專利名稱：一種基于配位作用的固相介質(zhì)提取dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用可與DNA分子產(chǎn)生配位作用 的固相介質(zhì)在生物樣品中提取DNA的方法。
背景技術(shù)：
DNA提取是分子生物學(xué)研究和生物工程中的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，是DNA分析的基礎(chǔ)和 前提。DNA提取的質(zhì)量直接關(guān)系到PCR擴(kuò)增、基因測序的后續(xù)步驟的成功與否。隨著DNA分 析技術(shù)在分子生物學(xué)研究、臨床疾病診斷、進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫、法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、血液質(zhì)量控制等 領(lǐng)域應(yīng)用的逐漸深入，對開發(fā)高效、快速、簡便、低成本的DNA提取技術(shù)的需求也與日俱增。目前常用的幾種DNA提取方法包括苯酚-氯仿法、Chelex-IOO法和固相提取法 等。它們均有各自的特點(diǎn)和適用體系苯酚-氯仿法適用范圍廣，但操作時(shí)間長，提取效率較低且因人而異，所用試劑毒 性較大，對環(huán)境有污染。Chelex-IOO法操作簡便，提取的DNA可直接用于PCR擴(kuò)增；但其提取效率低，且對 體系有一定選擇性。固相提取法是目前發(fā)展較快的一種方法，它采用玻璃珠、氧化硅微?；蜓趸璋?覆的磁性微粒為固相提取介質(zhì)，這些介質(zhì)表面都有可部分解離的硅羥基，在高鹽濃度溶液 中，DNA帶有負(fù)電的磷酸根可以通過鹽橋的媒介作用吸附在Si02粒子表面。該方法提取純 度高，操作簡便，尤其是采用氧化硅復(fù)合磁性粒子為介質(zhì)，可實(shí)現(xiàn)對樣品的快速、高通量的 自動(dòng)化提取。但由于這種提取方法依賴的是氧化硅粒子表面和DNA磷酸根之間的較弱的間 接靜電相互作用，因此DNA的吸附效率很難進(jìn)一步提高，通常最高只能達(dá)到80%左右。要想進(jìn)一步提高固相提取法對DNA的吸附效率，需要對吸附介質(zhì)表面進(jìn)行修飾， 增強(qiáng)其與DNA分子之間的相互作用。從DNA分子結(jié)構(gòu)看，其鏈上的磷酸根具有很強(qiáng)的配位能 力，可以和多種金屬離子發(fā)生很強(qiáng)的配位作用。因此，我們可以通過對吸附介質(zhì)進(jìn)行表面修 飾，使DNA分子和介質(zhì)表面產(chǎn)生很強(qiáng)的配位作用，從而實(shí)現(xiàn)對DNA的吸附和提取。由于配位 作用的強(qiáng)度要遠(yuǎn)大于靜電相互作用，這樣的設(shè)計(jì)將有助于進(jìn)一步提高對DNA的吸附效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種利用DNA分子與固相介質(zhì)間的配位相互作用實(shí)現(xiàn)對 生物樣品中DNA的高效提取的方法，將DNA吸附效率提高到90%以上，以克服現(xiàn)有提取技術(shù) 提取效率偏低的缺陷。本發(fā)明的方法包括如下步驟(1)將利用硅烷偶聯(lián)試劑在表面修飾可吸附金屬離子基團(tuán)的固相提取介質(zhì)和濃度 為10 25mmol/mL的金屬離子溶液混合，每毫升金屬離子溶液加入0. 4 0. 5毫克固相提 取介質(zhì)，吸附1 2小時(shí)后，采取離心或磁吸方式將固相介質(zhì)和溶液分離，用高純水清洗所 得固相；
