專利名稱：結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法及指示劑的應(yīng)用及固體培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對結(jié)核分枝桿菌的耐藥性進行試驗的醫(yī)學檢驗領(lǐng)域，具體為一種結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法，及用于所述結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法的指示劑的應(yīng)用和固 體培養(yǎng)基，及用于所述結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法的加熱恒溫機和培養(yǎng)盒。
背景技術(shù)：
結(jié)核病的耐藥性是一個日益嚴重的公共衛(wèi)生問題，嚴重威脅著結(jié)核病的控制。 中國工程院院士鐘南山在兩會期間曾稱，中國共有450萬活動性結(jié)核病人，帶菌者高達 5.5億，而帶菌者一生中有10%的可能性會發(fā)病。2009年4月，中國衛(wèi)生部部長陳竺 在北京舉行的“耐多藥/廣泛耐藥結(jié)核病高負擔國家”部長級會議上通報了中國耐藥 結(jié)核病的情況中國疾病防控中心的抽樣調(diào)查顯示，中國結(jié)核病人中，耐多藥發(fā)病率為 8.32%,總計約為12萬人，居世界第二位，廣泛耐藥發(fā)病率則為0.68%，總計大約1萬 人，其危害遠遠超過艾滋病。藥敏試驗是對結(jié)核分枝桿菌的耐藥性進行檢測的重要試 驗?，F(xiàn)有的結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法，一般有紙片檢驗法和濃度檢驗法。紙片檢驗法 是通過觀察由于貼在固體培養(yǎng)基表面上藥物紙片形成的藥物抑菌圈來確定結(jié)核分枝桿菌 對藥物的敏感性；濃度檢驗法是通過觀察檢測不同藥物和不同藥物濃度試驗容器中結(jié)核 分枝桿菌的生長情況來確定結(jié)核分枝桿菌對藥物的敏感性。不管是紙片檢驗法還是濃度 檢驗法，其整個藥敏試驗過程一般可分為標本前處理、增殖或分離培養(yǎng)和藥敏檢驗三個 階段?，F(xiàn)有的紙片檢驗法，標本前處理階段的步驟為①用吸管吸取提供的標本置于試 驗容器中；②向試驗容器中加入消化液，對標本粘液進行消化，使標本中粘液和雜質(zhì)包 裹的細菌充分暴露；③離心分離，倒掉上清液，獲得濃集的標本；在獲得濃集的標本后 再進行增殖或分離培養(yǎng)。增殖或分離培養(yǎng)階段的步驟為④取已經(jīng)濃集標本的少部分制 成濃菌液；⑤將濃菌液接種于固體培養(yǎng)基例如羅氏培養(yǎng)基上進行增殖或分離培養(yǎng)，一般 需在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1月左右，把單個細菌培養(yǎng)成細菌菌落；在獲得細菌菌落后再進 入藥敏檢驗階段。藥敏檢驗階段的步驟為⑥取少量的細菌菌落，一般是取1——3個 細菌菌落，將其溶解分散制成濃菌液；⑦將濃菌液接種于固體培養(yǎng)基例如瓊脂培養(yǎng)基表 面上；⑧在固體培養(yǎng)基表面上貼上藥物紙片；⑨放入37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1個月左右，觀 察藥物抑菌圈，確定結(jié)核分枝桿菌對藥物的敏感性。現(xiàn)有的紙片檢驗法的優(yōu)點是操作方 便、設(shè)備簡單、投資??；但其存在以下缺點(1)整個檢驗所需的時間太長增殖或分 離培養(yǎng)階段需要1個月左右，藥敏檢驗階段大約需要1個月左右，整個試驗過程大約需 要2個月左右。如果在藥敏試驗得到結(jié)果后再使用藥物治療，就會嚴重影響治療時機。 