專利名稱：一株具有較強抑菌作用的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株具有較強抑菌作用的枯草芽孢桿菌及其作為飼料添加劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前因濫用抗生素導(dǎo)致的畜禽產(chǎn)品藥物殘留超標(biāo)、耐藥致病菌株的大量增加等問 題已引起人們的高度重視。從2006年1月1日起，歐盟全面禁止飼料中使用抗生素促生長 飼料添加劑。最后四種允許做為促生長用途的抗生素飼料添加劑——黃霉素、效霉素、鹽霉 素和莫能霉素也停止使用。面對競爭日益激烈的國際市場，抗生素等殘留問題一直是限制 我國畜產(chǎn)品出口的瓶頸。所以，尋找飼用抗生素替代品迫在眉睫?？股厥悄承┪⑸锿ㄟ^酶促反應(yīng)將初級代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)性的次生代謝產(chǎn) 物，諸如短桿菌肽等通過酶促反應(yīng)把氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物。而Msin (乳酸鏈球 菌素)等細(xì)菌素則需要通過核糖體來合成，從而是真正的蛋白類物質(zhì)。細(xì)菌素與抗生素的 根本差別是大部分細(xì)菌素只對近緣關(guān)系的細(xì)菌有損害作用，且具有無毒、無副作用、無殘 留、無耐藥性，同時也不污染環(huán)境等優(yōu)點。因此，高效安全的飼料添加劑——細(xì)菌素的使用 可以在部分情況下減少甚至取代抗生素的使用。使用微生態(tài)制劑解決飼用抗生素問題，已經(jīng)從機理上得到證明有益微生物在其 生長代謝過程中，會產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，主要包括芽孢桿菌類產(chǎn)生的抗菌肽、乳酸菌類生成 的細(xì)菌素等。有益菌通過這些物質(zhì)一方面抑制如大腸桿菌、沙門氏菌等的生長，另一方面為 自身的活化、定植提供有利條件。目前，飼料添加劑中，使用的芽孢桿菌有枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢 桿菌、東洋芽孢桿菌等，芽孢桿菌具有以下優(yōu)點和特點①具有耐高溫、耐酸堿、耐壓等特 點，能夠耐受顆粒飼料加工的影響；②在貯藏過程中以孢子形式存在，不消耗飼料的營養(yǎng)成 分，可以保證飼料的質(zhì)量；③進(jìn)入腸道后，在腸道迅速復(fù)活，復(fù)活率接近100% ；④芽孢桿菌 能夠產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及多種氨基酸；⑤芽孢桿菌可以消耗大量的氧，維持腸 道厭氧環(huán)境，抑制致病菌的生長，維持腸道正常生態(tài)平衡；⑥具有平衡和穩(wěn)定乳酸桿菌的作 用。由于枯草芽孢桿菌所產(chǎn)的枯草菌素具有抑制一些革蘭氏陽性菌，不產(chǎn)生耐藥性， 無殘留，不污染環(huán)境等優(yōu)點，可以推斷，枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物若能用于飼料添加劑，替代 飼料中的飼用抗生素，必將為飼料微生物添加劑的應(yīng)用提供廣闊的前景。因此，枯草芽孢桿 菌代謝產(chǎn)物作為抗生素的替代品，其研究和開發(fā)意義重大，市場前景廣闊。目前，現(xiàn)有的枯草芽孢桿菌存在以下缺陷具有抑菌活性的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量不高， 抑菌能力一般，急需抑菌活性較高的枯草芽孢桿菌菌種。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明旨在篩選抑菌活性高的枯草芽孢桿菌菌株，并對其代 謝產(chǎn)物活性最高的發(fā)酵工藝條件、抑菌譜進(jìn)行研究，并試驗其在動物上的應(yīng)用效果，為今后的工業(yè)化開發(fā)奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一株具有較強抑菌作用的枯草芽孢桿菌，該菌株命名為Bacillus subtilis B7348，已于2010年10月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC M 2010260。所述枯草芽孢桿菌的菌種生物學(xué)特性如下該菌種的細(xì)胞大小為通常為 (0. 7 μ m 0. 8 μ m) X O. 0 μ m 3. 0 μ m)，桿狀，很少成鏈，染色均勻，無莢膜，鞭毛側(cè)生，能 運動；芽孢呈橢圓形或柱狀，中生或偏生，大小為0.8 μ mX (1.5μπι 1.8μπι)；游離孢子表 面著色弱；培養(yǎng)基上的菌落圓或者不規(guī)則形，表面色暗，變厚和不透明，可起皺，可呈奶油色 或褐色；革蘭氏陽性，接觸酶陽性，能發(fā)生V-P反應(yīng)；能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露 醇產(chǎn)酸，能水解淀粉，分解色氨酸形成吲哚；生長溫度最高值45 55°C，最低值5 20°C， 最適溫度為37°C。