專利名稱：用于確定大前庭水管綜合癥性耳聾pds基因突變的基因組合、引物、探針和用途的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種基因突變的引物組合、探針和用途，尤其是一種用于檢測大前庭 水管綜合癥性耳聾PDS基因突變的基因組合、引物探針和用途。
背景技術(shù)：
耳聾是一種嚴重影響生活質(zhì)量和交流的常見疾病。它可以由單一基因突變或不同 基因的復合突變引起，也可由環(huán)境因素或基因與環(huán)境兩者共同作用而致。新生兒耳聾的發(fā) 病率為1-3/1000，一般認為，遺傳性耳聾占兒童期耳聾的50%，其具有較高的遺傳異質(zhì)性。 GJB2基因和PDS(SLC26A4)基因是非綜合征性常染色體隱性遺傳性耳聾中最常見的兩個致 病基因。1978年，Valvassori和Clemis在對3700例顳骨連續(xù)分層掃描中發(fā)現(xiàn)有50例前 庭水管擴大，將其命名為大前庭水管，又將臨床上伴感音神經(jīng)性聽力損失等癥狀者稱為“大 前庭水管綜合癥”(Larged Vestibular Aqueduct Syndrome，LVAQ。此病出生時可能聽力 正常，或伴有輕度至中重度的聽力損失，患兒早期多有較好的語言能力，聽力逐漸下降，聽 力下降的誘發(fā)因素多為頭部外傷、顱內(nèi)壓升高、感冒等，因墮床、兒童玩?；蝮w育活動中的 輕度碰撞可以造成明顯的聽力下降，因此對于該病的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期干預成為預 防或推遲其發(fā)病的有效措施。近年來國內(nèi)外多項研究表明大前庭水管綜合癥與PDS基因突變有密切的關系。 PDS (SLC26A4) (Solute carrier family)基因含21個外顯子，開放閱讀框架2343bp，編碼 780個氨基酸的蛋白質(zhì)Pendrin。Pendrin主要由疏水性氨基酸組成，屬于離子轉(zhuǎn)運體家族， 研究表明其功能主要與碘/氯離子轉(zhuǎn)運有關。PDS基因突變造成耳聾的遺傳模式絕大部分 屬于常染色體隱性遺傳方式。隨著對SLC26A4基因認識的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)該基因突變極具異質(zhì)性突變位點遍 布于整個基因序列；突變形式多樣，包括錯義突變、無義突變、移碼突變、剪接位點突變等 等。不同種族的耳聾人群中PDS基因熱點突變不同。在歐洲，T416P和L236P是LVAS患者 最常見的兩種突變類型；在東亞，IVS7-2A > 6和A2168G(H723R)是韓國人中突變頻率較高 的類型，H723R和L676Q是日本人和蒙古人中突變頻率較高的類型?，F(xiàn)有技術(shù)檢測大前庭水管綜合癥性耳聾PDS基因熱點突變，采用序列分析法，該 方法成本高，操作復雜且不能批量檢測，不適合篩查和推廣使用。因此目前需要一種簡便易行的技術(shù)來滿足對大前庭水管綜合癥性耳聾PDS基因 熱點突變進行廣泛篩查和快速診斷的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，通過檢測一組PDS基因突變位點，利用特異性引 物和探針，通過單核苷酸延伸技術(shù)結(jié)合微陣列芯片技術(shù)，綜合檢測和分析受檢人群是否攜 帶“大前庭水管綜合癥性耳聾易感基因”，將大前庭水管綜合癥性耳聾易感人群從人群中篩
