專利名稱：制備重組白細胞介素-1受體拮抗劑的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備重組白細胞介素-1受體拮抗劑的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
重組白細胞介素-1受體拮抗劑(簡稱IL-Ira)是一種存在于人體的蛋白質(zhì)類細 胞因子受體拮抗劑，通過結(jié)合白細胞介素-I(IL-I)受體，特異性地封閉IL-I的活性。自Arend等1990年克隆出人IL-lra的cDNA以來，各國學(xué)者都在對IL-lra進行 更為全面、深入的研究。同時，眾多制藥廠商也都在致力于IL-Ira的開發(fā)，2003年美國FDA 批準Amgen公司生產(chǎn)的重組人IL_lra(商品名Kineret)用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎。我國 SFDA 2008年批準西藏華西藥業(yè)生產(chǎn)的重組人IL-Ira用于治療眼部非感染性炎癥，雖然也 有廠家申請IL-Ira用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎，但是至今未有產(chǎn)品正式上市銷售。目前制備重組人白細胞介素-1受體拮抗劑的方法有真核表達和原核表達兩種。 真核表達產(chǎn)量低，成本高，但蛋白活性好。原核表達(大腸桿菌)表達分包涵體表達和可溶 性表達。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種用于制備重組白細胞介素-1受體拮抗劑的發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明所提供的發(fā)酵培養(yǎng)基，由以下成分組成胰蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、葡萄糖、十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸 鎂、維生素B1、丙三醇聚氧丙烯聚氧乙烯醚和水；以上成分在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中濃度分別為胰蛋白胨32g/L、酵母粉20g/L、氯化鈉0. 5g/L、葡萄糖2g/L、十二水磷酸氫二鈉 15g/L、磷酸二氫鉀3g/L、氯化鈣0. 011g/L、硫酸鎂0. 96g/L、維生素BIO. 033g/L、丙三醇聚 氧丙烯聚氧乙烯醚0. 2ml/L。本發(fā)明的另一個目的是提供制備重組白細胞介素-1受體拮抗劑的方法。本發(fā)明所提供的制備重組白細胞介素-1受體拮抗劑的方法，包括以下步驟將重 組菌接種于所述發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)，得到重組白細胞介素-1受體拮抗劑；所述重組菌為向大腸桿菌中導(dǎo)入序列表中序列1所示基因，得到的重組大腸桿 菌，所述序列中序列1所示基因通過如下重組表達載體導(dǎo)入大腸桿菌將序列中序列1所示 基因插入PET_30a載體的多克隆位點得到的重組表達載體。所述方法中，在所述發(fā)酵培養(yǎng)前，包括如下種子培養(yǎng)的步驟(1) 一級種子培養(yǎng)將重組菌接種于種子培養(yǎng)基A，在PH值為7. 2、37°C和200rpm 的條件下培養(yǎng)12小時得到一級種子液；所述種子培養(yǎng)基A由以下成分組成
胰蛋白胨、酵母粉、氯化鈉和水；以上成分在所述種子培養(yǎng)基A中濃度分別為胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化鈉10g/L ；(2) 二級種子培養(yǎng)將步驟(1)得到的一級種子液按接種量接入種子培養(yǎng)基 B，在PH值為7. 2、37°C和200rpm的條件下培養(yǎng)7_8小時得到二級種子液；所述種子培養(yǎng)基B由以下成分組成胰蛋白胨、酵母粉、氯化鈉和水；以上成分在所述種子培養(yǎng)基B中濃度分別為胰蛋白胨16g/L、酵母粉10g/L和氯化鈉5g/L。所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為37°C ；所述接種量為9% -10%，具體為9%和10% ；所述發(fā)酵培養(yǎng)中，使發(fā)酵體系的溶氧量保持在30% -50%，具體為30%、40%和 50% ；所述發(fā)酵體系的pH值為7. 0-7. 2，具體為7. 0、7. 1和7. 2 ；所述發(fā)酵體系為發(fā)酵容器內(nèi)的所有物質(zhì)。所述發(fā)酵培養(yǎng)過程中，包括如下補料的步驟在所述發(fā)酵體系的0D600達到 7. 