專利名稱：生物反應器微載體培養(yǎng)人二倍體細胞生產(chǎn)病毒疫苗的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)病毒疫苗的方法，具體地，本發(fā)明涉及一種生物反應器微載體培養(yǎng)人二倍體細胞生產(chǎn)病毒疫苗的方法。
背景技術：
人二倍體細胞是指來源于人正常體細胞的、可進行體外傳代培養(yǎng)、并對多種病毒具有廣泛的敏感性的細胞。人二倍體細胞不是腫瘤細胞，因而具有一定的穩(wěn)定傳代壽命 (通常為40 60代)，超過所述傳代壽命則可能發(fā)生細胞的衰老、退化以及死亡。傳代壽命內(nèi)，人二倍體細胞的任一傳代水平細胞的染色體組型保持正常二倍體染色體數(shù)目，具二倍體的細胞數(shù)，應占所檢查分裂中期細胞總數(shù)的75%以上。人二倍體細胞株雖然穩(wěn)定傳代壽命有限，但其細胞株在衰老前任一傳代水平都可將多余的細胞凍存起來，而在需要時復蘇重新培養(yǎng)使用，因此一個細胞株所能供應的使用量也是非常巨大的。例如典型的人二倍體細胞MRC-5細胞系、WI-38細胞系、2BS細胞系、 KMB-17細胞系等都在商業(yè)上可供，可以從諸如美國模式菌種收集中心(ATCC)、歐洲細胞培養(yǎng)物收藏中心(ECACC)、中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)等細胞種子庫(種質(zhì)庫)中購買。用人二倍體細胞制備病毒性疫苗可以克服使用原代細胞在其培養(yǎng)物中可能存在的各種潛在致病因子的危險，是當前病毒性疫苗生產(chǎn)較為理想的細胞基質(zhì)。人二倍體細胞與原代細胞相比，具有能夠充分鑒定和標準化的優(yōu)點，可實現(xiàn)細胞種子庫系統(tǒng)，建立的細胞庫可多年用于生產(chǎn)，有利于質(zhì)量控制。人二倍體細胞與腫瘤傳代細胞相比，理論上不存在致腫瘤的潛在危險性。我國已上市的疫苗中，甲型肝炎疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、風疹減毒活疫苗、水痘減毒活疫苗分別使用了 2BS、KMB-17、MRC-5細胞。使用生物反應器微載體培養(yǎng)動物細胞進行生物制品生產(chǎn)是生物制藥行業(yè)的必然趨勢，但由于人二倍體細胞生長緩慢、傳代次數(shù)有限、 對生長環(huán)境要求高，一般認為其難以進行大規(guī)模細胞培養(yǎng)，尤其是難以使用生物反應器實現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決難以使用生物反應器實現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)人二倍體細胞，發(fā)明人經(jīng)過研究， 提供了一種反應器微載體培養(yǎng)人二倍體細胞生產(chǎn)病毒疫苗的方法，該方法可以實現(xiàn)用生物反應器培養(yǎng)人二倍體細胞大規(guī)模生產(chǎn)病毒疫苗。為了解決上述問題，本發(fā)明提供以下技術方案。1. 一種生物反應器微載體培養(yǎng)人二倍體細胞生產(chǎn)病毒疫苗的方法，其包括以下步驟1)復蘇人二倍體細胞；2)擴增培養(yǎng)人二倍體細胞并制備細胞懸液；
3)生物反應器微載體培養(yǎng)人二倍體細胞將步驟2、獲得的細胞懸液接種至生物反應器，其中，所述生物反應器預先加入滅菌的新鮮細胞培養(yǎng)液以及微載體，所述接種細胞的終密度為5X 104-2X 106個細胞/ml ；然后在35-39°C、pH6. 5-8. 0、溶氧15% -100%的條件下，培養(yǎng)得到微載體單層細胞，細胞密度達IX IO6個細胞/ml以上；4)病毒的接種、繁殖及收獲。2.根據(jù)技術方案1所述的方法，其中，所述步驟3)中，所述接種細胞的終密度為 IXIO5-IXiO6 個細胞/ml。3.根據(jù)上述技術方案所述的方法，其中，所述步驟3)中，在36-38°C、pH 6. 8-7. 8, 溶氧20% -80%的條件下，培養(yǎng)得到微載體單層細胞，細胞密度達2 X IO6個細胞/ml以上。4.根據(jù)上述技術方案中任一項所述的方法，其中，步驟4)中所述病毒的接種、繁殖及收獲的步驟如下進行將經(jīng)步驟3)得到的細胞培養(yǎng)液更換為病毒維持液，按病毒感染復數(shù)MOI為 0. 0001-10的量接種病毒，在培養(yǎng)溫度30-38°C、pH6. 5-8. 0、溶氧15% -100%條件下培養(yǎng)病密閉、無菌收獲病毒。5.根據(jù)技術方案4所述的方法，其中，按病毒感染復數(shù)MOI為0.001-1的量接種病毒，培養(yǎng)溫度為30-37°C、pH為7. 0-7. 8、溶氧為20% -80%。6.根據(jù)上述技術方案中任一項所述的方法，其中，步驟1)中所述復蘇人二倍體細胞的步驟如下進行將從液氮中取出的凍存人二倍體細胞立即放入37°C水浴中解凍；將所得解凍的凍存細胞液加入到新鮮細胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻；在800-1000rpm下重復離心2次，每次2_5分鐘，棄上清液；向細胞沉淀中加入新鮮細胞培養(yǎng)液，輕輕混勻后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，添加細胞生長液，在36-38°C下培養(yǎng)至細胞生長平鋪瓶底。7.根據(jù)技術方案6所述的方法，其中，將從液氮中取出的凍存人二倍體細胞立即放入37 °C水浴中解凍；將1-2體積的凍存細胞液加入到5-10體積的新鮮細胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻；在800-1000rpm下重復離心2次，每次2_5分鐘，棄上清液；向細胞沉淀中加入5-10體積新鮮細胞培養(yǎng)液，輕輕混勻后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，添加細胞生長液至20-30體積，在36-38°C下培養(yǎng)至細胞生長平鋪瓶底。8.根據(jù)上述技術方案中任一項所述的方法，其中，步驟幻中所述擴增培養(yǎng)并制備細胞懸液時所使用的容器為方瓶、滾瓶、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶、細胞工廠或生物反應器。9.根據(jù)上述技術方案中任一項所述的方法，步驟幻中所述擴增培養(yǎng)中細胞傳代比例為1:2-1: 4。10.根據(jù)權利要求1 9中任一項所述的方法，其中，所述微載體為Cytodex系列微載體、Cytopore系列微載體、Cytoline系列微載體和/或FibmCel Disks微載體。11.根據(jù)權利要求1 10中任一項所述的方法，其中，所述微載體為Cytodexl和 /或CytodeX3，微載體的量為3-25g/L。
