專利名稱：鑒定水稻秈粳亞種的方法及其專用引物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鑒定水稻秈粳亞種的方法及其專用弓I物組合物。
背景技術(shù)：
秈粳分化是亞洲栽培稻遺傳分化的主流，而且秈粳亞種在多方面都表現(xiàn)出很大差 異。因此，秈粳亞種間雜種優(yōu)勢(shì)的利用是水稻超高產(chǎn)育種的一項(xiàng)很重要的手段，直接利用秈 粳間雜種優(yōu)勢(shì)已成為雜交育種的主攻方向。要進(jìn)行秈粳亞種間雜種優(yōu)勢(shì)的超高產(chǎn)育種，首 先是正確判別秈粳。秈粳中間型或非典型秈粳可能來源于秈粳的自然雜交或人工雜交，也 可能來源于分化前的原始型過渡品種。這些品種中有很多是廣親和材料，如果能夠正確認(rèn) 識(shí)其在分類系統(tǒng)中的地位，利用這些品種作為秈粳雜交的中間橋梁，運(yùn)用科學(xué)的育種方法， 減少或避免亞種間產(chǎn)生不育或育性較差的問題，對(duì)秈粳稻雜種優(yōu)勢(shì)的利用、廣親和材料的 選育、分子標(biāo)記及基因工程的順利進(jìn)行都具有很重要的意義。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和深入，許多學(xué)者試圖利用現(xiàn)代科學(xué)方法系統(tǒng)直觀 地判別秈粳，以期能簡單方便地進(jìn)行分類。加藤等以形態(tài)特征、雜交親和性與血清反應(yīng) 為依據(jù)，提出了稃毛、粒形和親和性等作為秈粳鑒別的性狀；R彥一等則采用判別函數(shù)Y =-K+0. 75C-0. 22H+0. 86ph來判別秈粳(K為對(duì)氯酸鉀的抵抗力；C為低溫致害程度；H為穎 尖稃毛長度；Ph為對(duì)苯酚的反應(yīng))。這兩種方法對(duì)于典型的秈粳稻是很適應(yīng)的，但對(duì)于某些 地區(qū)一些類型親緣關(guān)系復(fù)雜，分類上就易產(chǎn)生錯(cuò)誤。程侃生提出的程式指數(shù)分類法，是以稃 毛、抽穗時(shí)殼色、葉毛、酚反應(yīng)、第1-2穗節(jié)長和谷粒長寬比6個(gè)性狀為鑒別指標(biāo)，將每個(gè)性 狀區(qū)分為5個(gè)等級(jí)，經(jīng)數(shù)字量化后以其綜合得分值劃分為秈、偏秈、偏粳和粳型4類，到目前 為止是我國廣泛采用的秈粳形態(tài)鑒別法(請(qǐng)參見程侃聲.亞洲稻秈粳亞種的鑒別.云南科 技出版社，昆明，1993)。生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展，使得遺傳標(biāo)記被廣泛用于秈粳分類。張堯忠等用稻種酯酶 同工酶聚丙烯酸胺凝膠電泳法進(jìn)行秈粳分析，發(fā)現(xiàn)了秈粳的標(biāo)志酶帶，并且結(jié)果與程式分 類法一致，但不能鑒別象光殼稻、鐮刀谷等在內(nèi)的特殊材料。錢惠榮等利用RFLP(擴(kuò)增片段 長度多態(tài)性)技術(shù)，篩選出了一批對(duì)秈粳特異性具有鑒別能力的RFLP探針，可以用來鑒別 秈粳測(cè)驗(yàn)種。程式華等構(gòu)建了秈粳交群體，結(jié)合形態(tài)指數(shù)法和分子標(biāo)記法對(duì)材料的秈性成 分和粳性成分進(jìn)行有效鑒別。孫傳清等利用RAPD方法，采用35個(gè)隨機(jī)引物對(duì)5個(gè)秈稻品 種、5個(gè)粳稻品種和27份中國普通野生稻進(jìn)行了分析，60%以上的引物能在秈稻和粳稻基 因組間顯示差異。然而，傳統(tǒng)分類方法采用的分類標(biāo)準(zhǔn)大都是數(shù)量性狀，既要求鑒定者經(jīng)驗(yàn)豐富，具 有準(zhǔn)確的觀察能力，還要求對(duì)鑒定時(shí)期的正確選擇，使用標(biāo)準(zhǔn)難以把握。RFLP法要經(jīng)過 Southern雜交，操作復(fù)雜，工作量大；一般選用單拷貝探針，標(biāo)記數(shù)量相對(duì)較少，多態(tài)性較 低；DNA用量多，相對(duì)要求DNA較完整；酶切反應(yīng)，要求DNA純度較高。RAPD法模板DNA在 擴(kuò)增時(shí)對(duì)模板濃度很靈敏，即不同的濃度會(huì)出現(xiàn)不同的擴(kuò)增式樣；擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)要求模板盡 量少含雜質(zhì)；使用低溫復(fù)性，通常為36°C (溫度在36°C以下，小于1°C的變化就會(huì)得到完全
3不同的擴(kuò)增式樣)，特異性低，引物與模板間有較高的錯(cuò)配率；重復(fù)性低，即便同一實(shí)驗(yàn)室 也不易重復(fù)，不同的實(shí)驗(yàn)室間更是缺乏可比性。因此，到目前為止還沒有形成一套能直接用 于實(shí)際工作中的分類系統(tǒng)。所以，亞洲栽培稻的分類一直受到各國科學(xué)家的高度重視，亟待 建立簡便易行的分類體系，使之更好地為水稻資源和育種工作服務(wù)。SSR標(biāo)記是建立在PCR基礎(chǔ)上的一種新型遺傳標(biāo)記，能夠反映植物在遺傳物質(zhì)DNA 水平上的差異，具有較高的多態(tài)性信息量，具有共顯性分離、標(biāo)記位點(diǎn)?；缘忍攸c(diǎn)，而且， 操作簡單、試驗(yàn)重復(fù)性好，已在生物起源、進(jìn)化、遺傳多樣性研究和品種資源鑒定中得到廣 泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鑒定水稻秈粳亞種的方法及其專用引物組合物。