0-9. 0時，開始向發(fā)酵體系中補加補料培養(yǎng)基；所述補加的補料培養(yǎng)基與所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1 3;所述補料培養(yǎng)基由以下成分組成酵母粉、胰蛋白胨、甘油、葡萄糖、氯化銨、硫酸鎂、維生素B1和水；以上成分在所述補料培養(yǎng)基中濃度分別為酵母粉200g/L、胰蛋白胨20g/L、甘油200ml/L、葡萄糖10g/L、氯化銨10g/L、硫酸 鎂 5g/L、維生素 B1O. lg/L。所述發(fā)酵培養(yǎng)中，包括如下誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟在發(fā)酵體系的0D_值達到35-45時，向 發(fā)酵體系中加入異丙基_ β -D硫代半乳糖苷進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，使異丙基_ β -D硫代半乳糖苷 在發(fā)酵體系中的濃度為0. lmmol/L-0. 2mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間為3h_4h ；所述大腸桿菌為大腸桿菌菌株BL21 (DE3)。本發(fā)明的制備重組白細胞介素-1受體拮抗劑的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法，適合 重組大腸桿菌的生長和目標蛋白的表達。本工藝可重復(fù)性好；菌體生長快，可大幅縮短發(fā)酵 周期；菌體產(chǎn)量高，可滿足高密度發(fā)酵需要和目標蛋白表達率高，且可溶性良好。


圖1為PET-30a-IL_lRa表達質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。圖 2 為 IL-Ira PCR 鑒定圖。圖3為pET-hlL-lra表達質(zhì)粒酶切圖譜
圖4為IL-Ira大腸桿菌表達結(jié)果。圖5為IL-Ira工程菌劃種LB瓊脂平板的結(jié)果。圖6為電鏡檢查IL-Ira工程菌的形態(tài)。圖 7 為 20100623 批發(fā)酵 SDS-PAGE 電泳。
圖8為20100205批發(fā)酵菌體生長曲線圖。圖9為質(zhì)譜分析測定IL-Ira工程菌發(fā)酵液樣品的C末端序列結(jié)果。圖10為EDMAN降解蛋白質(zhì)N-末端氨基酸的序列分析方法測定IL-Ira工程菌發(fā) 酵液樣品的N-末端氨基酸的序列。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、構(gòu)建IL-Ira工程菌 大腸桿菌表達載體PET_30a購自Novagen公司，產(chǎn)品目錄號69909_3 ；大腸桿菌JM109菌株購自Promega公司；大腸桿菌菌株BL21 (DE3)購自MERCK公司；PHA刺激的人外周血T細胞cDNA文庫，購自美國Clontech Laboratories. Inc。一、獲得 IL-Ira 基因1、IL-Ira cDNA 的 PCR 擴增以PHA刺激的人外周血T細胞cDNA文庫為模板，加入合成的IL-Ira 引物和dNTP，上游引物為5 ‘ -GGCATATGCGACCCTCTGGGA-3 ‘，下游引物為 5' -GGAGGACGAGTAAGTCGACAA-3‘，上游引物引入NdeI酶切位點，從編碼成熟人IL-Ira的 第一個氨基酸開始，下游引物導(dǎo)入大腸桿菌高效終止密碼TAA和SalI酶切位點。95°C 5’ 變性后加入Pfu DNA聚合酶2. 5U，95°C 1，，50°C 1，30",72°C 1，30” 一輪，經(jīng)35輪反應(yīng)，最 后一輪72°C 15’，得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，電泳結(jié)果如圖2所示。 利用美國Promega公司的Magic PCR純化試劑盒純化IL-IraPCR產(chǎn)物。2、IL-Ira表達質(zhì)粒的構(gòu)建將大腸桿菌表達載體PET_30a用NdeI和SalI酶切，將步驟1的PCR產(chǎn)物用NdeI 和SalI酶切，與上面處理好的PET-30a連接，所用連接酶為T4DNA連接酶，構(gòu)建成IL-Ira 表達質(zhì)粒 PET-30a-IL-lRa(圖 1)。