12.根據(jù)上述技術方案中任一項所述的方法，其中，所述步驟幻以流加或灌注方式小規(guī)模擴大培養(yǎng)人二倍體細胞。13.根據(jù)上述技術方案中任一項所述的方法，其中，所述步驟4)以流加或灌注方式培養(yǎng)接種病毒后的人二倍體細胞。14.根據(jù)上述技術方案中任一項所述的方法，其中，所述方法還包括提前按照以下操作水化微載體以及對承載水化微載體的生物反應器滅菌的步驟將微載體與50_100mL/g的量的無Ca2+和Mg2+的PBS液混合，在室溫下開始水化， 其間每15min以50-200rpm的轉(zhuǎn)速攪拌2_5分鐘，水化4h或過夜后，停止攪拌，自然沉降， 棄去上清，完成預處理；加入30-50mL/g的量的新鮮無Ca2+和Mg2+的PBS液，然后每15min以50_200rpm 的轉(zhuǎn)速攪拌2-5分鐘，30min后停止攪拌，自然沉降，棄去上清液，完成洗滌；重復所述洗滌 1-5次，棄去用于洗滌的上清液PBS ；加入30_50mL/g的量的新鮮無Ca2+和Mg2+的PBS液，得到水化的微載體；然后將水化微載體置于反應器罐體；連接反應器各個管路，121°C高壓濕熱滅菌 30min ；無菌排出無Ca2+和Mg2+的PBS液，加入無菌的新鮮細胞培養(yǎng)液，對滅菌后的水化微載體潤洗一次，排出潤洗液，再加入培養(yǎng)體積的無菌的新鮮細胞培養(yǎng)液。15.根據(jù)上述技術方案1-14中任一項所述的方法，其中，所述人二倍體細胞選自由MRC-5細胞系、WI-38細胞系、2BS細胞系和KMB-17細胞所組成的組中；所述病毒選自由風疹病毒、麻疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、輪狀病毒、甲型肝炎病毒、水痘帶狀皰疹病毒、狂犬病病毒和乙型腦炎病毒所組成的組中。本發(fā)明提供的反應器微載體培養(yǎng)人二倍體細胞生產(chǎn)病毒疫苗的方法，通過對以上各個步驟操作條件的嚴格控制，找到各個步驟操作條件的合理組合，不僅使得采用生物反應器培養(yǎng)人二倍體細胞大規(guī)模生產(chǎn)病毒疫苗成為可能，而且使得采用本發(fā)明方法生產(chǎn)的病毒疫苗產(chǎn)量高、一致性好，可以高效實現(xiàn)病毒疫苗的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1顯示了實施例5中120升反應器中懸浮培養(yǎng)MRC-5細胞的細胞生長曲線；圖2顯示了實施例6中650升反應器中懸浮培養(yǎng)WI-38細胞的細胞生長曲線；圖3顯示了實施例7中1200升反應器中懸浮培養(yǎng)2BS細胞的細胞生長曲線；圖4顯示了實施例8中1200升反應器中懸浮培養(yǎng)KMB-17細胞的細胞生長曲線。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種生物反應器微載體培養(yǎng)人二倍體細胞生產(chǎn)病毒疫苗的方法，其包括以下步驟1)復蘇人二倍體細胞；2)擴增培養(yǎng)人二倍體細胞并制備細胞懸液；3)生物反應器微載體培養(yǎng)人二倍體細胞將步驟幻獲得的細胞懸液接種至生物反應器，其中，所述生物反應器預先加入滅菌的新鮮細胞培養(yǎng)液以及微載體，所述接種細胞的終密度為5X 104-2X IO6個細胞/ml， 優(yōu)選為 IX IO5-IX IO6 個細胞/ml ；然后在 35-39 °C、優(yōu)選 36-38 °C，ρΗ6· 5-8. 0、優(yōu)選 ρΗ 6. 8-7. 8，溶氧15% -100%、優(yōu)選溶氧20% -80%的條件下，培養(yǎng)得到微載體單層細胞，細胞密度達IX IO6個細胞/ml以上，優(yōu)選達2 X IO6個細胞/ml以上；4)病毒的接種、繁殖及收獲。優(yōu)選地，在上述本發(fā)明的方法中，上述步驟4)中所述病毒的接種、繁殖及收獲的步驟如下進行將經(jīng)步驟3)得到的細胞培養(yǎng)液更換為病毒維持液，按病毒感染復數(shù)MOI為 0. 0001-10、優(yōu)選0. 001-1的量接種病毒，在培養(yǎng)溫度30-38°C、優(yōu)選30-37°C, ρΗ6· 5-8. 0、 優(yōu)選ρΗ 7. 0-7. 8，溶氧15% -100%、優(yōu)選20% -80%的條件下培養(yǎng)病毒；密閉、無菌收獲病優(yōu)選地，在上述本發(fā)明的方法中，步驟1)中所述復蘇人二倍體細胞的步驟如下進行將從液氮中取出的凍存人二倍體細胞立即放入37°C水浴中解凍；將所得解凍的凍存細胞液加入到新鮮細胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻；在SOO-IOOOrpm下重復離心2次，每次2_5分鐘， 棄上清液；向細胞沉淀中加入新鮮細胞培養(yǎng)液，輕輕混勻后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，添加細胞生長液，在36-38°C下培養(yǎng)至細胞生長平鋪瓶底。更優(yōu)選地，在上述本發(fā)明的方法中，步驟1)中所述復蘇人二倍體細胞的步驟如下進行將從液氮中取出的凍存人二倍體細胞立即放入37°C水浴中解凍；將1-2體積的凍存細胞液加入到5-10體積的新鮮細胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻；在800-1000rpm下重復離心2次， 每次2-5分鐘，棄上清液；向細胞沉淀中加入5-10體積新鮮細胞培養(yǎng)液，輕輕混勻后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，添加細胞生長液至20-30體積，在36-38°C下培養(yǎng)至細胞生長平鋪瓶底。