專利名稱：用于檢測大前庭水管綜合癥性耳聾易感性的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疾病易感性檢測用的試劑盒，尤其是一種檢測大前庭水管綜合癥 性耳聾易感性的試劑盒，通過檢測PDS基因熱點(diǎn)突變的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)，來預(yù)測 個(gè)體對(duì)大前庭水管綜合癥性耳聾的易感性。
背景技術(shù)：
耳聾是一種嚴(yán)重影響生活質(zhì)量和交流的常見疾病。它可以由單一基因突變或不同 基因的復(fù)合突變引起，也可由環(huán)境因素或基因與環(huán)境兩者共同作用而致。新生兒耳聾的發(fā) 病率為1-3/1000，一般認(rèn)為，遺傳性耳聾占兒童期耳聾的50%，其具有較高的遺傳異質(zhì)性。 GJB2基因和PDS(SLC26A4)基因是非綜合征性常染色體隱性遺傳性耳聾中最常見的兩個(gè)致 病基因。1978年，Valvassori和Clemis在對(duì)3700例顳骨連續(xù)分層掃描中發(fā)現(xiàn)有50例前 庭水管擴(kuò)大，將其命名為大前庭水管，又將臨床上伴感音神經(jīng)性聽力損失等癥狀者稱為“大 前庭水管綜合癥”(Larged Vestibular Aqueduct Syndrome，LVAQ。此病出生時(shí)可能聽力 正常，或伴有輕度至中重度的聽力損失，患兒早期多有較好的語言能力，聽力逐漸下降，聽 力下降的誘發(fā)因素多為頭部外傷、顱內(nèi)壓升高、感冒等，因墮床、兒童玩?；蝮w育活動(dòng)中的 輕度碰撞可以造成明顯的聽力下降，因此對(duì)于該病的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期干預(yù)成為預(yù) 防或推遲其發(fā)病的有效措施。近年來國內(nèi)外多項(xiàng)研究表明大前庭水管綜合癥與PDS基因突變有密切的關(guān)系。 PDS (SLC26A4) (Solute carrier family)基因含21個(gè)外顯子，開放閱讀框架2343bp，編碼 780個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)Pendrin。Pendrin主要由疏水性氨基酸組成，屬于離子轉(zhuǎn)運(yùn)體家族， 研究表明其功能主要與碘/氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。PDS基因突變?cè)斐啥@的遺傳模式絕大部分 屬于常染色體隱性遺傳方式。隨著對(duì)SLC26A4基因認(rèn)識(shí)的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)該基因突變極具異質(zhì)性突變位點(diǎn)遍 布于整個(gè)基因序列；突變形式多樣，包括錯(cuò)義突變、無義突變、移碼突變、剪接位點(diǎn)突變等 等。不同種族的耳聾人群中PDS基因熱點(diǎn)突變不同。在歐洲，T416P和L236P是LVAS患者 最常見的兩種突變類型；在東亞，IVS7-2A > 6和A2168G(H723R)是韓國人中突變頻率較高 的類型，H723R和L676Q是日本人和蒙古人中突變頻率較高的類型?，F(xiàn)有技術(shù)檢測大前庭水管綜合癥性耳聾易感人群，采用直接測序法，雖準(zhǔn)確率高， 但其成本高、操作復(fù)雜且不能實(shí)現(xiàn)批量檢測，因此現(xiàn)有方法均無法滿足大規(guī)模基因篩選的 要求。因此目前需要一種簡便易行的技術(shù)來滿足對(duì)大前庭水管綜合癥性耳聾PDS基因 熱點(diǎn)突變進(jìn)行廣泛篩查和快速診斷的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，通過檢測一組大前庭水管綜合癥性耳聾PDS基因 突變位點(diǎn)，利用特異性引物和探針，通過單核苷酸延伸技術(shù)結(jié)合微陣列芯片技術(shù)，綜合檢測和分析受檢人群是否攜帶“大前庭水管綜合癥性耳聾易感基因”，將大前庭水管綜合癥性耳 聾易感人群從人群中篩選出來，改變不良的生活習(xí)慣，達(dá)到預(yù)防的目的。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種用于檢測大前庭水 管綜合癥性耳聾易感的檢測試劑盒，它檢測PDS基因的五個(gè)突變位點(diǎn)IVS7-2A>G、 A2168G (H723R)、L236P、IVS8+1G > A 禾口 T416P。。分別對(duì)應(yīng)下述SNP 位點(diǎn)rsl 11033313 位點(diǎn)、rsl21908362 位點(diǎn)、rs80338848 位點(diǎn)、 rs80338849 和 rs28939086 位點(diǎn)。所述的用于檢測大前庭水管綜合癥性耳聾易感的基因組合，用于針對(duì)所述位點(diǎn)設(shè) 計(jì)特異性的引物對(duì)和探針。