65%和pH 6. 0-7. 5，進(jìn)行開放式固體發(fā)酵，待發(fā)酵溫度上升至50°C時(shí)立即開始翻堆，以后每天翻堆，使堆溫始終維持在35-50°C共5天，固體發(fā)酵開始后，堆物的pH會(huì)不斷上升，每次翻堆時(shí)用含酸液體調(diào)節(jié)含水量和PH，使它們分別維持在55-65%和6. 0-7. 0，發(fā)酵終止時(shí)再用含酸液體進(jìn)行噴灑，直至堆物PH調(diào)整為5. 0，再進(jìn)行低溫干燥或自然涼干，即為菜粕的微生物酶解物；
腐熟的豬糞堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物制備方法將腐熟的豬糞堆肥與菜粕微生物酶解物按體積比5(Γ70% 5(Γ30%的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟過程中翻堆2 次。上述生產(chǎn)的微生物有機(jī)肥為用于防治茄子青枯病的微生物有機(jī)肥料，其中拮抗菌菌株11-36單菌含量達(dá)IXlO8 cfu · g—1以上，全氮含量為4 5% (90%以上為有機(jī)氮)，總氮磷鉀養(yǎng)分為6 10%，有機(jī)質(zhì)含量為30 35%。(三)盆栽試驗(yàn)
育苗選取健康水稻土作為育苗土。營養(yǎng)缽采用一次性塑料杯，每缽裝土 300g，拮抗菌 II-36菌液處理以108cfu/g 土均勻拌入土中，普通有機(jī)肥、微生物肥料以洲的施用量(w / w)均勻拌入土中，各處理用化肥等量補(bǔ)齊，設(shè)置處理如(表1)，每個(gè)處理重復(fù)30次。移栽大盆缽每缽裝5 kg病原土，病原土采自江蘇泰興連作大棚內(nèi)(青枯病發(fā)病率達(dá)到70%以上)。拮抗菌11-36菌液處理以108cfu/g 土均勻拌入病土中，普通有機(jī)肥、微生物肥料以0. 5%的施用量(w /V)均勻拌入病土中，各處理用化肥等量補(bǔ)齊，肥料與病原土充分混合均勻。待茄子幼苗長至3-4片真葉時(shí)將營養(yǎng)缽中的茄子幼苗移栽到裝有茄子青枯病發(fā)病土壤的大盆缽中。共設(shè)置6個(gè)處理，大盆缽各處理與營養(yǎng)缽育苗相同(表1 )，每處理重復(fù)15次。該盆栽試驗(yàn)于2010年5月至8月在江蘇省固體有機(jī)廢棄物資源化高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的溫室中進(jìn)行。自移栽21天時(shí)發(fā)現(xiàn)青枯病發(fā)病植株，隨后每天觀察植株發(fā)病情況，記錄發(fā)病率。采集各處理的植株土樣帶回實(shí)驗(yàn)室分析測定。
權(quán)利要求
1.能防治茄子青枯病的拮抗菌，該菌株11-36，屬于枯草芽孢桿菌OfeciBm 仰Mi^s)，保藏日期2010年9月14日，保藏號(hào)分別為CGMCC NO. 4158 ；菌株11-36的主要生物學(xué)特性為革蘭氏染色陽性G+，細(xì)胞為桿狀，過氧化氫酶陽性， 淀粉水解陽性，V. P.反應(yīng)陽性，甲基紅試驗(yàn)陰性，纖維素分解陰性，明膠水解陽性，硝酸鹽還原陽性，吲哚試驗(yàn)陽性，能利用檸檬酸鹽，能產(chǎn)氨，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，發(fā)酵L-阿拉伯糖、 甘露糖只產(chǎn)酸。
2.用權(quán)利要求1所述拮抗菌生產(chǎn)的防治茄子青枯病微生物有機(jī)肥料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物有機(jī)肥料，其特征在于該肥料中拮抗菌菌株含量在 IXlO8 cfu - g-1以上、全氮質(zhì)量比含量為4飛％，全氮中質(zhì)量比90%以上為有機(jī)氮，總氮磷鉀養(yǎng)分質(zhì)量比為6 10%，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量為30 35%。