所述枯草芽孢桿菌，通過SDSS-PCR鑒定，其代謝產(chǎn)物中主要抑菌物質(zhì)為分子量在 7000 8000d的小分子物質(zhì)。所述枯草芽孢桿菌經(jīng)過安全性試驗和效率性試驗，結(jié)果表明枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilisB7348, CCTCC M 2010260 可以做為飼料添加劑。所述枯草芽孢桿菌做為飼料添加劑應(yīng)用時，以菌粉的形式添加到飼料中，所述菌 粉是通過以下步驟得到的⑴菌種選用枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis B7348, CCTCC M 2010260 ；(ii)斜面培養(yǎng)將凍干粉菌種接種于固體斜面培養(yǎng)基上，在32 40°C培養(yǎng)20 28h ；(iii) 一級種子培養(yǎng)取培養(yǎng)好的斜面，在無菌條件下接種于50mL IOOmL種子 液體培養(yǎng)基中，在32 40°C條件下，靜置培養(yǎng)14 18h，制得一級種子液；(iv)擴大培養(yǎng)以5%的接種量，將一級種子液接于500mL IOOOmL種子液體培 養(yǎng)基中，在32 40°C條件下，靜置培養(yǎng)10 16h，制得二級種子液；(ν)發(fā)酵罐培養(yǎng)以5%的接種量，將二級種子液接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于32 40°C條件下，靜置培養(yǎng)16 Mh ；(vi)收集發(fā)酵產(chǎn)物待步驟(ν)之發(fā)酵液黏度達(dá)12000 15000cP時，收集發(fā)酵 液；(vii)發(fā)酵結(jié)束后，立即將發(fā)酵液離心并用清水清洗，如此反復(fù)2 3遍后冷凍干 燥，粉碎，即為菌粉成品；或發(fā)酵結(jié)束后，立即噴霧干燥，即得菌粉成品；上述步驟(iii)、(iv)中所述種子液體培養(yǎng)基配方為葡萄糖20g/L、蛋白胨IOg/ L、酵母膏5g/L，使用時，調(diào)節(jié)pH至6. 5 7. 5，115°C條件下滅菌20min ；步驟(ii)中所述 固體斜面培養(yǎng)基為上述種子液體培養(yǎng)基中添加1. 5 2. 0%的瓊脂粉；步驟(ν)中所述液 體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L，氯化鈉5g/L，使用時，調(diào)節(jié) pH 至 6. 5 7. 5。鑒于枯草芽孢桿菌B7348對革蘭氏陽性菌抑制效果較好，而植物乳桿菌LP-Il (該 菌株命名為Lactobacillus plantarum，已于2010年06月21日保藏于中國典型培養(yǎng)物 保藏中心，其保藏編號為CCTCC M 2010150，記載在中國專利申請CN201010M0725.X中)
5對革蘭氏陰性菌抑制效果明顯，同時，兩者的代謝產(chǎn)物具有較強的抑菌作用，兩菌種間有著 很好的互補關(guān)系，聯(lián)合使用效果更佳。綜合考慮兩株菌不同的抑菌效果，將枯草芽孢桿菌 B7348和植物乳桿菌LP-Il及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行復(fù)配(其中枯草芽孢桿菌B7348菌粉活菌數(shù) 為2.0X108cfu/g，乳酸菌菌粉活菌數(shù)為1.0X108cfU/g)，進(jìn)行合理搭配，形成產(chǎn)品肽菌素， 以滿足不同動物、不同養(yǎng)殖階段的需求。所述的肽菌素的使用劑量如下對正常不患病的種禽，用量為飼料總質(zhì)量的 0. 2% ；對患病的種禽，用量為飼料總質(zhì)量的0. 4% ；對妊娠母豬，用量為飼料總質(zhì)量的0. 1 0. 2% ；對哺乳母豬，用量為飼料總質(zhì)量的0. 3 0. 4% ；對患有乳房炎的奶牛，用量為80 120g/頭/天，可以先用120g/頭/天，半個月，再用80g/頭/天，半個月，使體細(xì)胞(一般 以每毫升牛奶中含20萬個細(xì)胞為亞臨床乳房炎的臨界值，超過該值為陽性，低于該值則正 常)逐漸控制在20萬個以下；對患有陰性乳房炎的奶牛，用量為40g/頭/天，長期使用即 可，1個月后體細(xì)胞逐漸被控制在20萬個以下。