3、質(zhì)粒酶切鑒定將表達質(zhì)粒PET-30a-IL-lRa轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109菌株，抗性篩選，挑取陽性克 隆，將陽性克隆進行液體培養(yǎng)，提純PET-30a-IL-lRa表達質(zhì)粒，經(jīng)酚抽提，乙醇沉淀后，經(jīng) 內(nèi)切酶Kpnl、Sail消化，1 %瓊脂糖電泳鑒定，其酶譜與預(yù)期結(jié)果一致(圖3 泳道1為 λ DNA+Hind III 分子量標準；泳道 2 為 PET-30a-IL_lRa/Kpn I ；泳道 3 為 PET-30a-IL_lRa/ Sail ；泳道 4 未切的 pET-hlL-lra。4、目的基因的序列分析PET-30a-IL-lRa質(zhì)粒高保真Taq酶PCR (上游弓| 物為 5' -GGCATATGCGACCCTCTGGGA-3‘，下游引物為5' -GGAGGACGAGTAAGTCGACAA-3‘)，產(chǎn)物 片段連入PGEM-T質(zhì)粒(購自Promega公司)的克隆位點，構(gòu)建成pGEM-T-IL_lRa質(zhì)粒，利 用Pharmacia Biotech公司的自動DNA測序儀進行DNA的自動測序。目的基因的DNA序列分析結(jié)果如下pGEM-T-IL-IRa質(zhì)粒的插入片段的序列為序列表中序列1，經(jīng)序列分析證明與公布的序列完全一致，無突變點出現(xiàn)。序列表中序列1為完整的成熟區(qū)IL-Ira cDNA序列。成 熟區(qū)IL-Ira cDNA編碼152個氨基酸，包括N端附加的甲硫氨酸共為153個氨基酸(序列 表中序列2)。二、構(gòu)建表達載體1、人重組IL-Ira在大腸桿菌的表達表達載體PET-30a-IL_lRa轉(zhuǎn)化宿主菌BL21 (DE3)細胞，構(gòu)建IL-lra工程菌。同 時用轉(zhuǎn)空載體對照質(zhì)粒PET-30a轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)細胞，構(gòu)建轉(zhuǎn)空載體對照菌。挑取 單個菌落，接種IL-Ira工程菌和轉(zhuǎn)空載體對照菌于LB培養(yǎng)基中(含100 μ g/ml Kana)在 37 °C培養(yǎng)振蕩過夜，再以2%濃度接種于LB培養(yǎng)液中，到OD6tltl為0. 4左右，添加0. 2mMIPTG 開始誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。將誘導(dǎo)表達的細菌離心，收集菌體，直接加入含SDS的裂解液 進行SDS-PAGE分析及等電點分析。誘導(dǎo)表達后的細菌裂解物通過SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)pET-30a-hIL-lra克隆出現(xiàn) 明顯的表達帶，分子量20KD，與文獻報道分子量一致，而轉(zhuǎn)空載體對照菌未出現(xiàn)分子量為 20KD的表達帶(見圖4，圖4為IL-Ira大腸桿菌表達結(jié)果，其中，泳道1為蛋白質(zhì)分子量標 準；泳道2為轉(zhuǎn)空載體對照菌；泳道3為誘導(dǎo)后全菌；泳道4為菌體超聲上清。)。經(jīng)薄層 掃描結(jié)果，表達量占菌體總蛋白的30%以上。三、鑒定IL-Ira工程菌(一)種子庫鑒定(1)菌種檢定劃種LB瓊脂平板IL-Ira工程菌呈典型大腸桿菌集落形態(tài)，無其他雜菌生長。菌落圓形、小、隆起、透 明或半透明、整齊、發(fā)亮(圖5)。(2)涂片革蘭氏染色在光學(xué)顯微鏡下觀察為典型的革蘭氏陰性桿菌。(3)電鏡檢查IL-Ira工程菌呈典型的大腸桿菌形態(tài)，無支原體、病毒樣顆粒及其他微生物污染 (圖 6)。(4)生化反應(yīng)IL-Ira工程菌生化反應(yīng)檢測結(jié)果如表1所示。表IIL-Ira工程菌生化反應(yīng)檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種用于制備重組白細胞介素-1受體拮抗劑的發(fā)酵培養(yǎng)基，由以下成分組成胰蛋 白胨、酵母粉、氯化鈉、葡萄糖、十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸鎂、維生素Bi、 丙三醇聚氧丙烯聚氧乙烯醚和水；以上成分在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中濃度分別為胰蛋白胨32g/L、酵母粉20g/L、氯化鈉0. 5g/L、葡萄糖2g/L、十二水磷酸氫二鈉15g/L、 磷酸二氫鉀3g/L、氯化鈣0. 011g/L、硫酸鎂0. 96g/L、維生素B1O. 033g/L、丙三醇聚氧丙烯 聚氧乙烯醚0. 2ml/L。