3選出來，改變不良的生活習慣，達到預防的目的。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種用于確定大前庭水管綜 合癥性耳聾PDS基因突變的組合，它包括PDS基因五個突變位點的組合IVS7-2A > G、 A2168G (H723R)、L236P、IVS8+1G > A 和 T416P。對應下述SNP 位點rsl 11033313 位點、rsl21908362 位點、rs80338848 位點、 rs80338849 和 rs28939086 位點。所述的用于確定大前庭水管綜合癥性耳聾PDS基因突變的組合，用于針對所述位 點設計特異性的弓I物對和探針。所述的用于確定大前庭水管綜合癥性耳聾PDS基因突變的組合設計的特異性引 物，所述的特異性引物對的序列如下，用于進行多重PCR擴增，能同時擴增出上述4個位點 的基因片段針對rsl 11033313 位點AATCCCAGTCCCTATTCCTATTTCCAGGTTGGCTCCATAT針對rsl21908362 位點GGGTTCTTTGACGACAACATTACTTGAGATTTCACTTGGTTCTGT針對rs80338848 位點GTGAGGTACTTGGCAGATCCTCTGGAGCAAGAAGCAACACT針對rs80338849 位點GATAATTGCTACTGCCATTTCATTAGGACTATTGAAGGAGTATCAGTG針對rs^939086 位點TGCCATTCCTCGACTTGTT
ACATCTTCTCAGGATTCTTCTCTT。所述的用于確定大前庭水管綜合癥性耳聾PDS基因突變的組合設計的特異性探 針，其特征在于，所述的特異性探針序列如下，能同時對5個位點進行檢測分型針對rsl 11033313 位點TTTTTAACATCTTTTGTTTTATTTC針對rsl21908362 位點AAGGACACATTCTTTTTGACGGTCC針對rs80338848 位點GCCTTCCAAGTGCTGGTCTCACAGC針對rs80338849 位點GCATTGTTAAATCCATCCCAAGGGG針對rs^939086 位點GTTCCTACCTGTGTCTTTCCTCCAG。所述的引物或探針，用于通過單核苷酸延伸技術(shù)結(jié)合微陣列芯片技術(shù)特異性檢出 大前庭水管綜合癥性耳聾PDS基因突變位點。本發(fā)明的有益效果是(1)分型結(jié)果準確性高達99%以上，重復性好，沒有假陽性 影響；( 同時檢測多個SNP位點，檢測成本低；C3)通量高，可一次對384個樣本進行檢測； (4)操作簡便；( 靈敏度高，每次檢測的DNA用量僅2ng。本發(fā)明通過單核苷酸延伸技術(shù) 結(jié)合微陣列芯片技術(shù)，利用特異性引物和探針對單核苷酸多態(tài)性(SNP)的基因分型準確率 超過99%。
具體實施例方式本發(fā)明用于確定大前庭水管綜合癥性耳聾PDS基因突變的引物組合、探針和用 途，它包括PDS基因五個突變位點的組合IVS7-2A > G、A2168G(H723R)、L236P、IVS8+1G >A 和 T416P。分別對應下述 SNP 位點:rs 111033313 位點、rsl21908362 位點、rs80338848 位點、rs80338849 和 rs28939086 位點。所述的用于確定大前庭水管綜合癥性耳聾PDS基因突變的組合，用于針對所述位 點設計特異性的弓I物對和探針。本發(fā)明所述的引物是針對IVS7-2A > G(rslll033313)、A2168G(rsl21908362)、 L236P(rs80338848)、IVS8+1G > A(rs80338849)和 T416P (rs28939086)而設計，可用于進 行多重PCR擴增，可同時擴增出上述5個位點的基因片段。設計這類引物是本領域技術(shù)人 員能夠輕易完成的。優(yōu)選的，本發(fā)明中所述引物為具有如下序列針對rsl 11033313 位點AATCCCAGTCCCTATTCCTATTTCCAGGTTGGCTCCATAT針對rsl21908362 位點GGGTTCTTTGACGACAACATTACTTGAGATTTCACTTGGTTCTGT針對rs80338848 位點GTGAGGTACTTGGCAGATCCTCTGGAGCAAGAAGCAACACT針對rs80338849 位點GATAATTGCTACTGCCATTTCATTAGGACTATTGAAGGAGTATCAGTG針對 rs28939086 位點TGCCATTCCTCGACTTGTTACATCTTCTCAGGATTCTTCTCTT。