(2)將吸附了金屬離子的固相介質(zhì)和含DNA的溶液樣品混合，DNA樣品與吸附了 金屬離子的固相介質(zhì)的質(zhì)量比在0. 009 0. 01范圍；用NaCl調(diào)節(jié)混合溶液的離子強(qiáng)度在 0. 01 0. 5mmol/mL范圍，在pH值2. 5 4. 5下將混合溶液靜置15分鐘以完成DNA分子在 固相提取介質(zhì)表面的吸附；根據(jù)所用不同的固相提取介質(zhì)，采取離心或磁吸等分離方式，將 吸附了 DNA分子的固相介質(zhì)和溶液分離。本發(fā)明步驟(1)中所述的固相提取介質(zhì)包括玻璃珠(尺寸在毫米區(qū)間)，無定形氧 化硅微粒(形狀為球形或無定形，尺寸范圍在50μπι lOOnm)，介孔氧化硅微粒(尺寸范 圍在50 μ m IOOnm)，無定形氧化硅包覆磁性微粒(尺寸范圍在50 μ m lOOnm，磁性內(nèi)核 為狗，Co, Ni, Fe2O3' Fe3O4或其混合物)和介孔氧化硅包覆磁性微粒(尺寸范圍在50 μ m lOOnm，磁性內(nèi)核為Fe，Co，Ni，F(xiàn)e2O3, Fe3O4或其混合物)。本發(fā)明步驟(1)中所述的表面修飾改性是指利用硅烷偶聯(lián)試劑在上述固相介質(zhì) 表面修飾可吸附金屬離子的基團(tuán)，如羧基等。所用硅烷偶聯(lián)劑為3-環(huán)氧基丙基三甲氧 基硅烷和氨羧類螯合物反應(yīng)制得，所用氨羧類螯合物包括亞胺基二乙酸(IDA)、三乙酸胺 (NTA)、羧甲基天冬氨酸(CM-ASP)、三羧甲基乙二胺(TED)、羧甲基四聚天冬氨酸(CM-TEPA)
等。分子結(jié)構(gòu)式分別如下
權(quán)利要求
1.一種基于配位作用的固相介質(zhì)提取DNA的方法，有如下步驟(1)將利用硅烷偶聯(lián)試劑在表面修飾可吸附金屬離子基團(tuán)的固相提取介質(zhì)和濃度為 10 25mmol/mL的金屬離子溶液混合，每毫升金屬離子溶液加入0. 4 0. 5毫克固相提取 介質(zhì)，吸附1 2小時(shí)后，采取離心或磁吸方式將固相介質(zhì)和溶液分離，用高純水清洗所得 固相；(2)將吸附了金屬離子的固相介質(zhì)和含DNA的溶液樣品混合，DNA樣品與吸附了金屬離 子的固相介質(zhì)的質(zhì)量比在0. 009 0. 01范圍；用NaCl調(diào)節(jié)混合溶液的離子強(qiáng)度在0. 01 0. 5mmol/mL范圍，在pH值2. 5 4. 5下將混合溶液靜置15分鐘以完成DNA分子在固相提 取介質(zhì)表面的吸附；采取離心或磁吸方式，將吸附了 DNA分子的固相介質(zhì)和溶液分離。
2.如權(quán)利要求1所述的基于配位作用的固相介質(zhì)提取DNA的方法，其特征是，所述的利 用硅烷偶聯(lián)試劑在表面修飾可吸附金屬離子基團(tuán)的固相提取介質(zhì)，是用3-環(huán)氧基丙基三 甲氧基硅烷作硅烷偶聯(lián)劑，和氨羧類螯合物反應(yīng)制得；所述的氨羧類螯合物，是亞胺基二乙 酸、三乙酸胺、羧甲基天冬氨酸、三羧甲基乙二胺或羧甲基四聚天冬氨酸。
3.如權(quán)利要求1或2所述的基于配位作用的固相介質(zhì)提取DNA的方法，其特征是，所述 的固相提取介質(zhì)，是玻璃珠、無定形氧化硅微粒、介孔氧化硅微粒、無定形氧化硅包覆磁性 微粒或介孔氧化硅包覆磁性微粒。
4.如權(quán)利要求1或2所述的基于配位作用的固相介質(zhì)提取DNA的方法，其特征是，所述 的金屬離子是 Si2+、Cu2+、Ni2+、Fe3+ 或 Ce4+。
全文摘要
本發(fā)明的一種基于配位作用的固相介質(zhì)提取DNA的方法，屬于生物技術(shù)的技術(shù)領(lǐng)域。包括如下步驟將利用硅烷偶聯(lián)試劑在表面修飾可吸附金屬離子基團(tuán)的固相提取介質(zhì)和金屬離子溶液混合，吸附后采取離心或磁吸方式將固相介質(zhì)和溶液分離，所述的金屬離子是Zn2+、Cu2+、Ni2+、Fe3+或Ce4+；將吸附了金屬離子的固相介質(zhì)和含DNA的溶液樣品混合，調(diào)節(jié)混合溶液的離子強(qiáng)度在0.01～0.5mmol/mL、pH值2.5～4.5，靜置15分鐘以完成DNA分子的吸附，采取離心或磁吸將吸附了DNA分子的固相介質(zhì)和溶液分離。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于對DNA的吸附率高于90％，操作快速便捷。
文檔編號C12N15/10GK102146369SQ20101060400
公開日2011年8月10日 申請日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者姜珊, 莊家騏, 楊文勝 申請人:吉林大學(xué)