所述的用于檢測大前庭水管綜合癥性耳聾易感的基因組合設(shè)計(jì)的特異性引物，所 述的特異性引物對(duì)的序列如下，用于進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，能同時(shí)擴(kuò)增出上述5個(gè)位點(diǎn)的基因 片段針對(duì)rsl 11033313 位點(diǎn)AATCCCAGTCCCTATTCCTA (SEQ ID NO 1)CATTGTAATTTTTTTCCAGGTT(SEQ ID NO 2)針對(duì)rsl21908362 位點(diǎn)GTTCTTTGACGACAACATTAGAA(SEQ ID NO 3)GAACCTTGACCCTCTTGAGA(SEQ ID NO 4)針對(duì)rs80338848 位點(diǎn)GGTACTTGGCAGATCCTTTG (SEQ ID NO 5)AATAGAGAGAACTCCATTGTAGTTT(SEQ ID NO 6)針對(duì)rs80338849 位點(diǎn)TAATTGCTACTGCCATTTCATA(SEQ ID NO 7)TTGAAGGAGTATCAGTGAAATGA(SEQ ID NO 8)針對(duì)rs28939086 位點(diǎn)CTTCCTCTGTTGCCATTCCT (SEQ ID NO 9)AATTCATTGCCTTTGGGATC。(SEQIDN0:10)所述的用于檢測大前庭水管綜合癥性耳聾易感的基因組合設(shè)計(jì)的特異性探針，其 特征在于，所述的特異性探針序列如下，能同時(shí)對(duì)5個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測分型針對(duì)rslll033313 位點(diǎn)ACGCACGTCCACGGTGATTTTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTTC(SEQ ID NO :11)針對(duì)rsl21908362 位點(diǎn)GGATGGCGTTCCGTCCTATTAAGGACACATTCTTTTTGACGGTCC(SEQ ID NO :12)針對(duì)rs80338848 位點(diǎn)CGTGCCGCTCGTGATAGAATGCCTTCCAAGTGCTGGTCTCACAGC(SEQ ID NO :13)針對(duì)rs80338849 位點(diǎn)AGCGATCTGCGAGACCGTATGCATTGTTAAATCCATCCCAAGGGG(SEQ ID NO :14)針對(duì)rs28939086 位點(diǎn)GCGGTAGGTTCCCGACATATGTTCCTACCTGTGTCTTTCCTCCAG(SEQ ID NO :15)所述的引物或探針，用于通過單核苷酸延伸技術(shù)結(jié)合微陣列芯片技術(shù)特異性檢出 大前庭水管綜合癥性耳聾易感基因。本試劑盒的組分和含量包括250ul 10XPCR 反應(yīng)緩沖液，20ul IOmM dNTP 混合液，
450ul 25mM MgCl2 溶液，45ul (5U/ul) Taq DNA 聚合酶，5Oul特異性引物(10條)混合液(IOuM each)，15ul特異性延伸探針(5條)混合液(IOuM)，90ul ExoI(10U/ul),450ul SAP(lU/ul),140ul 10XSAP 反應(yīng)緩沖液，1700ul Extension Dilution Buffer,90ul IOXExtension Mix,IOul DNA polymerase,3500ul Hybridization Solution,200ul Hybridization Additive,2500ul 20XWash Buffer 1，800ul 64XWash Buffer 2，一個(gè)384孔12重微陣列芯片去離子水20ml，本試劑盒供380人份檢測應(yīng)用，試劑盒保存溫度為-20°C。本發(fā)明的有益效果是(1)分型結(jié)果準(zhǔn)確性高達(dá)99%以上，重復(fù)性好，沒有假陽性 影響；( 同時(shí)檢測多個(gè)SNP位點(diǎn)，檢測成本低；C3)通量高，可一次對(duì)384個(gè)樣本進(jìn)行檢測； (4)操作簡便；( 靈敏度高，每次檢測的DNA用量僅2ng。本發(fā)明通過單核苷酸延伸技術(shù) 結(jié)合微陣列芯片技術(shù)，利用特異性引物和探針對(duì)單核苷酸多態(tài)性(SNP)的基因分型準(zhǔn)確率 超過99%。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。下列實(shí)施例中未注明具體條件 的實(shí)驗(yàn)放大，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。IDNA 的提取取受檢者外周靜脈血，加入同等體積的細(xì)胞裂解液，裂解兩次，充分裂解白細(xì)胞， 離心棄上清后加入蛋白酶K緩沖液和蛋白酶K(50ug/ml)，65°C孵育10分鐘，異丙醇沉淀、 75 %乙醇洗滌兩次，晾干后溶于適量TB溶液中。