在上述本發(fā)明的方法中，步驟幻中所述擴增培養(yǎng)并制備細胞懸液時所使用的容器可以是本領域中擴增培養(yǎng)細胞時常用的容器，例如可以為方瓶(T-flask)、轉(zhuǎn)瓶(Roller)、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶(Spinner flask)、細胞工廠(Cell factory)或生物反應器 (Bioreactor)。在上述本發(fā)明的方法中，步驟2)中所述擴增培養(yǎng)中細胞傳代比例優(yōu)選為 1:2-1: 4。步驟幻和步驟幻中所述微載體沒有特別限定，可為所有能用于人二倍體細胞培養(yǎng)的常用微載體，很多微載體都已經(jīng)是商業(yè)化產(chǎn)品，可以通過商業(yè)途徑獲得。優(yōu)選所述微載體為Cytodex系列微載體、Cytopore系列微載體、Cytoline系列微載體和/或 FibraCel Disks微載體，更優(yōu)選所述微載體為Cytodexl和/或Cytodex3。微載體的量優(yōu)選為=Cytodex 系列3_25g/L ；Cytopore 系列2_8g/L ；Cytoline :100_300g/L ；Disks 10-40g/L，其中所述Cytodexl和/或CytodeX3微載體的量優(yōu)選為3_25g/L。另外，本發(fā)明中所用細胞工廠為一種細胞培養(yǎng)裝置，又名cell factories或cell stack，其材質(zhì)多為組織培養(yǎng)級聚苯乙烯，有1層到40層的不同規(guī)格，具有低污染風險，節(jié)省空間、可全面實現(xiàn)細胞培養(yǎng)自動化等優(yōu)點，可商購獲得，具體可以使用例如美國康寧公司的Cell Mack 細胞培養(yǎng)室，賽默飛世爾科技有限公司的fesyFill 細胞工廠。在上述本發(fā)明的方法中，優(yōu)選所述步驟2、以流加或灌注方式小規(guī)模擴大培養(yǎng)人二倍體細胞。在上述本發(fā)明的方法中，優(yōu)選所述步驟4)以流加或灌注方式培養(yǎng)接種病毒后的
7人二倍體細胞。優(yōu)選地，在上述本發(fā)明的方法中，所述方法還包括提前按照以下操作水化微載體以及對承載水化微載體的生物反應器滅菌的步驟將微載體與50_100mL/g的量的無Ca2+和Mg2+的PBS液混合，在室溫下開始水化， 其間每15min以50-200rpm的轉(zhuǎn)速攪拌2_5分鐘，水化4h或過夜后，停止攪拌，自然沉降， 棄去上清，完成預處理；加入30-50mL/g的量的新鮮無Ca2+和Mg2+的PBS液，然后每15min以50_200rpm 的轉(zhuǎn)速攪拌2-5分鐘，30min后停止攪拌，自然沉降，棄去上清液，完成洗滌；重復所述洗滌 1-5次，棄去用于洗滌的上清液PBS ；加入30_50mL/g的量的新鮮無Ca2+和Mg2+的PBS液，得到水化的微載體；然后將水化微載體置于反應器罐體；連接反應器各個管路，121°C高壓濕熱滅菌 3Omin ；無菌排出無Ca2+和Mg2+的PBS液，加入無菌的新鮮細胞培養(yǎng)液，對滅菌后的水化微載體潤洗一次，排出潤洗液，再加入培養(yǎng)體積的無菌的新鮮細胞培養(yǎng)液。更具體地，本發(fā)明的上述反應器微載體培養(yǎng)人二倍體細胞生產(chǎn)病毒疫苗的方法包括以下步驟1)復蘇人二倍體細胞將從液氮中取出的凍存人二倍體細胞立即放入37°C水浴中解凍；將1-2體積的凍存細胞液加入到5-10體積的新鮮細胞培養(yǎng)液中，優(yōu)選將1. 5體積的凍存細胞液加入到8體積的新鮮細胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻；在800-1000rpm下離心2_5分鐘，優(yōu)選在900rpm下離心3分鐘，棄上清液；向細胞沉淀中加入5-10體積新鮮細胞培養(yǎng)液，輕輕混勻；在800-1000rpm下再次離心2_5分鐘，優(yōu)選在900rpm下再次離心2分鐘，棄上清液；向細胞沉淀中加入5-10體積，優(yōu)選8體積，新鮮細胞培養(yǎng)液，輕輕混勻后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，添加細胞生長液至20-30體積，優(yōu)選20體積，在36-38°C，優(yōu)選36_37°C，更優(yōu)選 37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞生長平鋪瓶底；2)消化人二倍體細胞傾去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基，加入胰酶消化液，優(yōu)選加入培養(yǎng)體積的1/20-1/10含 0. 02% EDTA的胰酶消化液，在35-38°C下，優(yōu)選在36-38°C下，更優(yōu)選在37°C下，消化至細胞附著松動、細胞邊緣卷起且細胞間的間隔加大，倒去胰酶消化液，加入新鮮細胞培養(yǎng)液后吹打，得到細胞懸液；3)預培養(yǎng)人二倍體細胞將步驟幻獲得的細胞懸液接種至轉(zhuǎn)瓶，并向轉(zhuǎn)瓶中加入新鮮細胞培養(yǎng)液使所述接種細胞的終密度為5X 104-2X IO6個細胞/ml，優(yōu)選1 X IO5-I X IO6個細胞/ml，更優(yōu)選 2X 105-5X 105個細胞/ml，；然后在;35_39°C、pH 6. 5-8. 0、轉(zhuǎn)速5_15rph的條件下，優(yōu)選在 36-380C > pH 6. 8-7. 8、轉(zhuǎn)速 8_12rph 的條件下，更優(yōu)選在 37°C、pH 7. 0-7. 8、轉(zhuǎn)速 IOrph 的