本發(fā)明提供了輔助鑒定水稻秈粳亞種的引物組合物，由如下3個(gè)引物對(duì)組成序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì)RM130 ；序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對(duì)RM7009 ；序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA組成的引物對(duì)RM7337。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)專業(yè)知識(shí)可以選用以上任一引物對(duì)，或是它們的組合，還可 以在合成引物時(shí)使引物帶上標(biāo)記，如熒光標(biāo)記。本發(fā)明提供的輔助鑒定水稻秈粳亞種的方法，屬于微衛(wèi)星指數(shù)法 (MicrosatelliteIndex)，包括下列步驟(1)以待測(cè)水稻的基因組DNA為模板，用引物對(duì)RM130進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物甲；以待測(cè)水稻的基因組DNA為模板，用引物對(duì)RM7009進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物乙；以待測(cè)水稻的基因組DNA為模板，用引物對(duì)RM7337進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物丙；(2)如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物甲為90bp，賦值為1，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物甲為84bp，賦值 為-1 ；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物乙為99bp，賦值為1，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物乙為96bp，賦值為-1 ；如 果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物丙為134bp，賦值為1，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物丙為122bp，賦值為-1 ；(3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物甲、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物乙和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物丙的賦值相加，得到和值； 和值大于0的為候選的粳型稻種，和值小于0的為候選的秈型稻種。所述方法中，可采用CTAB法提取水稻的基因組DNA。所述方法中，用于提取基因組的水稻材料可為新鮮的，也可為干品。所述方法中可采用變性膠聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。所 述電泳中，優(yōu)選采用銀染法染色。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物甲、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物乙和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物丙的電泳結(jié)果(SSR圖譜)可以 采用軟件進(jìn)行分析，也可以目測(cè)進(jìn)行分析。實(shí)施例中采用的是15ul PCR反應(yīng)體系，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將反應(yīng)體系擴(kuò)大或縮 小，也可以將引物增多或減少。本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定水稻秈粳亞種的試劑盒，包括所述引物組合物。所述弓I物組合物，所述方法和所述試劑盒均可以用于水稻育種。所述試劑盒中，還可包括用于提取基因組DNA的試劑和/或用于PCR擴(kuò)增的試劑。
所述試劑盒中的各個(gè)組分可為液體，也可為凍干粉。本發(fā)明基于秈粳亞種DNA重復(fù)序列的差異，提供了 3對(duì)秈粳特異性分化程度高的 SSR引物對(duì)，可用于水稻秈粳亞種的鑒定。本發(fā)明采用137種水稻樣本對(duì)本發(fā)明的引物組合 物和方法進(jìn)行了驗(yàn)證。所選用的材料有很好的代表性，為用SSR標(biāo)記進(jìn)行秈粳鑒別研究提 供了很好的平臺(tái)。本發(fā)明具有快捷高效、靈敏度高、分辨力好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，適用于 水稻品種的秈粳屬性鑒定、水稻育種以及植物進(jìn)化研究等方面的應(yīng)用。


圖1為采用引物RM7009時(shí)部分樣本的聚丙烯酰胺電泳圖。圖2為采用引物RM130時(shí)部分樣本的聚丙烯酰胺電泳圖。圖3為采用引物RM7337時(shí)部分樣本的聚丙烯酰胺電泳圖。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。CTAB 提取液(1000ml)的配方(pH = 8. 0)見表 1。表ICTAB 提取液(1000ml)的配方(pH = 8. 0)