特異性引物可用常規(guī)的合成技術(shù)進行合成，本領域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明 的引物不限于這5條引物對。本發(fā)明所述探針，是針對IVS7-2A > G(rslll033313)、A2168G(rsl21908362)、 L236P (rs80338848), IVS8+1G > A (rs80338849)和 T416P (rs28939086)而設計，可同時對 5 個位點進行檢測分型。設計這類探針是本領域技術(shù)人員能夠輕易完成的。優(yōu)選的，本發(fā)明 中所述探針為具有如下序列針對rsl 11033313 位點TTTTTAACATCTTTTGTTTTATTTC針對rs 121908362 位點AAGGACACATTCTTTTTGACGGTCC針對rs80338848 位點GCCTTCCAAGTGCTGGTCTCACAGC針對rs80338849 位點GCATTGTTAAATCCATCCCAAGGGG針對rs^939086 位點GTTCCTACCTGTGTCTTTCCTCCAG。特異性探針可用常規(guī)的合成技術(shù)進行合成，本領域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明 的特異性探針不限于這4條探針。本發(fā)明中所述探針特指單核苷酸延伸技術(shù)中的延伸引物，下面實施例中將敘述為 延伸引物。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明IDNA 的提取取受檢者外周靜脈血，加入同等體積的細胞裂解液，裂解兩次，充分裂解白細胞， 離心棄上清后加入蛋白酶K緩沖液和蛋白酶K(50ug/ml)，65°C孵育10分鐘，異丙醇沉淀、 75 %乙醇洗滌兩次，晾干后溶于適量TB溶液中。2PCR 擴增
取受檢者的基因組DNA提取液加入96孔板中，進行多重PCR擴增反應總體積5ul，其中 IOM mol/L dNTPs 0. 0375ul, 10XPCR BufferO. 5ul, 25mmol/L MgCl2 lul，模板 DNA 30ng，5 重引物混合液 lOuM/L eachO. 025ul, Amplitaq Gold(5U/ul)0. lul，補足水到 5ul。置于 PCR 儀上反應預變性 94°C Imin ；94°C 30sec, 55°C 30sec,72°C lmin，40 個循環(huán)；Hold 4°C。擴增引物IF AATCCCAGTCCCTATTCCTATIR TTCCAGGTTGGCTCCATAT2F GGGTTCTTTGACGACAACATTA2R CTTGAGATTTCACTTGGTTCTGT3F GTGAGGTACTTGGCAGATCCT3R CTGGAGCAAGAAGCAACACT4F GATAATTGCTACTGCCATTTCAT4R TAGGACTATTGAAGGAGTATCAGTG5F TGCCATTCCTCGACTTGTT5R ACATCTTCTCAGGATTCTTCTCTT3 純化在PCR擴增產(chǎn)物中加入2ul Exo I-SAP-IT純化試劑(購自USB)。將96孔板放入 PCR 儀中進行純化，純化程序37°C 30min,96°C lOmin，Hold4°C。4引物延伸反應純化后的PCR產(chǎn)物中加入延伸反應混合物extension Dilution Buffer3. 76ul, 延伸引物混合液(1010uM/L each) 0. 03ul, 20 XExtension Mix 0. 2ul，DNA 聚合酶 0. 02ul， 補足水到7ul。將裝有延伸反應混合物的96孔板再次放入PCR儀中進行延伸反應，反應程 序=Hold 96°C 3min ；94°C 20sec，40°C llsec，46 個循環(huán)；Hold 4°C。延伸引物序列IP TTTTTAACATCTTTTGTTTTATTTC2P AAGGACACATTCTTTTTGACGGTCC3P GCCTTCCAAGTGCTGGTCTCACAGC4P GCATTGTTAAATCCATCCCAAGGGG5P GTTCCTACCTGTGTCTTTCCTCCAG以上延伸探針5’端具有與微陣列芯片地址引物對應的地址序列。5延伸反應結(jié)束后，加入雜交液可與微陣列芯片進行雜交反應。