本發(fā)明提供的具有較強抑菌作用的枯草芽孢桿菌命名為Bacillus subtilis B7348，已于2010年10月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC M 2010260。圖1為枯草芽孢桿菌B7348和枯草芽孢桿菌Nxc6對不同指示菌的抑菌效果圖，其 中，A為B7348對雞大腸桿菌078的抑菌效果圖，B為B7348對金黃色葡萄球菌的抑菌效果 圖，C為B7348對豬大腸桿菌2116的抑菌效果圖，D為Nxc6對雞白痢沙門氏菌C79-13的抑 菌效果圖。圖2為枯草芽孢桿菌B7348 SDS-PAGE分析。圖3為安全性試驗增重率數(shù)據(jù)圖。圖4為試驗各組肉雞的飼料轉(zhuǎn)化率。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實施例1產(chǎn)抑菌物質(zhì)芽孢桿菌的篩選一、芽孢桿菌初篩芽孢桿菌在動物體內(nèi)定殖能產(chǎn)生大量淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和植酸酶等。這些 酶在動物腸道內(nèi)，有助于直接分解、消化飼料營養(yǎng)成分，降解植物性飼料中的非淀粉多糖， 改善消化道食糜的物理特性或消除日糧中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，促進(jìn)動物的生長和生產(chǎn)。另外，芽 孢桿菌產(chǎn)生了大量的代謝產(chǎn)物，也包括細(xì)菌素，例如枯草菌素(subtilin)等。細(xì)菌素具有 直接的抑菌活性，通過與其它代謝產(chǎn)物如乙酸、丙酸、丁酸等共同作用，可有效抑制病原菌 生長，提高動物的免疫水平，最終提高了飼料的轉(zhuǎn)化率。1.材料與方法1. 1試驗菌株枯草芽孢桿菌N9、枯草芽孢桿菌N9-1-35、地衣芽孢桿菌S、冷水菌 1#、納豆芽孢桿菌1#、短小芽孢桿菌BT123、納豆芽孢桿菌4#、蠟樣芽孢桿菌等。1. 11發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件葡萄糖1.5%，黃豆餅粉3.0%，蛋白胨0.2%，NaCl0.1%, (NH4)2SO4 0. 5%, CaCO3 0. 6%, MgSO4 0. 6%, pH 7. 2 7. 5，37°C液態(tài)培養(yǎng) 48h。1. 1. 2試驗菌株前處理將斜面菌種接種到裝有IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶 中，37°C恒溫振蕩(ISOrpm)培養(yǎng)至芽孢率10%以上，5000rpm離心分離菌體和上清液，取上 清液備用。1. 2指示菌豬大腸桿菌1565、藤黃八疊球菌、金黃色葡萄球菌。培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件葡萄糖0.2%，蛋白胨1.0%，NaCl 0. 5%，牛肉膏0. 5%，pH 7. 0，37°C液態(tài)培養(yǎng)24h。以上培養(yǎng)所得指示菌試驗前均稀釋100倍，OD值0. 2 0. 3之間。1. 3體外抑菌試驗-管碟法雙碟的制備取直徑90mm的培養(yǎng)皿，注入滅菌的營養(yǎng)瓊脂(1. 5% ) 15mL，水平放置 使之凝固，作為底層，另取指示菌培養(yǎng)基(濃度為0.8%，冷至50°C左右)與指示菌菌液適 量混勻，取6mL鋪在底層培養(yǎng)基上，水平放置使之凝固，作為菌層。加樣品用無菌鑷子夾取已滅菌的牛津杯，打開皿蓋，放在培養(yǎng)基上。在牛津杯中 加滿相同量的抗菌液(300 μ L)，每個樣品三個重復(fù)。將加完樣的培養(yǎng)皿小心放入37°C恒溫 箱內(nèi)，培養(yǎng)1 后取出測量抑菌圈直徑。
1. 4主要儀器設(shè)備
XSS-600顯微鏡
山東光電儀器廠
500型恒溫培養(yǎng)箱 JHT型凈化作臺 LD5-2A型離心機 PHS-3C型精密pH計 BC-163K型冰箱 GUJS-7A型實驗發(fā)酵罐 TCYQ型恒溫振蕩器 LD4-40型離心機 FAl 004型電子天平
山東濰坊醫(yī)療器械廠 濟南空氣凈化消毒設(shè)備廠 北京醫(yī)用離心機廠 上海精密科學(xué)儀器有限公司 青島海爾電冰箱有限公司 鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備公司 太倉市實驗設(shè)備廠 北京醫(yī)用離心機廠 上海天平儀器廠
權(quán)利要求
1.一株具有較強抑菌作用的枯草芽孢桿菌，其特征在于該菌株命名為Bacillus subtilisB7348，已于2010年10月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為 CCTCCM 2010260。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有較強抑菌作用的枯草芽孢桿菌，其特征在于所 述枯草芽孢桿菌的菌種生物學(xué)特性如下該菌種的細(xì)胞大小為通常為(0.7μπι 0. 8 μ m) X O. 0 μ m 3. 0 μ m)，桿狀，很少成鏈，染色均勻，無莢膜，鞭毛側(cè)生，能運動；芽孢 呈橢圓形或柱狀，中生或偏生，大小為0. 8 μ mX (1. 5 μ m 1. 8 μ m)；游離孢子表面著色弱； 培養(yǎng)基上的菌落圓或者不規(guī)則形，表面色暗，變厚和不透明，可起皺，可呈奶油色或褐色；革 蘭氏陽性，接觸酶陽性，能發(fā)生V-P反應(yīng)；能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇產(chǎn)酸，能 水解淀粉，分解色氨酸形成吲哚；生長溫度最高值45 55°C，最低值5 20°C，最適溫度為 37 °C。
