專利名稱：Dna保存溶劑及其保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA(deoxyribonucleic acid，脫氧核糖核酸)的保存，特別是涉及一種DNA保存溶劑及其保存方法。
背景技術(shù)：
DNA是染色體的重要組成充分，是真核生物的遺傳基本物質(zhì)，含有物種個(gè)體的遺傳信息，可用于構(gòu)建基因組文庫、分離所需的基因和檢測相關(guān)的分子標(biāo)記等。由于DNA所含的遺傳信息量大，并且容易獲取，具有極其穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，是目前種質(zhì)資源和遺傳資源收集和保存的主要內(nèi)容之一。DNA分子的序列結(jié)構(gòu)具有三個(gè)重要特性(1)不同個(gè)體序列不一樣；(2)終生不變；同一人體各不同部位細(xì)胞中的DNA序列相同。因此DNA分子本身具備檔案的特性，即具有長期穩(wěn)定性、信息屬性、個(gè)體特異性和可以備查的屬性。實(shí)際上，在疾病基因組學(xué)、藥物基因組學(xué)、群體遺傳學(xué)和進(jìn)化等研究領(lǐng)域，DNA是最可靠的證據(jù)和研究過程的基本材料，被廣泛應(yīng)用。同時(shí)生命科學(xué)研究者日益認(rèn)識(shí)到保存DNA 對于今后系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展的重要性，各國紛紛開始保存DNA。世界上最早開始實(shí)施大規(guī)模DNA保存的是冰島的Decode公司，全部DNA樣本極其相關(guān)資料來自于將近1/3的冰島成年人和90%以上的冰島老年人。利用其建立的生物樣本庫，Decode找到了心肌梗塞等20 多種疾病的致病基因。隨后英國、美國、以色列等國家研究單位建立了類似的遺傳資源樣本庫，并且以色列對外銷售這些資料齊全的人DNA樣本。為了維持DNA結(jié)構(gòu)的完整性，避免DNA大規(guī)模斷裂和降解，DNA最佳保存方法是干粉_80°C或者液氮低溫保存，但要制成干粉則需要大量的DNA，取材困難，在實(shí)際DNA樣本資源收集中不具有操作性。而用無水乙醇保存DNA，雖然可以事先分裝保存，但也存在反復(fù)凍融問題。而固相DNA保存技術(shù)是最近提出的新概念，適用于永久保存，并且這種方法的保存基質(zhì)是否影響DNA后續(xù)實(shí)驗(yàn)、保存具體效果，目前無這方面的任何數(shù)據(jù)，尚有待時(shí)間考驗(yàn)。 并且對于保存期間需要多次使用的樣本，需要重新提取DNA，操作復(fù)雜，并且容易導(dǎo)致DNA 斷裂，將導(dǎo)致一些對DNA質(zhì)量要求高的檢測實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種DNA保存溶劑及其保存方法。利用該DNA保存溶劑，可以很簡單地、長期保存DNA，并且DNA提取方便、避免DNA的反復(fù)凍融、成本低廉， 為今后基因組學(xué)研究、身份鑒別、基因診斷、基因治療、器官移植等提供最原始的DNA記錄。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的DNA保存溶劑，其組分包括甘油、TE緩沖液 (Tris-EDTA, EDTA 乙二胺四乙酸)、1_羧基-N，N，N-三甲基乙內(nèi)酯，其中，甘油的終體積為 25% 80% ；TE緩沖液的終濃度為IXTE 5XTE，pH值為6 8，優(yōu)選1XTE，pH值7. 6 ； 1-羧基-N，N，N-三甲基乙內(nèi)酯的終濃度為1 6mol/L，優(yōu)選3mol/L。上述甘油和1-羧基-N，N，N-三甲基乙內(nèi)酯作用主要是維持液態(tài)環(huán)境。