條件下，培養(yǎng)直至形成貼壁單層細胞；傾去轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)基，加入胰酶消化液，優(yōu)選加入培養(yǎng)體積的1/20-1/10含0. 02%EDTA的濃度為0. 1 % -0. 5%的胰酶消化液，在35-38°C下，優(yōu)選在36-38°C下，更優(yōu)選在 37°C下消化至細胞附著松動、細胞邊緣卷起且細胞間的間隔加大，倒去胰酶消化液，加入新鮮細胞培養(yǎng)液后吹打，得到預培養(yǎng)的細胞懸液；4)小規(guī)模擴大培養(yǎng)人二倍體細胞將步驟幻獲得的細胞接種至容積為1-15L的小規(guī)模生物反應器，其中，所述小規(guī)模生物反應器預先加入30-80%容積的滅菌的新鮮細胞培養(yǎng)液以及3-25g/L，優(yōu)選5_15g/ L的微載體，所述接種細胞的終密度為5 X 104-5 X IO6個細胞/ml，優(yōu)選1 X IO5-I X IO6個細胞/ml，更優(yōu)選 2X 105-5X IO5 個細胞/ml ；然后在 35_39°C、pH 6. 5-8. 0、溶氧 15-100%、濕度90-98%、攪拌轉(zhuǎn)速20-150rpm的條件下，優(yōu)選在36_38°C、pH 6. 8-7. 8、溶氧20-80%、濕度90-98%、攪拌轉(zhuǎn)速30-120rpm的條件下，更優(yōu)選在37°C、pH 7. 0-7. 8、溶氧30-70%、濕度90-98%、攪拌轉(zhuǎn)速40-80rpm的條件下培養(yǎng)；5)制備經(jīng)小規(guī)模擴大培養(yǎng)的人二倍體細胞懸液停止步驟4)所述小規(guī)模生物反應器的攪拌，使附著有細胞的微載體自然沉降，泵出上清培養(yǎng)液，用ρΗ7· 6的含有0. 02% (w/v)EDTA的無Ca2+、Mg2+離子的PBS洗滌2-3遍， 優(yōu)選3遍，所述EDTA-PBS溶液總使用量為一個所述小規(guī)模生物反應器的容積；然后加入恰可覆蓋微載體的胰酶消化液，優(yōu)選含0. 02% EDTA的胰酶消化液，在溫度;35-38°C、pH 7. 0-7. 4 并且轉(zhuǎn)速 20_80rpm 下，消化 10min_30min，優(yōu)選在溫度 36_38°C、pH 7. 2-7. 4并且轉(zhuǎn)速30-70rpm下，消化15min_20min，更優(yōu)選在溫度37 °C、pH 7. 2-7. 4并且轉(zhuǎn)速50rpm下，消化17min ；消化后通過加入消化時工作體積的1-2倍，優(yōu)選1. 5倍的細胞培養(yǎng)液終止胰酶的消化作用，即得到微載體與細胞分離開來的混合液；然后通過孔徑大于人二倍體細胞小于微載體的對于動物細胞無毒性的篩網(wǎng)無菌過濾，得到細胞懸液；6)大規(guī)模擴大培養(yǎng)人二倍體細胞將步驟4)獲得的細胞懸液接種至容積在15L以上的大規(guī)模反應器，其中，所述大規(guī)模反應器預先加入30-80%容積，優(yōu)選40-60%容積的滅菌的新鮮細胞培養(yǎng)液以及 3-25g/L，優(yōu)選5-15g/L的微載體，所述接種細胞的終密度為5 X 104_2 X IO6個細胞/ml，優(yōu)選 1 X IO5-I X IO6 個細胞 /ml，更優(yōu)選 2 X 105-5 X IO5 個細胞 /ml ；然后在;35_39°C、pH 6. 5-8. 0、 溶氧15-100%、濕度90-98%、攪拌轉(zhuǎn)速20-150rpm的條件下，優(yōu)選在36_38°C、pH 6. 8-7. 8、 溶氧20-80%、濕度90-98%、攪拌轉(zhuǎn)速30-120rpm的條件下，更優(yōu)選在37°C、pH 7. 0-7. 8、 溶氧30-70%、濕度90-98%、攪拌轉(zhuǎn)速40-80rpm的條件下培養(yǎng)，得到微載體單層細胞，細胞密度達到IXlO6以上；7)病毒的接種、繁殖及收獲停止步驟6)所述大規(guī)模反應器的攪拌，使附著有細胞的微載體自然沉降，泵出上
清培養(yǎng)液；按病毒感染復數(shù)MOI為0. 0001-10，優(yōu)選0. 001-1，更優(yōu)選0. 01-0. 5，最優(yōu)選為0. 1
的量接種病毒，即向細胞沉淀中加入含有病毒的病毒維持液；然后在培養(yǎng)溫度30-38°C、pH :6. 5-8. 0、溶氧15% -100%、濕度90-98%、攪拌轉(zhuǎn)速 20-150rpm 條件下，優(yōu)選在培養(yǎng)溫度 30-37 °C、pH :7. 0-7. 8、溶氧 20% _80%、濕度 90-98 %、攪拌轉(zhuǎn)速30-120rpm條件下培養(yǎng)，更優(yōu)選在培養(yǎng)溫度31_36°C、pH :7. 2-7. 8、溶氧30-70%、 濕度92-98%、攪拌轉(zhuǎn)速40-80rpm條件下培養(yǎng)；密閉、無菌收集上清病毒液；8)病毒液的保存收獲的病毒液檢測計數(shù)，置_15°C _20°C保存，優(yōu)選置_20°C保存。優(yōu)選地，所述方法還包括提前按照以下操作水化微載體以及對承載水化微載體的生物反應器滅菌的步驟將微載體與50_100mL/g的量的無Ca2+和Mg2+的PBS液混合，在室溫下開始水化， 其間每15min以50-200rpm的轉(zhuǎn)速攪拌2_5分鐘，水化4h或過夜后，停止攪拌，自然沉降， 棄去上清，完成預處理；加入30-50mL/g的量的新鮮無Ca2+和Mg2+的PBS液，然后每15min以50_200rpm 的轉(zhuǎn)速攪拌2-5分鐘，30min后停止攪拌，自然沉降，棄去上清液，完成洗滌；重復所述洗滌 1-5次，棄去用于洗滌的上清液PBS ；加入30_50mL/g的量的新鮮無Ca2+和Mg2+的PBS液，得到水化的微載體；然后將水化微載體置于反應器罐體；連接反應器各個管路，121°C高壓濕熱滅菌 30min ；無菌排出無Ca2+和Mg2+的PBS液，加入無菌的新鮮細胞培養(yǎng)液，對滅菌后的水化微載體潤洗一次，排出潤洗液，再加入培養(yǎng)體積的無菌的新鮮細胞培養(yǎng)液。其中，步驟4)和步驟6)所述微載體為Cytodex系列微載體、Cytopore系列微載體、Cytoline系列微載體和/或FibmCel Disks微載體，優(yōu)選所述微載體為Cytodexl和 / 或 Cytodex3。