而臨床上在沒有藥敏試驗的情況下使用藥物治療一是可能會造結(jié)核分枝桿菌耐藥的嚴重 后果；二是對感染耐藥性結(jié)核分枝桿菌的結(jié)核病患者很難達到好的治療效果。(2)不安 全。整個試驗需要兩次人工接種，由于結(jié)核分枝桿菌具有傳染性，這樣對操作人員形成 安全隱患，對環(huán)境也形成污染隱患?，F(xiàn)有的濃度檢驗法，其在增殖培養(yǎng)階段采用固體培養(yǎng)基，其標本前處理、增殖或分離培養(yǎng)二個階段的步驟與現(xiàn)有的紙片檢驗法相同，但藥敏檢驗階段的步驟與現(xiàn)有的 紙片檢驗法不同，具體為從固體培養(yǎng)基上取增殖或分離培養(yǎng)獲得的細菌菌落，一般是 取1個或數(shù)個細菌菌落，一一將其溶解分散制成菌懸液一一將菌懸液倒入按不同的藥物 和不同的濃度配制成的多個試驗容器中，制成對比試驗標本一一觀察檢測試驗容器中細 菌生長情況，確定結(jié)核分枝桿菌對藥物的敏感性。這種檢驗方法的優(yōu)點是設(shè)備簡單、 投資??；但其存在以下缺點(1)所需的時間長。增殖或分離培養(yǎng)階段的方法和步驟 與現(xiàn)有的紙片檢驗法的方法和步驟相同，因此，僅增殖或分離培養(yǎng)階段所需的時間就需 要1個月左右；(2)操作麻煩、不安全且容易造成錯誤的檢驗結(jié)果。由于需要配制多個 試驗容器，配制過程很麻煩且不安全，對操作人員形成安全隱患，對環(huán)境也形成污染隱 患；在配制多個試驗容器過程中比較容易被其他細菌污染，這樣就可能造成錯誤的檢驗 結(jié)果。此外，還有利用儀器鑒定藥物敏感性的方法，例如BACTEC-TB460系統(tǒng)及 BACTEC 960系統(tǒng)，其優(yōu)點是操作簡單，試驗過程時間短，平均檢出時間為14.4天，最 快10天左右。但其存在的主要缺點是儀器設(shè)備的價位高，投資大；使用成本高，一是儀 器設(shè)備的使用成本高，二是需要多個對比試驗標本，試劑的成本較高，其費用較大，一 般醫(yī)院難以承受，難以推廣普及。
從上面詳細分析現(xiàn)有的結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法可以看出，現(xiàn)有的紙片檢驗 法和濃度檢驗法存在以下缺點(1)整個檢驗過程所需的時間長。(2)操作麻煩。(3)不 安全。(4)容易出現(xiàn)誤檢。而利用儀器鑒定藥物敏感性的方法投資大，使用成本高，難 以推廣普及。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢驗過程時間短的結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法及指示 劑的應(yīng)用及固體培養(yǎng)基；另一個目的是投資少、使用成本低；再一個目的是使用安全方 便。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明結(jié)核分支枝桿菌藥敏試驗方法，包括(1)對提供的標本進行前處理，制成濃集標本；(2)向濃集標本中加入液體增菌培養(yǎng)基I，制成液態(tài)增菌培養(yǎng)標本II，增菌培養(yǎng) 0 7天；(3)將固體培養(yǎng)基III加溫熔化，制成液態(tài)的固體培養(yǎng)基III，然后將其溫度降至 與上述液態(tài)增菌培養(yǎng)標本II相應(yīng)的培養(yǎng)溫度或室溫；所述固體培養(yǎng)基具有50°C 95°C的熔化溫度，25°C 45°C的凝固溫度；所述的固體培養(yǎng)基包括有瓊脂或瓊脂糖，以及營養(yǎng)物質(zhì)；(4)將液態(tài)增菌培養(yǎng)標本II與液態(tài)的固體培養(yǎng)基III混合，制成液態(tài)藥敏試驗標 本IV;(5)將液態(tài)藥敏試驗標本IV凝固，制成帶藥敏紙片的固態(tài)藥敏試驗標本V;(6)將固態(tài)藥敏試驗標本V培養(yǎng)5 15天；(7)通過指示劑的指示觀察藥物抑菌圈，確定結(jié)核分枝桿菌對藥物的敏感性。