另外，本發(fā)明的DNA保存方法，包括步驟(1)提取 DNA;其中，該DNA可從生物的任何細(xì)胞、按照常規(guī)的提取方法進(jìn)行提取及純化；(2)將DNA溶于如上所述的DNA保存溶劑中進(jìn)行保存。其中，DNA保存的最終濃度可以為1 lOyg/L，如eyg/L左右，優(yōu)選2 3yg/ L。如DNA保存濃度很低，如直接大用量實(shí)驗(yàn)，保存溶劑中高濃度的甘油有可能影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，而高保存濃度的DNA在實(shí)際應(yīng)用中需要進(jìn)一步稀釋后才能實(shí)驗(yàn)，不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。所述保存溫度可以為-20°C _196°C。與傳統(tǒng)的DNA保存技術(shù)相比較，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)制作簡單、成本低廉，只需要低溫冰凍保存即可；(2)由于含有高濃度的甘油，使得DNA—直處于液態(tài)環(huán)境中，避免機(jī)械切割力損害，從而能有效地防止DNA降解，因此，DNA保存效果好、保存期長。(3)由于DNA保存于液態(tài)環(huán)境中，從冰箱或液氮中拿出來后，不需溶解，就可直接取樣或分裝，從而避免了反復(fù)凍融。因此，本發(fā)明能長期保存DNAjB 20年以上。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中的甘油、TE中的組分(^^8堿、!1(^014)、1-羧基-隊(duì)隊(duì)^三甲基乙內(nèi)酯都是市售產(chǎn)品。


附圖是實(shí)施例3的基因組DNA電泳圖，其中，孔1為DNA分子標(biāo)記，孔2為實(shí)施例 3中按照實(shí)施例1保存的DNA，孔3為實(shí)施例3中按照實(shí)施例2保存的DNA。實(shí)施例1一、樣本DNA的提取采用FlexiGene DNA Kit(QIAGEN, Cat. No. 51206)試劑盒抽提肺癌患者外周血中的基因組DNA。具體步驟如下向300 μ 1血液樣本中加入750 μ 1 Buffer TOl，上下顛倒5次使其混勻。接著在 12，OOOrpm轉(zhuǎn)速下離心Imin0離心后倒掉上層清液，再加入150 μ 1 Buffer FG2及1· 5μ 1 蛋白酶溶液，立即振蕩，直至沉淀完全溶解。接下來離心3 k，然后65°C水浴5min。當(dāng)溶液從紅色變?yōu)殚蠙炀G色后，加入150μ 1 100%異丙醇，上下充分顛倒離心管，使其混合，直至DNA析出，呈肉眼可見的線狀或塊狀。然后在12，OOOrpm轉(zhuǎn)速下離心;3min。離心后倒掉上層清液，再加入150 μ 1 70%乙醇，并振蕩k。接著重新在12，OOOrpm轉(zhuǎn)速下離心;3min， 離心后倒掉上層清液，自然風(fēng)干沉淀，直至所有的液體都蒸發(fā)掉。二、保存向上述含有DNA的離心管中加入500 μ 1的DNA冰凍保存溶劑(即保存溶劑溫度為0°C )后，37°C過夜，保證DNA充分溶解，然后于-80°c冰箱保存。其中，DNA冰凍保存溶劑的組成為終體積為35 %的甘油、終濃度為 IXTE(pH7. 6)、終濃度為3mol/L的1_羧基—N，N, N-三甲基乙內(nèi)酯。
實(shí)施例2采用實(shí)施例1中的DNA抽提方法，抽取實(shí)施例1的肺癌患者外周血300 μ 1進(jìn)行 DNA抽提，然后向含有該DNA的離心管中加入500 μ 1的1ΧΤΕ(ρΗ7. 6)，37°C過夜，保證充分溶解后，于-80°C冰箱保存。實(shí)施例3實(shí)施例1和實(shí)施例2中的DNA保存1個(gè)月后，每個(gè)工作日的10點(diǎn)和16點(diǎn)將實(shí)施例1和實(shí)施例2保存的DNA取出，置于37°C溫箱15分鐘，使實(shí)施例1和實(shí)施例2中的DNA 充分溶解后，然后-80度保存，連續(xù)反復(fù)凍融6月，進(jìn)行加速實(shí)驗(yàn)。各取反復(fù)凍融3個(gè)月后，取按照實(shí)施例1和實(shí)施例2保存的DNA 6μ 1，用0. 8% (0. 8g/100ml)瓊脂糖進(jìn)行電泳鑒定，電泳結(jié)果如說明書附圖所示。從電泳圖中看出，實(shí)施例 1保存的DNA經(jīng)過連續(xù)3個(gè)月反復(fù)凍融后，孔2電泳結(jié)果顯示基因組DNA未降解；而實(shí)施例 2保存的DNA經(jīng)過連續(xù)3個(gè)月反復(fù)凍融后，孔3電泳結(jié)果顯示基因組DNA —片彌散，降解明顯。