優(yōu)選地，上述更具體的本發(fā)明的方法中，所述步驟4)以流加或灌注方式小規(guī)模擴大培養(yǎng)人二倍體細胞，并收集以所述流加或灌注方式獲得的人二倍體細胞培養(yǎng)物進行所述步驟幻；所述步驟6)以流加或灌注方式大規(guī)模擴大培養(yǎng)人二倍體細胞，并收集以所述流加或灌注方式獲得的人二倍體細胞培養(yǎng)物進行所述步驟7)。優(yōu)選的流加或灌注的條件包括 首先在裝有人二倍體細胞培養(yǎng)基的生物反應器中，接種IO5-IO6細胞/ml培養(yǎng)基的人二倍體細胞培養(yǎng)8-24h后，開始連續(xù)灌注培養(yǎng)，每天的灌注速率為0. 5-3個培養(yǎng)體積的新鮮細胞培養(yǎng)基，隨著細胞密度的提高，逐步提高灌注速率達每天1-4個培養(yǎng)體積，直到生物反應器中的活細胞密度達到接種密度的4-50倍。所述步驟7)以流加或灌注方式培養(yǎng)接種病毒后的人二倍體細胞。優(yōu)選的流加或灌注的條件包括優(yōu)選地，步驟7)中采用灌注培養(yǎng)方式培養(yǎng)接種病毒后的人二倍體細胞。即在病毒感染人二倍體細胞一段時間后，比如6-18hr后， 可以采用灌注的連續(xù)培養(yǎng)方式往生物反應器中添加病毒維持液，灌注速率達每天1-3個培養(yǎng)體積可以長時間維持上述步驟7)的培養(yǎng)條件，不斷收獲上清病毒液。一般可以持續(xù)2-5 天，優(yōu)選持續(xù)3天，連續(xù)收獲上清病毒液。如圖4所示，連續(xù)收獲的病毒液都可以達到很高的病毒滴度，用本發(fā)明收獲的病毒液制備的病毒疫苗都具有很高的效價。病毒的滴度、效價可以按《中華人民共和國藥典》第2010年版三部中記載的方法進行檢測。所述細胞流加培養(yǎng)是指在細胞培養(yǎng)過程中，向生物反應器中不斷地添加少量新鮮的培養(yǎng)基。例如，在100升的生物反應器中，先僅加入45升培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)M小時后，連續(xù)少量添加新鮮的細胞培養(yǎng)基(例如1-10升/天)，最多可以加至80升。由于不斷添加新鮮的培養(yǎng)基，不僅補充了細胞所需的營養(yǎng)，而且可以稀釋代謝副產(chǎn)物，從而提高細胞培養(yǎng)密度和產(chǎn)物生產(chǎn)速率。細胞灌注培養(yǎng)是指在細胞培養(yǎng)過程中，往生物反應器中不斷地添加新鮮培養(yǎng)基，同時通過細胞截留裝置排出培養(yǎng)上清，而活細胞被繼續(xù)截留在生物反應器中的一種培養(yǎng)操作方式。培養(yǎng)基的不斷流出，可帶走代謝副產(chǎn)物如乳酸、氨等，使其維持在低濃度水平，不會成為細胞生長的抑制因素，所以細胞可生長在良好培養(yǎng)環(huán)境中，能獲得很高的細胞培養(yǎng)密度和產(chǎn)物生產(chǎn)速率。灌注培養(yǎng)具有反應器體積小，回收培養(yǎng)上清體積大， 產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時間短，可及時回收產(chǎn)品至低溫下保存，有利于保持產(chǎn)品活性等顯著特點。本發(fā)明的所述方法可以適用于反應器微載體培養(yǎng)多種人二倍體細胞生產(chǎn)病毒疫苗。優(yōu)選地，所述人二倍體細胞選自由MRC-5細胞系、WI-38細胞系、2BS細胞系和KMB-17 細胞所組成的組中；所述病毒選自由風疹病毒、麻疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、輪狀病毒、甲型肝炎病毒、水痘帶狀皰疹病毒、狂犬病病毒和乙型腦炎病毒所組成的組中。所述細胞培養(yǎng)液及病毒維持液沒有特別限定，可以使用所有能用于人二倍體細胞培養(yǎng)的常用細胞培養(yǎng)基，如基礎MEM細胞培養(yǎng)基或改良型MEM細胞培養(yǎng)基。很多細胞培養(yǎng)基都已經(jīng)是商業(yè)化產(chǎn)品，可以通過商業(yè)途徑獲得。如北京清大天一科技有限公司所生產(chǎn)的 MD610細胞培養(yǎng)基等。本發(fā)明的方法可以使用本領域常用的各種生物反應器。優(yōu)選所述生物反應器為攪拌式生物反應器、氣升式生物反應器、wave生物反應器或中空纖維反應器，更優(yōu)選攪拌式生物反應器。所述收獲的病毒液可能含有少量的人二倍體細胞碎片甚至人二倍體細胞，因此， 優(yōu)選所述步驟7)還包括將所述收獲的病毒液在_15°C至_70°C下凍融1-2次后過濾細胞碎片。優(yōu)選在_15°C至_20°C下凍融1-2次。所述過濾可以采用本領域常用的手段進行，比如使用300-400目的尼龍或不銹鋼篩網(wǎng)。本發(fā)明收獲的病毒液既可以用于制備病毒活疫苗，也可以用于制備病毒滅活疫苗。無論是活疫苗還是滅活疫苗，所述方法都包括將步驟7)所得的病毒液與免疫佐劑混合的步驟。所述免疫佐劑可以為本領域常用的各種例如氫氧化鋁和油佐劑的免疫佐劑。在制備滅活病毒疫苗時，所述步驟7)所述收獲的病毒液可以通過加入甲醛溶液滅活病毒，所述病毒液和甲醛溶液的混合物中甲醛最終濃度為0.01%至0.4%。優(yōu)選所述步驟7)還包括中空纖維或超濾膜濃縮所述滅活的病毒液。在本發(fā)明的各種實施方式中，構成所用的培養(yǎng)基的化學試劑，原則上可以為所有能夠用于培養(yǎng)所用的人二倍體細胞和病毒的培養(yǎng)基都可以使用。很多化學試劑都已經(jīng)是商業(yè)化產(chǎn)品，可以通過商業(yè)途徑獲得。本發(fā)明的前述及其他特征將在下文中更全面進行描述并在權利要求中特別指出， 以下說明書詳細闡述本發(fā)明的一些示例實施方式，不過，這些實施方式只是表示本發(fā)明的原則可以被使用的幾個不同的方式。參見下面優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的其他優(yōu)點和特征對于本領域技術人員來說是顯而易見的。實施例實施例用于說明更具體的本發(fā)明的生物反應器微載體培養(yǎng)人二倍體細胞生產(chǎn)病毒疫苗的方法。實施例1