2PCR 擴(kuò)增取受檢者的基因組DNA提取液加入96孔板中，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積5ul，其中 10M mol/L dNTPs 0. 0375ul, 10XPCR BufferO. 5ul, 25mmol/L MgCl2Iul,模板 DNA 30ng，5 重引物混合液 10uM/L eachO. 025ul, Amplitaq Gold(5U/ul)0. lul，補(bǔ)足水到 5ul。置于 PCR 儀上反應(yīng)預(yù)變性 94°C Imin ；94°C 30sec, 55°C 30sec,72°C lmin，40 個(gè)循環(huán)；Hold 4°C。擴(kuò)增引物混合液包括下列引物IF AATCCCAGTCCCTATTCCTA(SEQ ID NO 1)IR CATTGTAATTTTTTTCCAGGTT(SEQIDNOd)
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2F GTTCTTTGACGACAACATTAGAA(SEQ ID NO 3)2R GAACCTTGACCCTCTTGAGA(SEQ ID NO 4)3F GGTACTTGGCAGATCCTTTG(SEQ ID NO 5)3R AATAGAGAGAACTCCATTGTAGTTT(SEQ ID NO 6)4F TAATTGCTACTGCCATTTCATA(SEQ ID NO 7)4R TTGAAGGAGTATCAGTGAAATGA(SEQ ID NO 8)5F CTTCCTCTGTTGCCATTCCT(SEQ ID NO 9)5R AATTCATTGCCTTTGGGATC (SEQ ID N0:10)3 純化在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入 0. 2ul ExoI, Iul SAP，0. 3ul 10 X SAP 反應(yīng)緩沖液禾口 1. 5ul 去離子水。將96孔板放入PCR儀中進(jìn)行純化，純化程序37°C 30min,96°C 10min,Hold 4°C。4引物延伸反應(yīng)純化后的PCR產(chǎn)物中加入延伸反應(yīng)混合物extension Dilution Buffer3. 76ul, 延伸探針混合液(1010uM/L each) 0. 03ul, 20 X Extension Mix 0. 2ul，DNA 聚合酶 0. 02ul， 去離子水;3ul。將裝有延伸反應(yīng)混合物的96孔板再次放入PCR儀中進(jìn)行延伸反應(yīng)，反應(yīng)程 序=Hold 96°C 3min ；94°C 20sec，40°C llsec，46 個(gè)循環(huán)；Hold 4°C。延伸探針混合液包含下列探針I(yè)PACGCACGTCCACGGTGATTTTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTTC(SEQIDNO:11)
2PGGATGGCGTTCCGTCCTATTAAGGACACATTCTTTTTGACGGTCC(SEQIDNO:12)
3PCGTGCCGCTCGTGATAGAATGCCTTCCAAGTGCTGGTCTCACAGC(SEQIDNO:13)
4PAGCGATCTGCGAGACCGTATGCATTGTTAAATCCATCCCAAGGGG(SEQIDNO:14)
5PGCGGTAGGTTCCCGACATATGTTCCTACCTGTGTCTTTCCTCCAG(SEQIDNO:15)以上延伸探針5’端具有與微陣列芯片地址引物對(duì)應(yīng)的地址序列。5延伸反應(yīng)結(jié)束后，加入雜交液可與微陣列芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)。孵育溫度42 °C，孵育時(shí)間2小時(shí)。6激光掃描檢測熒光信號(hào)同時(shí)檢測上述5個(gè)基因突變位點(diǎn)對(duì)預(yù)測、比較個(gè)體的大前庭水管綜合癥性耳聾 易感性具有重要意義。本發(fā)明將與大前庭水管綜合癥性耳聾易感、發(fā)生密切相關(guān)的PDS 基因熱點(diǎn)突變進(jìn)行組合，通過大量的篩選數(shù)據(jù)表明所述5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)IVS7-2A > G、 A2168G(H723R)、L236P、IVS8+1G >々和 ^ΙΘΡ，如出現(xiàn)突變，則患大前庭水管綜合癥性耳聾 的概率最高高；沒有位點(diǎn)發(fā)生突變患大前庭水管綜合癥性耳聾的概率較小。