孵育溫度42 0C，孵育時間2小時。6激光掃描檢測熒光信號同時檢測上述5個基因突變位點對預測、比較個體的大前庭水管綜合癥性耳聾 易感性具有重要意義。本發(fā)明將與大前庭水管綜合癥性耳聾易感、發(fā)生密切相關的PDS 基因熱點突變進行組合，通過大量的篩選數(shù)據(jù)表明所述5個多態(tài)性位點IVS7-2A > G、 A2168G (H723R)、L236P、IVS8+1G > A 和 T416P，如出現(xiàn) IVS7-2A > G 或 H723R 突變，則患大 前庭水管綜合癥性耳聾的概率較高；其余三個位點中有一個發(fā)生突變患大前庭水管綜合癥
6性耳聾的概率較小。本發(fā)明采用單核苷酸延伸技術(shù)和微陣列芯片技術(shù)相結(jié)合的方法，針對上述5個位 點，設計一套多重PCR引物，在一個擴增反應中同時擴增攜帶SNP位點的5個基因片段，根 據(jù)SNP位點上游5’端23-2^p的序列設計寡核苷酸探針，此探針與序列雜交后3’末端位 于snp5’端上游Ibp處。檢測時聚合酶根據(jù)SNP攜帶的堿基在探針末端結(jié)合上一個攜帶熒 光的ddNTP，根據(jù)結(jié)合的ddNTP不同，其所攜帶的熒光顏色也不相同，在探針的5’端根據(jù)與 微陣列芯片結(jié)合位置的不同設計有不同的20bp的Tag地址序列，與微陣列芯片上對應的序 列互補，延伸后的探針與微陣列芯片上對應區(qū)域上的序列雜交，不同的探針結(jié)合在芯片的 不同區(qū)域，通過檢測對應位置的熒光，達到同時進行多個SNP分型的目的。疾病的發(fā)生是一個十分復雜的過程，受到多個蛋白和基因的共同影響，其中任何 一個酶的改變都會影響疾病的易感性。傳統(tǒng)的基因檢測疾病的方法受到方法的限制，往往 只能對一到兩個基因的多態(tài)性進行分析，只能覆蓋一部份患病風險人群，對于由于其他基 因上的多態(tài)性造成的疾病患病風險不能及時的預警，檢測的準確性因此會大幅降低，受檢 者不能全面的了解自身疾病的易感情況。本發(fā)明針對一種疾病不同的患病途徑檢測相關基因和其多態(tài)性位點，能更準確更 全面的檢測受檢者不同患病途徑的患病風險，能給受檢者提出具有針對性和有效地健康建 議，及時有效的避免其疾病的發(fā)生。由于本發(fā)明使用的檢測方法可以高通量，自動化的檢測SNP，大幅降低了檢測成 本，可以對不同患病途徑的多個基因同時進行檢測，本發(fā)明針對大前庭水管綜合癥性耳聾 PDS基因?qū)ふ姨暨x了 5個多態(tài)性位點，能更準確更全面的檢測受檢者不同患病途徑的患病 風險，能夠給受檢者提出具有針對性的健康建議，及時有效的避免其疾病的發(fā)生。本發(fā)明 通過單核苷酸延伸技術(shù)結(jié)合微陣列芯片技術(shù)，利用特異性引物和探針對單核苷酸多態(tài)性 (SNP)的基因分型準確率超過99%，同時檢測上述5個基因突變位點對檢測、比較個體的大 前庭水管綜合癥性耳聾易感性具有重要意義。綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實施例中，相同領域內(nèi)的有識之士可 以在本發(fā)明的技術(shù)指導思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實施例，但這種實施例都包括在本發(fā) 明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于確定大前庭水管綜合癥性耳聾PDS基因突變的基因組合，其特征在于，它 包括PDS基因五個突變位點的組合JVS7-2A > G、A2168G(H723R)、L236P、IVS8+1G >八和 Τ416Ρ0