提前按照以下操作水化微載體以及對承載水化微載體的生物反應器滅菌將微載體與50mL/g的量的無Ca2+和Mg2+的PBS液混合，在室溫下開始水化，其間每15min以50rpm的轉(zhuǎn)速攪拌2分鐘，水化過夜后，停止攪拌，自然沉降，棄去上清，完成預處理；加入30mL/g的量的新鮮無Ca2+和Mg2+的PBS液，然后每15min以50rpm的轉(zhuǎn)速攪拌2分鐘，30min后停止攪拌，自然沉降，棄去上清液，完成洗滌；重復所述洗滌1次，棄去用于洗滌的上清液PBS;加入30mL/g的量的新鮮無Ca2+和Mg2+的PBS液，得到水化的微載體；然后將水化微載體置于反應器罐體；連接反應器各個管路，121°C高壓濕熱滅菌 30min ；無菌排出無Ca2+和Mg2+的PBS液，加入無菌的新鮮細胞培養(yǎng)液，對滅菌后的水化微載體潤洗2次，排出潤洗液，再加入培養(yǎng)體積的無菌的新鮮細胞培養(yǎng)液。 水化微載體以及對承載水化微載體的生物反應器滅菌后，進行以下操作。1)復蘇 MRC-5 細胞(購自 ATCC)將從液氮中取出的凍存MRC-5細胞立即放入37°C水浴中解凍；將Iml的凍存細胞液加入到5ml的新鮮細胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻；在800rpm下離心2分鐘，棄上清液；向細胞沉淀中加入5ml新鮮細胞培養(yǎng)液，輕輕混勻；在800rpm下再次離心2分鐘，棄上清液；向細胞沉淀中加入5ml新鮮細胞培養(yǎng)液，輕輕混勻后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，添加細胞生長液至20ml，在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞生長平鋪瓶底；2)擴增培養(yǎng)MRC-5細胞傾去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基，加入Iml的含0. 02% EDTA胰酶消化液，在37°C下消化至細胞附著松動、細胞邊緣卷起且細胞間的間隔加大，倒去胰酶消化液，加入新鮮細胞培養(yǎng)液后吹打，得到細胞懸液；將上述步驟獲得的細胞懸液接種至轉(zhuǎn)瓶，并向轉(zhuǎn)瓶中加入新鮮細胞培養(yǎng)液使所述接種細胞的終密度為ι χ IO5個細胞/ml ；然后在36°C、pH 7. 0、轉(zhuǎn)速5rph的條件下培養(yǎng)；以 1 2的比例連續(xù)傳代擴增培養(yǎng)，獲得布滿致密單層細胞的轉(zhuǎn)瓶。傾去轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)基，加入Iml的含0. 25%胰酶和0. 02% EDTA胰酶消化液，在37°C 下消化至細胞附著松動、細胞邊緣卷起且細胞間的間隔加大，倒去胰酶消化液，加入新鮮細胞培養(yǎng)液后吹打，獲得細胞懸液，混合轉(zhuǎn)瓶中細胞懸液，得到接種生物反應器的細胞懸液；3)生物反應器微載體大規(guī)模培養(yǎng)MRC-5細胞將步驟幻獲得的細胞懸液接種至120L生物反應器中(工作體積100L)，細胞培養(yǎng)體積為80L。其中，預先水化微載體，并在位清洗、滅菌所述生物反應器，所述微載體為 CytodeX3，微載體量為3g/L，所述接種細胞的終密度為5 X IO4個細胞/ml ；然后在35°C、pH 6. 5、溶氧15%的條件下，培養(yǎng)獲得微載體單層細胞，細胞密度達1 X IO6個細胞/ml ；4)病毒的接種、繁殖及收獲停止步驟幻所述大規(guī)模反應器的攪拌，使附著有細胞的微載體自然沉降，泵出上清培養(yǎng)液；
按病毒感染復數(shù)MOI為0.0001的量接種風疹病毒BRD II，即向細胞沉淀中加入含
有病毒的病毒維持液；然后在培養(yǎng)溫度30°C、pH 6. 5、溶氧15%下，連續(xù)灌注培養(yǎng)并收集上清病毒液，并按《中華人民共和國藥典》第2010年版三部所記載的病毒滴定方法測定病毒滴度平均為 6. 251gCCID50/ml。實施例2-4按照表1記載的條件，按照與實施例1相同的操作，進行了實施例2-4，得到上清病毒液。表1條件實施例2實施例3實施例4人二倍體細胞WL-38細胞系2BS細胞系KMB-17寄生病毒狂犬病毒曱型肝炎病毒脊髓灰質(zhì)炎病毒步驟1 )凍存細胞液體積(mio21.52加入細胞培養(yǎng)液體積(mL)1078離心轉(zhuǎn)速(rpm)1000900850離心時間(min)534添加細胞生長液至(ml>)302225培養(yǎng)溫度(。c)373836步驟2)方瓶-轉(zhuǎn)瓶-方瓶-轉(zhuǎn)瓶-方瓶-轉(zhuǎn)瓶-擴增放大培養(yǎng)過程1臺5L生物反應器-2臺7.5L生物反應器-1臺5L生物反應器-120L生物反應器2臺120L生物反應器1臺120L生物反應器-1臺650L生物反應器步驟3)生物反應器體積(L)65012001200培養(yǎng)體積(L)150700500細胞接種密度(個/mL)2 χ IO61 χ IO51 χ IO6微栽體CytodexlCytod ex3Cytodex3微載體用量(g/L)25515培養(yǎng)溫度(°c)393736.5pH值8.06.87.8溶氧(％)1002080步驟4)病毒接種量(MOI)1010.001培養(yǎng)溫度383731pH值8.07.07.8溶氧(％)1002080收獲病毒滴度7.91gLD50/ml8.01gTCID50/ml7.251gCCID50/ml微栽體水化條件水化使用PBS1006080體積(mL/g)水化轉(zhuǎn)速(rpm)200150180水化攪拌時間(min)534洗滌使用PBS體積(mL/g)504045洗涂轉(zhuǎn)速(rpm)200150180洗滌攪拌時間(min)534洗滌次數(shù)524實施例5本實施例用于說明更具體的本發(fā)明的生物反應器微載體培養(yǎng)人二倍體細胞生產(chǎn)病毒疫苗的方法。