實(shí)施例4采用實(shí)施例1中的DNA抽提方法，將得到的小鼠肝臟DNA中加入DNA冰凍保存溶劑，使DNA的最終濃度為2 μ g/L，37°C過夜，保證DNA充分溶解，然后于_20°C冰箱保存。其中，DNA冰凍保存溶劑的組成為終體積為25%的甘油、終濃度為1ΧΤΕ(ρΗ6)、 終濃度為6mol/L的1-羧基-N，N，N-三甲基乙內(nèi)酯。本實(shí)施例中所保存的DNA分子結(jié)構(gòu)無破壞，能滿足下游實(shí)驗(yàn)(如PCR、基因芯片等)需要。實(shí)施例5采用實(shí)施例1中的DNA抽提方法，將得到的培養(yǎng)皿細(xì)胞DNA中加入DNA冰凍保存溶齊U，使DNA的最終濃度為3 μ g/L，37°C過夜，保證DNA充分溶解，然后于_196°C保存。其中，DNA冰凍保存溶劑的組成為終體積為80%的甘油、終濃度為5XTE(pH8)、 終濃度為lmol/L的1-羧基-N，N, N-三甲基乙內(nèi)酯。本實(shí)施例中所保存的DNA分子結(jié)構(gòu)無破壞，能滿足下游實(shí)驗(yàn)(如PCR、基因芯片等)需要。實(shí)施例6采用實(shí)施例1中的DNA抽提方法，將得到的人肝臟DNA中加入DNA冰凍保存溶劑， 使DNA的最終濃度為10 μ g/L, 37°C過夜，保證DNA充分溶解，然后于_120°C保存。其中，DNA冰凍保存溶劑的組成為終體積為60 %的甘油、終濃度為 2XTE(pH7. 5)、終濃度為5mol/L的1_羧基-N，N, N-三甲基乙內(nèi)酯。本實(shí)施例中所保存的DNA分子結(jié)構(gòu)無破壞，完全能滿足下游實(shí)驗(yàn)(如PCR、基因芯片等)需要。
權(quán)利要求
1.一種DNA保存溶劑，其特征在于該DNA保存溶劑的組分包括甘油、TE緩沖液、 1-羧基-N，N，N-三甲基乙內(nèi)酯，其中，甘油的終體積為25% 80%，TE緩沖液的終濃度為 IXTE 5XTE，1-羧基-N，N，N-三甲基乙內(nèi)酯的終濃度為1 6mol/L。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA保存溶劑，其特征在于所述TE緩沖液的終濃度為IXTE， PH值為6 8。
3.如權(quán)利要求2所述的DNA保存溶劑，其特征在于所述TE緩沖液的pH值為7.6。
4.如權(quán)利要求1所述的DNA保存溶劑，其特征在于所述1-羧基-N，N，N-三甲基乙內(nèi)酯的終濃度為3mol/L。
5.如權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的DNA保存方法，包括步驟(1)提取DNA ；(2)將DNA溶于如權(quán)利要求1所述的DNA保存溶劑中進(jìn)行保存。
6.如權(quán)利要求5所述的DNA保存方法，其特征在于所述保存溫度為_20°C -196°C。
7.如權(quán)利要求5所述的DNA保存方法，其特征在于所述DNA保存的最終濃度為1 10μ g/L。
8.如權(quán)利要求7所述的DNA保存方法，其特征在于所述DNA保存的最終濃度為2 3 μ g/L ο
全文摘要
本發(fā)明公開了一種DNA保存溶劑及其保存方法，該DNA保存溶劑的組分包括甘油、TE緩沖液、1-羧基-N，N，N-三甲基乙內(nèi)酯，其中，甘油的終體積為25％～80％，TE緩沖液的終濃度為1×TE～5×TE，1-羧基-N，N，N-三甲基乙內(nèi)酯的終濃度為1～6mol/L。該DNA保存方法，包括步驟(1)提取DNA；(2)將DNA溶于DNA保存溶劑中進(jìn)行保存。本發(fā)明制作簡單、成本低廉，而且保存效果好、保存期長，并避免反復(fù)凍融。為今后基因組學(xué)研究、身份鑒別、基因診斷、基因治療、器官移植等提供最原始的DNA記錄。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102559654SQ20101059505
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月17日
發(fā)明者連臻 申請人:上海元基融生物科技有限公司