本發(fā)明采用單核苷酸延伸技術(shù)和微陣列芯片技術(shù)相結(jié)合的方法，針對(duì)上述5個(gè)位 點(diǎn)，設(shè)計(jì)一套多重PCR引物，在一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增攜帶SNP位點(diǎn)的5個(gè)基因片段，根 據(jù)SNP位點(diǎn)上游5’端23-2^ρ的序列設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，此探針與序列雜交后3’末端位 于snp5’端上游Ibp處。檢測時(shí)聚合酶根據(jù)SNP攜帶的堿基在探針末端結(jié)合上一個(gè)攜帶熒 光的ddNTP，根據(jù)結(jié)合的ddNTP不同，其所攜帶的熒光顏色也不相同，在探針的5’端根據(jù)與 微陣列芯片結(jié)合位置的不同設(shè)計(jì)有不同的20bp的Tag地址序列，與微陣列芯片上對(duì)應(yīng)的序 列互補(bǔ)，延伸后的探針與微陣列芯片上對(duì)應(yīng)區(qū)域上的序列雜交，不同的探針結(jié)合在芯片的 不同區(qū)域，通過檢測對(duì)應(yīng)位置的熒光，達(dá)到同時(shí)進(jìn)行多個(gè)SNP分型的目的。
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疾病的發(fā)生是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，受到多個(gè)蛋白和基因的共同影響，其中任何 一個(gè)酶的改變都會(huì)影響疾病的易感性。傳統(tǒng)的基因檢測疾病的方法受到方法的限制，往往 只能對(duì)一到兩個(gè)基因的多態(tài)性進(jìn)行分析，只能覆蓋一部份患病風(fēng)險(xiǎn)人群，對(duì)于由于其他基 因上的多態(tài)性造成的疾病患病風(fēng)險(xiǎn)不能及時(shí)的預(yù)警，檢測的準(zhǔn)確性因此會(huì)大幅降低，受檢 者不能全面的了解自身疾病的易感情況。本發(fā)明針對(duì)一種疾病不同的患病途徑檢測多個(gè)相關(guān)的基因和其多態(tài)性位點(diǎn)，能更 準(zhǔn)確更全面的檢測受檢者不同患病途徑的患病風(fēng)險(xiǎn)，能給受檢者提出具有針對(duì)性和有效地 健康建議，及時(shí)有效的避免其疾病的發(fā)生。由于本發(fā)明使用的檢測方法可以高通量，自動(dòng)化的檢測SNP，大幅降低了檢測成 本，可以對(duì)不同患病途徑的多個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行檢測，本發(fā)明針對(duì)大前庭水管綜合癥性耳聾 PDS基因?qū)ふ姨暨x了 5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，能更準(zhǔn)確更全面的檢測受檢者不同患病途徑的患病 風(fēng)險(xiǎn)，能夠給受檢者提出具有針對(duì)性的健康建議，及時(shí)有效的避免其疾病的發(fā)生。本發(fā)明 通過單核苷酸延伸技術(shù)結(jié)合微陣列芯片技術(shù)，利用特異性引物和探針對(duì)單核苷酸多態(tài)性 (SNP)的基因分型準(zhǔn)確率超過99%，同時(shí)檢測上述5個(gè)基因突變位點(diǎn)對(duì)檢測、比較個(gè)體的大 前庭水管綜合癥性耳聾易感性具有重要意義綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識(shí)之士可 以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實(shí)施例，但這種實(shí)施例都包括在本發(fā) 明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測大前庭水管綜合癥性耳聾易感性的試劑盒，其特征在于，包括同時(shí) 檢測 PDS 基因的 IVS7-2A>G 的 rs 111033313 位點(diǎn)、A2168G 的 rsl21908362 位點(diǎn)、L236P 的 rs80338848 位點(diǎn)、IVS8+1G > A 的 rs80338849 位點(diǎn)和 T416P 的 rs28939086 位點(diǎn)的特異性 引物及對(duì)應(yīng)的延伸探針，Taq酶，dNTP混合液，MgCl2溶液，10XPCR反應(yīng)緩沖液，ExoI, SAP, 10XSAP 反應(yīng)緩沖液，Extension Dilution Buffer, IOXExtension Mix,DNA polymerase, Hybridization Solution, Hybridization Additive,20Xffash Buffer 1,64XWash Buffer 2，去離子水，微陣列芯片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測大前庭水管綜合癥性耳聾易感性的試劑盒，其特征 在于所述的特異性引物對(duì)是針對(duì)PDS基因的IVS7-2A > G的rsl 11033313位點(diǎn)、A2168G的 rsl21908362 位點(diǎn)、L236P 的 rs80338848 位點(diǎn)、IVS8+1G > A 的 rs80338849 位點(diǎn)和 T416P 的rd8939086位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能特異性擴(kuò)增出包括上述SNP位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測大前庭水管綜合癥性耳聾易感性的試劑盒，其特征 在于所述的特異性延伸探針是針對(duì)PDS基因的IVS7-2A>G的1^111033313位點(diǎn)421686 的 rsl21908362 的位點(diǎn)、L236P 的 rs80338848 位點(diǎn)、IVS8+1G > A 的 rs80338849 位點(diǎn)和 T416P的rd8939086位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過單核苷酸延伸和微陣列技術(shù)檢測出這五個(gè)SNI^s位 點(diǎn)基因型的探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測大前庭水管綜合癥性耳聾易感性的試劑盒，其特征 在于所含的特異性引物對(duì)選自具有SEQ ID NO :1，2所示核苷酸序列的引物對(duì)、具有SEQ ID NO :3，4所示核苷酸序列的引物對(duì)、具有SEQID NO :5，6所示核苷酸序列的引物對(duì)、具有SEQ ID NO :7，8所示核苷酸序列的引物對(duì)以及具有SEQ ID NO :9，10所示核苷酸序列的引物對(duì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所示的用于檢測大前庭水管綜合癥性耳聾易感性的試劑盒，其特征 在于所含的特異性延伸探針選自具有SEQ ID N0:ll、12、13、14和15所示的延伸探針。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測大前庭水管綜合癥性耳聾易感性的試劑盒，其 特征在于試劑盒的組分和含量包含250ul 10XPCR反應(yīng)緩沖液，20ul IOmM dNTP混 合液，450ul 25mM MgCl2 溶液，45ul 5U/ul 的 iTaq DNA 聚合酶，50ul 每條 IOuM 的 10 條 特異性引物混合液，15ul每條IOuM的5條特異性延伸探針混合液，90ul 10U/ul ExoI, 450ul lU/ul SAP, 140ul 10XSAP 反應(yīng)緩沖液，1700ul Extension Dilution Buffer, 90ul 10XExtension Mix,IOul DNA polymerase,3500ul Hybridization Solution, 200ulHybridization Additive,2500ul 20XWash Buffer l，800ul 64XWashBuffer 2， 去離子水20ml，一個(gè)供380人份檢測應(yīng)用的384孔12重微陣列芯片，試劑盒保存溫度 為-20 0C ο
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測大前庭水管綜合癥性耳聾易感性的試劑盒，它檢測PDS基因的五個(gè)突變位點(diǎn)IVS7-2A＞G、A2168G(H723R)、L236P、IVS8+1G＞A和T416P。分別對(duì)應(yīng)下述SNP位點(diǎn)rs111033313位點(diǎn)、rs121908362位點(diǎn)、rs80338848位點(diǎn)、rs80338849和rs28939086位點(diǎn)。利用本試劑盒，通過檢測一組大前庭水管綜合癥性耳聾PDS基因突變位點(diǎn)，利用特異性引物和探針，通過單核苷酸延伸技術(shù)結(jié)合微陣列芯片技術(shù)，可清晰的判斷受檢人群是否攜帶“大前庭水管綜合癥性耳聾易感基因”，將大前庭水管綜合癥性耳聾易感人群從人群中篩選出來，改變不良的生活習(xí)慣，達(dá)到預(yù)防的目的。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102108412SQ201010599419
公開日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2010年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月22日
發(fā)明者劉志霈, 劉蓉華, 周毓玲, 李楠, 杜宏偉, 陳勇, 靳霞, 韓俊領(lǐng) 申請(qǐng)人:協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司, 天津?yàn)I海協(xié)和基因科技有限公司