1)復蘇 MRC-5 細胞(購自 ATCC)將從液氮中取出的凍存MRC-5細胞立即放入37°C水浴中解凍；將Iml的凍存細胞液加入到5ml的新鮮細胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻；在800rpm下離心5分鐘，棄上清液；向細胞沉淀中加入5ml新鮮細胞培養(yǎng)液，輕輕混勻；在800rpm下再次離心5分鐘，棄上清液；向細胞沉淀中加入5ml新鮮細胞培養(yǎng)液，輕輕混勻后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，添加細胞生長液至20ml，在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞生長平鋪瓶底；2)消化 MRC-5 細胞傾去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基，加入Iml含0. 02% EDTA胰酶消化液，在37°C下消化至細胞附著松動、細胞邊緣卷起且細胞間的間隔加大，倒去胰酶消化液，加入新鮮細胞培養(yǎng)液后吹打，得到細胞懸液；3)預培養(yǎng)MRC-5細胞將步驟幻獲得的細胞懸液接種至轉(zhuǎn)瓶，并向轉(zhuǎn)瓶中加入新鮮細胞培養(yǎng)液使所述接種細胞的終密度為2 X IO5個細胞/ml ；然后在38°C、pH 6. 8、轉(zhuǎn)速12rph的條件下培養(yǎng)；傾去轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)基，加入Iml的含0. 02% EDTA細胞培養(yǎng)液的胰酶消化液，在37°C 下消化至細胞附著松動、細胞邊緣卷起且細胞間的間隔加大，倒去胰酶消化液，加入新鮮細胞培養(yǎng)液后吹打，得到預培養(yǎng)的細胞懸液；4)小規(guī)模擴大培養(yǎng)MRC-5細胞將步驟幻獲得的細胞接種至容積為5L的小規(guī)模生物反應器，其中，所述小規(guī)模生物反應器預先加入工作體積30%即3L的滅菌的新鮮細胞培養(yǎng)液以及8g/L的微載體，所述接種細胞的終密度為IX IO5個細胞/ml ；然后在36°C、pH 7. 0、溶氧30%、濕度90%、攪拌轉(zhuǎn)速20rpm的條件下培養(yǎng)；5)制備經(jīng)小規(guī)模擴大培養(yǎng)的MRC-5細胞懸液停止步驟4)所述小規(guī)模生物反應器的攪拌，使附著有細胞的微載體自然沉降，泵出上清培養(yǎng)液，用pH7. 6的含有0. 02% (w/v)EDTA的無Ca2+，Mg2+離子的PBS洗滌3遍，所述EDTA-PBS溶液總使用量為一個所述小規(guī)模生物反應器的容積；然后加入恰可覆蓋微載體的含0. 25%胰酶和0. 02% EDTA、以細胞培養(yǎng)液為溶劑的胰酶消化液，在溫度35°C、pH7. 0并且轉(zhuǎn)速20rpm下，消化IOmin ；消化后通過加入消化時工作體積的1倍的細胞培養(yǎng)液終止胰酶的消化作用，即得到微載體與細胞分離開來的混合液；然后通過孔徑大于MRC-5細胞小于微載體的對于動物細胞無毒性的篩網(wǎng)無菌過濾，得到細胞懸液；6)大規(guī)模擴大培養(yǎng)MRC-5細胞將步驟4)獲得的細胞懸液接種至120L的生物反應器(工作體積100L)，其中，所述大規(guī)模反應器預先加入工作體積30%即30L的滅菌的新鮮細胞培養(yǎng)液以及3g/L的微載體，所述接種細胞的終密度為2 X IO5個細胞/ml ；然后在36°C、pH 7. 0、溶氧30 %、濕度 90 %、攪拌轉(zhuǎn)速40rpm的條件下，培養(yǎng)2天，得到微載體單層細胞，細胞密度達2 X IO6個細胞/ml ；
7)病毒的接種、繁殖及收獲停止步驟6)所述大規(guī)模反應器的攪拌，使附著有細胞的微載體自然沉降，泵出上
清培養(yǎng)液；按病毒感染復數(shù)MOI為0.01的量接種風疹病毒BRD II，即向細胞沉淀中加入含有病毒的病毒維持液；然后在培養(yǎng)溫度36 °C、pH :7. 2、溶氧30%、濕度90%條件下培養(yǎng)；密閉、無菌收集上清病毒液；8)病毒液的保存收獲的病毒液檢測計數(shù)，置_15°C保存。按《中華人民共和國藥典》第2010年版三部所記載的病毒滴定方法測定病毒滴度平均為6. 751gCCID50/mL·在上述步驟1 8之前，提前按照以下操作水化微載體以及對承載水化微載體的生物反應器滅菌的步驟將微載體與50mL/g的量的無Ca2+和Mg2+的PBS液混合，在室溫下開始水化，其間每15min以IOOrpm的轉(zhuǎn)速攪拌2分鐘，水化過夜后，停止攪拌，自然沉降，棄去上清，完成預處理；加入30mL/g的量的新鮮無Ca2+和Mg2+的PBS液，然后每15min以IOOrpm的轉(zhuǎn)速攪拌2分鐘，30min后停止攪拌，自然沉降，棄去上清液，完成洗滌；重復所述洗滌3次，棄去用于洗滌的上清液PBS;加入30mL/g的量的新鮮無Ca2+和Mg2+的PBS液，得到水化的微載體；然后將水化微載體置于反應器罐體；連接反應器各個管路，121°C高壓濕熱滅菌 30min ；無菌排出無Ca2+和Mg2+的PBS液，加入無菌的新鮮細胞培養(yǎng)液，對滅菌后的水化微載體潤洗一次，排出潤洗液，再加入培養(yǎng)體積的無菌的新鮮細胞培養(yǎng)液。其中，步驟4)和步驟6)所述微載體為CytodeX3。優(yōu)選地，所述步驟4)以流加或灌注方式(補充流加或灌注的條件)培養(yǎng)他后，開始連續(xù)灌注培養(yǎng)，每天的灌注速率為0. 5個培養(yǎng)體積的新鮮細胞培養(yǎng)基，隨著細胞密度的提高，逐步提高灌注速率達每天1個培養(yǎng)體積，直到生物反應器中的活細胞密度達到2 X IO6個細胞/ml。實施例6-8按照實施例1的方法培養(yǎng)WI-38細胞系、2BS細胞系和KMB_17(購自ATCC)，不同的條件見下表2。表權利要求
1.一種生物反應器微載體培養(yǎng)人二倍體細胞生產(chǎn)病毒疫苗的方法，其包括以下步驟1)復蘇人二倍體細胞；2)擴增培養(yǎng)人二倍體細胞并制備細胞懸液；3)生物反應器微載體培養(yǎng)人二倍體細胞將步驟2)獲得的細胞懸液接種至生物反應器，其中，所述生物反應器預先加入滅菌的新鮮完全細胞生長培養(yǎng)液以及微載體，所述接種細胞的終密度為5X 104-2X IO6個細胞/ ml ；然后在35-39°C、pH6. 5-8. 0、溶氧15% -100%的條件下，培養(yǎng)得到微載體單層細胞，細胞密度達1 X IO6個細胞/ml以上；4)病毒的接種、繁殖及收獲。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述步驟幻中，所述接種細胞的終密度為 IXIO5-IXiO6 個細胞/ml。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中，所述步驟3)中，在36-38°C、pH6. 8-7. 8、溶氧20% -80%的條件下，培養(yǎng)得到微載體單層細胞，細胞密度達2X106個細胞/ml以上。