權(quán)利要求
輔助鑒定水稻秈粳亞種的引物組合物，由如下3個(gè)引物對(duì)組成序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì)RM130；序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對(duì)RM7009；序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA組成的引物對(duì)RM7337。
2.輔助鑒定水稻秈粳亞種的方法，包括下列步驟(1)以待測(cè)水稻的基因組DNA為模板，用引物對(duì)RM130進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物甲；以待測(cè)水稻的基因組DNA為模板，用引物對(duì)RM7009進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 乙；以待測(cè)水稻的基因組DNA為模板，用引物對(duì)RM7337進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物丙； 所述引物對(duì)RM130由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成；所述引物 對(duì)RM7009由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成；所述引物對(duì)RM7337 由序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA組成；(2)如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物甲為90bp，賦值為1，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物甲為84bp，賦值為-1；如 果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物乙為99bp，賦值為1，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物乙為96bp，賦值為-1 ；如果PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物丙為134bp，賦值為1，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物丙為122bp，賦值為-1 ；(3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物甲、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物乙和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物丙的賦值相加，得到和值；和值 大于0的為候選的粳型稻種，和值小于0的為候選的秈型稻種。
3.一種輔助鑒定水稻秈粳亞種的試劑盒，包括權(quán)利要求1所述的引物組合物。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括用于提取基因組DNA 的試劑和/或用于PCR擴(kuò)增的試劑。
5.權(quán)利要求1所述引物組合物在制備輔助鑒定水稻秈粳亞種的試劑盒中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述引物組合物在輔助鑒定水稻秈粳亞種中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述引物組合物、權(quán)利要求2所述方法或權(quán)利要求3或4所述試劑盒在 水稻育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒定水稻秈粳亞種的方法及其專用引物組合物。本發(fā)明提供的引物組合物，由如下3個(gè)引物對(duì)組成序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì)RM130；序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對(duì)RM7009；序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA組成的引物對(duì)RM7337。述引物組合物可用于輔助鑒定水稻秈粳亞種，具有快捷高效、靈敏度高、分辨力好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，適用于水稻品種的秈粳屬性鑒定、水稻育種以及植物進(jìn)化研究等方面的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101942518SQ20101029187
公開日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2010年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月26日
發(fā)明者宋立營, 張冬玲, 張洪亮, 李自超, 王鳳梅, 王美興, 馬占峰 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)