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于確定大前庭水管綜合癥性耳聾PDS基因突變的基因組 合，其特征在于，五個突變位點分別對應下述SNP位點rsl 11033313位點、rsl21908362位 點、rs80338848 位點、rs80338849 和 rs28939086 位點。
3.如權(quán)利要求2所述的用于確定大前庭水管綜合癥性耳聾PDS基因突變的基因組合， 用于針對所述位點設計特異性的弓I物對和探針。
4.如權(quán)利要求2所述的用于確定大前庭水管綜合癥性耳聾PDS基因突變的組合設計的 特異性引物，其特征在于，所述的特異性引物對的序列如下，用于進行多重PCR擴增，能同 時擴增出上述5個位點的基因片段針對 rslll033313 位點AATCCCAGTCCCTATTCCTAT (SEQ ID NO 1) TTCCAGGTTGGCTCCATAT (SEQ ID NO 2)針對 rsl21908362 位點GGGTTCTTTGACGACAACATTA (SEQ ID NO :3) CTTGAGATTTCACTTGGTTCTGT(SEQ ID NO :4)針對 rs80338848 位點GTGAGGTACTTGGCAGATCCT (SEQ ID NO:5) CTGGAGCAAGAAGCAACACT (SEQ ID NO :6)針對 rs80338849 位點GATAATTGCTACTGCCATTTCAT (SEQ ID NO :7) TAGGACTATTGAAGGAGTATCAGTG(SEQ ID NO :8) 針對 rs28939086 位點TGCCATTCCTCGACTTGTT (SEQ ID NO :9) ACATCTTCTCAGGATTCTTCTCTT(SEQ ID NO :10)。
5.如權(quán)利要求2所述的用于確定大前庭水管綜合癥性耳聾PDS基因突變的組合設計的 特異性探針，其特征在于，所述的特異性探針序列如下，能同時對5個位點進行檢測分型針對 rsl 11033313 位點TTTTTAACATCTTTTGTTTTATTTC (SEQ ID NO 11) 針對 rsl21908362 位點AAGGACACATTCTTTTTGACGGTCC (SEQ ID NO :12) 針對 rs80338848 位點GCCTTCCAAGTGCTGGTCTCACAGC (SEQ ID NO :13) 針對 rs80338849 位點GCATTGTTAAATCCATCCCAAGGGG (SEQ ID NO :14) 針對 rs^939086 位點GTTCCTACCTGTGTCTTTCCTCCAG (SEQ ID NO :15)。
6.如權(quán)利要求4或5所述的引物或探針，用于通過單核苷酸延伸技術(shù)結(jié)合微陣列芯片 技術(shù)特異性檢出前庭水管綜合癥性耳聾易感基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于確定大前庭水管綜合癥性耳聾PDS基因突變的基因組合、引物、探針和用途，它包括PDS基因五個突變位點的組合IVS7-2A＞G、A2168G(H723R)、L236P、IVS8+1G＞A和T416P。分別對應下述SNP位點rs111033313位點、rs121908362位點、rs80338848位點、rs80338849和rs28939086位點。通過檢測一組與大前庭水管綜合癥性耳聾易感性相關的基因及位點，利用特異性引物和探針，通過單核苷酸延伸技術(shù)結(jié)合微陣列芯片技術(shù)，綜合檢測和分析受檢人群是否攜帶“大前庭水管綜合癥性耳聾易感基因”，將大前庭水管綜合癥性耳聾易感人群從人群中篩選出來，從而滿足快速診斷和治療的目的。
文檔編號C12Q1/68GK102108410SQ20101059938
公開日2011年6月29日 申請日期2010年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月22日
發(fā)明者劉志霈, 劉蓉華, 周毓玲, 李楠, 杜宏偉, 陳勇, 靳霞, 韓俊領 申請人:協(xié)和干細胞基因工程有限公司, 天津濱海協(xié)和基因科技有限公司