4.根據(jù)權利要求1 3中任一項所述的方法，其中，步驟4)中所述病毒的接種、繁殖及收獲的步驟如下進行將經(jīng)步驟幻得到的細胞培養(yǎng)液更換為病毒維持液，按病毒感染復數(shù)MOI為0. 0001-10 的量接種病毒，在培養(yǎng)溫度30-38°C、pH6. 5-8. 0、溶氧15% -100%條件下培養(yǎng)病毒；密閉、無菌收獲病毒。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其中，按病毒感染復數(shù)MOI為0.001-1的量接種病毒， 培養(yǎng)溫度為30-37°C、pH為7. 0-7. 8、溶氧為20% -80%。
6.根據(jù)權利要求1 5中任一項所述的方法，其中，步驟1)中所述復蘇人二倍體細胞的步驟如下進行將從液氮中取出的凍存人二倍體細胞立即放入37°C水浴中解凍；將所得解凍的凍存細胞液加入到新鮮完全細胞生長培養(yǎng)液中，輕輕混勻；在800-IOOOrpm下重復離心2次，每次2_5分鐘，棄上清液；向細胞沉淀中加入新鮮完全細胞生長培養(yǎng)液，輕輕混勻后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，添加細胞生長液，在36-38°C下培養(yǎng)至細胞生長平鋪瓶底。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中，步驟1)中所述復蘇人二倍體細胞的步驟如下進行將從液氮中取出的凍存人二倍體細胞立即放入37°C水浴中解凍；將1-2體積的凍存細胞液加入到5-10體積的新鮮完全細胞生長培養(yǎng)液中，輕輕混勻；在800-IOOOrpm下重復離心2次，每次2_5分鐘，棄上清液；向細胞沉淀中加入5-10體積新鮮完全細胞生長培養(yǎng)液，輕輕混勻后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，添加細胞生長液至20-30體積，在36-38°C下培養(yǎng)至細胞生長平鋪瓶底。
8.根據(jù)權利要求1 7中任一項所述的方法，其中，步驟幻中所述擴增培養(yǎng)并制備細胞懸液時所使用的容器為方瓶、滾瓶、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶、細胞工廠或生物反應器。
9.根據(jù)權利要求1 8中任一項所述的方法，步驟幻中所述擴增培養(yǎng)中細胞傳代比例為 1 2-1 4。
10.根據(jù)權利要求1 9中任一項所述的方法，其中，所述微載體為Cytodex系列微載體、Cytopore系列微載體、Cytoline系列微載體和/或FibraCel Disks微載體。
11.根據(jù)權利要求1 10中任一項所述的方法，其中，所述微載體為Cytodexl和/或 Cytodex3，微載體的量為3_25g/L。
12.根據(jù)權利要求1 11中任一項所述的方法，其中，所述步驟幻以流加或灌注方式小規(guī)模擴大培養(yǎng)人二倍體細胞。
13.根據(jù)權利要求1 12中任一項所述的方法，其中，所述步驟4)以流加或灌注方式培養(yǎng)接種病毒后的人二倍體細胞。
14.根據(jù)權利要求1 13中任一項所述的方法，其中，所述方法還包括提前按照以下操作水化微載體以及對承載水化微載體的生物反應器滅菌的步驟將微載體與50-100mL/g的量的無Ca2+和Mg2+的PBS液混合，在室溫下開始水化，其間每15min以50-200rpm的轉(zhuǎn)速攪拌2_5分鐘，水化4h或過夜后，停止攪拌，自然沉降，棄去上清，完成預處理；加入30-50mL/g的量的新鮮無Ca2+和Mg2+的PBS液，然后每15min以50_200rpm的轉(zhuǎn)速攪拌2-5分鐘，30min后停止攪拌，自然沉降，棄去上清液，完成洗滌；重復所述洗滌1_5 次，棄去用于洗滌的上清液PBS ；加入30-50mL/g的量的新鮮無Ca2+和Mg2+的PBS液，得到水化的微載體；然后將水化微載體置于反應器罐體；連接反應器各個管路，121°C高壓濕熱滅菌 30min ；無菌排出無Ca2+和Mg2+的PBS液，加入無菌的新鮮完全細胞生長培養(yǎng)液，對滅菌后的水化微載體潤洗一次，排出潤洗液，再加入培養(yǎng)體積的無菌的新鮮完全細胞生長培養(yǎng)液。
15.根據(jù)權利要求1-14中任一項所述的方法，其中，所述人二倍體細胞選自由MRC-5細胞系、WI-38細胞系、2BS細胞系和KMB-17細胞所組成的組中；所述病毒選自由風疹病毒、麻疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、輪狀病毒、甲型肝炎病毒、水痘帶狀皰疹病毒、狂犬病病毒和乙型腦炎病毒所組成的組中。
全文摘要
本發(fā)明提供一種生物反應器微載體培養(yǎng)人二倍體細胞生產(chǎn)病毒疫苗的方法。該方法包括以下步驟復蘇人二倍體細胞；擴增培養(yǎng)人二倍體細胞并制備細胞懸液；將獲得的細胞懸液接種至生物反應器，生物反應器預先加入滅菌的新鮮完全細胞生長培養(yǎng)液及微載體，接種細胞終密度為5×104-2×106個細胞/ml，然后在35-39℃、pH6.5-8.0、溶氧15％-100％條件下，培養(yǎng)得到微載體單層細胞，細胞密度達1×106個細胞/ml以上；接種、繁殖及收獲病毒。通過本發(fā)明方法，不僅使得采用生物反應器培養(yǎng)人二倍體細胞大規(guī)模生產(chǎn)病毒疫苗成為可能，并且生產(chǎn)的病毒疫苗產(chǎn)量高、一致性好，可以高效實現(xiàn)病毒疫苗的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N5/071GK102559617SQ20101059579
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月20日 優(yōu)先權日2010年12月20日
發(fā)明者張韌, 王建超, 陳文慶 申請人:北京清大天一科技有限公司