4.權(quán)利要求2或3所述微生物有機(jī)肥料的生產(chǎn)方法，包括1)將拮抗菌菌株II-36分別接種到改良的牛肉膏液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵生產(chǎn)的條件為培養(yǎng)溫度范圍3(T35°C，攪拌速度為18(T300 rpm，發(fā)酵中后期形成芽孢，使發(fā)酵液中含菌或芽孢量彡IXlO10 cfu · ml—1 ；2)將拮抗菌菌株11-36與腐熟后的豬糞堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物進(jìn)行固體發(fā)酵，每噸固體有機(jī)物料中加入拮抗菌液50L，固體發(fā)酵過程中每天翻堆1次，使固體發(fā)酵溫度不超過50°C，一般發(fā)酵5天后結(jié)束，使拮抗菌含量達(dá)到1 X IO8 cfu .g-1以上，獲得豬糞堆肥和菜粕微生物酶解混合物的拮抗菌II-36微生物有機(jī)肥料，其中腐熟后的豬糞堆肥發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量> 35%，有機(jī)氮質(zhì)量比含量為1. 2-2%，含水量質(zhì)量比25-30% ；菜粕的微生物酶解物制備方法為，將保藏號(hào)為CGMCC NO. 1543的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞 MUtenotrophomonas maltophiIia)菌株37_1發(fā)酵液加入到菜粕原料中，調(diào)節(jié)含水量 55-65%和pH 6. 0-7. 5，進(jìn)行開放式固體發(fā)酵，待發(fā)酵溫度上升至50°C時(shí)立即開始翻堆，以后每天翻堆，使堆溫始終維持在35-50°C共5天，固體發(fā)酵開始后，堆物的pH會(huì)不斷上升，每次翻堆時(shí)用含酸液體調(diào)節(jié)含水量和PH，使它們分別維持在55-65%和6. 0-7. 0，發(fā)酵終止時(shí)再用含酸液體進(jìn)行噴灑，直至堆物PH調(diào)整為5.0，再進(jìn)行低溫干燥或自然涼干，即為菜粕的微生物酶解物；腐熟的豬糞堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物制備方法將腐熟的豬糞堆肥與菜粕微生物酶解物按體積比5(Γ70% 5(Γ30%的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟過程中翻堆2 次。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述微生物有機(jī)肥料的生產(chǎn)方法，其中步驟1)所用改良牛肉膏培養(yǎng)液配制方法為玉米粉5g，牛肉膏2g，氯化鈉5g，麩皮5g，土豆淀粉5g，定容至1000 ml，pH 值調(diào)至 7. 2-7. 4，121°C滅菌 20 min。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述微生物有機(jī)肥料的生產(chǎn)方法，其中步驟2)所用腐熟后的豬糞堆肥其發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量> 35%，有機(jī)氮質(zhì)量比含量為1. 2-2%，含水量質(zhì)量比25-30%。
7.權(quán)利要求2或3所述微生物有機(jī)肥料在防治連作茄子青枯病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及能防治茄子青枯病的拮抗菌及利用其生產(chǎn)的微生物有機(jī)肥料，屬于農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)技術(shù)。本發(fā)明分離到了一株對(duì)茄子青枯病病原細(xì)菌有顯著拮抗作用的拮抗菌(枯草芽孢桿菌II-36)，拮抗菌與有機(jī)堆肥制成微生物有機(jī)肥料，肥料中拮抗菌含量1×108cfu·g-1以上,全氮含量為4~5%，總氮磷鉀養(yǎng)分為6~10%，有機(jī)質(zhì)含量為30~35%。試驗(yàn)表明，這種微生物有機(jī)肥料施入土壤后能夠使拮抗菌迅速繁殖，在土壤中形成優(yōu)勢群，在茄子青枯病嚴(yán)重的連作土壤中對(duì)茄子青枯病的防治率達(dá)80%以上。施用本微生物有機(jī)肥料能有效防治茄子青枯病的發(fā)生。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102168046SQ20101060857
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2010年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月28日
發(fā)明者丁傳雨, 喬煥英, 冉煒, 楊興明, 沈其榮, 陳巍 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 江蘇新天地生物肥料工程中心有限公司