3.權(quán)利要求1所述的具有較強抑菌作用的枯草芽孢桿菌作為飼料添加劑的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用時，以菌粉的形式添加到飼料中，所 述菌粉是通過以下步驟得到的⑴菌種選用枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis B7348, CCTCC M 2010260 ；( )斜面培養(yǎng)將凍干粉菌種接種于固體斜面培養(yǎng)基上，在32 40°C培養(yǎng)20 ^h ；(iii)一級種子培養(yǎng)取培養(yǎng)好的斜面，在無菌條件下接種于50mL IOOmL種子液體 培養(yǎng)基中，在32 40°C條件下，靜置培養(yǎng)14 18h，制得一級種子液；(iv)擴大培養(yǎng)以5%的接種量，將一級種子液接于500mL IOOOmL種子液體培養(yǎng)基 中，在32 40°C條件下，靜置培養(yǎng)10 16h，制得二級種子液；(ν)發(fā)酵罐培養(yǎng)以5%的接種量，將二級種子液接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于32 40°C 條件下，靜置培養(yǎng)16 Mh;(vi)收集發(fā)酵產(chǎn)物待步驟(ν)之發(fā)酵液黏度達(dá)12000 15000cP時，收集發(fā)酵液；(vii)發(fā)酵結(jié)束后，立即將發(fā)酵液離心并用清水清洗，如此反復(fù)2 3遍后冷凍干燥，粉 碎，即為菌粉成品；或發(fā)酵結(jié)束后，立即噴霧干燥，即得菌粉成品；上述步驟(iii)、(iv)中所述種子液體培養(yǎng)基配方為葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L，酵 母膏5g/L，使用時，調(diào)節(jié)pH至6. 5 7. 5，115°C條件下滅菌20min ；步驟(ii)中所述固體 斜面培養(yǎng)基為上述種子液體培養(yǎng)基中添加1. 5 2. 0%的瓊脂粉；步驟(ν)中所述液體發(fā) 酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化鈉5g/L，使用時，調(diào)節(jié)pH 至 6. 5 7. 5。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用時，添加植物乳桿菌LP-11，組成產(chǎn) 品肽菌素，作為飼料添加劑加入到飼料中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述肽菌素中，枯草芽孢桿菌B7348菌粉 的活菌數(shù)為2. OX 108cfu/g，植物乳桿菌LP-Il菌粉的活菌數(shù)為1. OX 108cfu/g。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述肽菌素作為飼料添加劑的用量如下對正常不患病的種禽，用量為飼料總質(zhì)量的0. 2% ；對患病的種禽，用量為飼料總質(zhì)量的0. 4% ；對妊娠母豬，用量為飼料總質(zhì)量的0. 1 0. 2% ；對哺乳母豬，用量為飼料總質(zhì)量的0. 3 0. 4% ； 對患有乳房炎的奶牛，用量為80 120g/頭/天·’ 對患有陰性乳房炎的奶牛，用量為40g/頭/天。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株具有較強抑菌作用的枯草芽孢桿菌，該菌株命名為Bacillus subtilisB7348，已于2010年10月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC M2010260。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌經(jīng)過安全性試驗和效率性試驗，結(jié)果表明可以做為飼料添加劑。應(yīng)用時，以菌粉的形式添加到飼料中，在使用時，將枯草芽孢桿菌B7348和植物乳桿菌LP-11及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行復(fù)配，進(jìn)行合理搭配，可以滿足不同動物、不同養(yǎng)殖階段的需求，非常適合現(xiàn)階段養(yǎng)殖特點和養(yǎng)殖模式。
文檔編號C12N1/20GK102120975SQ20101058907
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月15日
發(fā)明者劉虹, 單寶龍, 張志焱, 徐海燕, 楊立華, 王靜, 程秀芳, 谷巍, 陳靜 申請人:山東寶來利來生物工程股份有限公司