2.制備重組白細胞介素-1受體拮抗劑的方法，包括以下步驟將重組菌接種于權(quán)利要 求1所述發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)，得到重組白細胞介素-1受體拮抗劑；所述重組菌為向大腸桿菌中導(dǎo)入序列表中序列1所示基因，得到的重組大腸桿菌，所 述序列表中序列1所示基因通過如下重組表達載體導(dǎo)入大腸桿菌將序列中序列1所示基 因插入PET-30a載體的多克隆位點得到的重組表達載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述發(fā)酵培養(yǎng)前，包括如 下種子培養(yǎng)的步驟(1)一級種子培養(yǎng)將重組菌接種于種子培養(yǎng)基A，在PH值為7. 2、37°C和200rpm的條 件下培養(yǎng)12小時得到一級種子液；所述種子培養(yǎng)基A由以下成分組成 胰蛋白胨、酵母粉、氯化鈉和水； 以上成分在所述種子培養(yǎng)基A中濃度分別為 胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L和氯化鈉10g/L ；(2)二級種子培養(yǎng)將步驟(1)得到的一級種子液按接種量接入種子培養(yǎng)基B，在 PH值為7. 2、37°C和200rpm的條件下培養(yǎng)7_8小時得到二級種子液；所述種子培養(yǎng)基B由以下成分組成 胰蛋白胨、酵母粉、氯化鈉和水； 以上成分在所述種子培養(yǎng)基B中濃度分別為 胰蛋白胨16g/L、酵母粉10g/L和氯化鈉5g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于 所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為37°C ；所述接種量為9% -10%，具體為9%和10% ；所述發(fā)酵培養(yǎng)中，使發(fā)酵體系的溶氧量保持在30% -50%，具體為30%、40%和50% ； 所述發(fā)酵體系的PH值為7. 0-7. 2，具體為7. 0,7. 1和7. 2 ； 所述發(fā)酵體系為發(fā)酵容器內(nèi)的所有物質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)過程中，包括如下 補料的步驟在所述發(fā)酵體系的0D_值達到7. 0-9. 0時，開始向發(fā)酵體系中補加補料培養(yǎng) 基；所述補加的補料培養(yǎng)基與權(quán)利要求1所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為13; 所述補料培養(yǎng)基由以下成分組成酵母粉、胰蛋白胨、甘油、葡萄糖、氯化銨、硫酸鎂、維生素B1和水； 以上成分在所述補料培養(yǎng)基中濃度分別為酵母粉200g/L、胰蛋白胨20g/L、甘油200ml/L、葡萄糖10g/L、氯化銨10g/L、硫酸鎂 5g/L 和維生素 B1O. lg/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)中，包括如下誘 導(dǎo)培養(yǎng)步驟在發(fā)酵體系的0D_值達到35-45時，向發(fā)酵體系中加入異丙基-β-D硫代 半乳糖苷進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，使異丙基_ β -D硫代半乳糖苷在發(fā)酵體系中的濃度為0. Immol/ L-0. 2mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間為3h_4h。
全文摘要
本發(fā)明公開了制備重組白細胞介素-1受體拮抗劑的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法。本發(fā)明所提供的制備重組白細胞介素-1受體拮抗劑的發(fā)酵方法包括以下步驟將重組菌接種于所述發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液，即得到重組白細胞介素-1受體拮抗劑；所述重組菌為向大腸桿菌中導(dǎo)入序列表中序列1所示基因，得到的重組大腸桿菌，所述序列中序列1所示基因通過如下重組表達載體導(dǎo)入大腸桿菌將序列中序列1所示基因插入PET-30a載體的多克隆位點得到的重組表達載體。本方法可重復(fù)性好；菌體生長快，可大幅縮短發(fā)酵周期；菌體產(chǎn)量高，可滿足高密度發(fā)酵需要和目標蛋白表達率高，且可溶性良好。
文檔編號C12P21/00GK102002517SQ20101029939
公開日2011年4月6日 申請日期2010年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月29日
發(fā)明者揣文華, 梁偉鋒, 洪海燕, 王瑞琳, 韓普 申請人:北京正旦國際科技有限責任公司