所述的結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法，其所述的指示劑為結(jié)核分枝桿菌生長或生化反應(yīng)指示劑。所述的 結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法，其指示劑包括亞碲酸鹽，或亞碲酸鹽和尿 素，或尿素，或 MTT，或 XTT，或 Alamar-Blue。所述的結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法，其所述指示劑亞碲酸鹽是在固態(tài)藥敏試驗 標本V培養(yǎng)5-15天后，再向固態(tài)藥敏試驗標本V中滴入。所述的結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法，除亞碲酸鹽外的指示劑成分是在液體增菌 培養(yǎng)基I或固體培養(yǎng)基III中加入。所述(3)步中，制成液態(tài)的固體培養(yǎng)基III，然后將其溫度降至與上述液態(tài)增菌 培養(yǎng)標本II相應(yīng)的培養(yǎng)溫度或室溫是指在液態(tài)增菌培養(yǎng)標本II進行增菌培養(yǎng)的情況下， 將液態(tài)的固體培養(yǎng)基III的溫度降至與液態(tài)增菌培養(yǎng)標本II增菌培養(yǎng)時相同或相近的溫度 即可，若沒有進行增菌培養(yǎng)，則降至室溫，但固體培養(yǎng)基III仍是以液態(tài)的狀態(tài)存在。所述的結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法的指示劑的應(yīng)用，其所述的指示劑為亞碲酸 鹽，或為亞碲酸鹽和尿素；其中亞碲酸鹽是在固態(tài)藥敏標本V培養(yǎng)5-15天后，再向固態(tài) 藥敏標本V中滴入；尿素是在液體增菌培養(yǎng)基I或固體培養(yǎng)基III中加入。所述的亞碲酸鹽包括亞碲酸鈉或亞碲酸鉀。在液態(tài)藥敏試驗標本IV中含有固體培養(yǎng)基III與液體增菌培養(yǎng)基I配比的比 例為每IOOml液體增菌培養(yǎng)基I加一份固體培養(yǎng)基III。每一份固體培養(yǎng)基含卵黃液 50ml 100ml，可溶性淀粉2g 8g，L-酪蛋白O.lg 0.8g，酚紅2ml 8ml，瓊脂或 瓊脂糖0.5g 3.5g，抑菌劑適量。所述的固體培養(yǎng)基III，還可加入尿素，尿素的加入量為每一份固體培養(yǎng)基加 尿素O.lg 0.5g。所述的固體培養(yǎng)基III按一次使用的數(shù)量密封分裝。所述結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法的加熱恒溫機，包括有導熱塊，電加熱裝置和 溫度控制裝置，所述導熱塊設(shè)有高溫區(qū)和恒溫區(qū)，在高溫區(qū)設(shè)有高溫杯卡孔，在恒溫區(qū) 設(shè)有恒溫杯卡孔。所述的加熱恒溫機，在恒溫區(qū)設(shè)有恒溫平衡區(qū)和混合區(qū)，在恒溫平衡區(qū)設(shè)有恒 溫杯卡孔，在混合區(qū)設(shè)有混合杯卡孔。所述的加熱恒溫機，在混合區(qū)還設(shè)有倒板卡槽。所述結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法的培養(yǎng)盒，包括有周壁和底部封閉、上端敞開 的盒體，在盒體的底部設(shè)有標尺，在盒體底部的上側(cè)面上貼有藥敏紙片。所述的培養(yǎng)盒，在盒體底部的上側(cè)面上貼有六片藥敏紙片。本發(fā)明與現(xiàn)有的紙片檢驗法和濃度檢驗法相比，整個試驗過程時間短的原因 是①提供的標本中的待檢結(jié)核分枝桿菌得到了充分利用。由于提供的標本中的結(jié)核分 枝桿菌被濃集后絕大部分被用于做藥敏試驗，因此，提供的標本中的待檢結(jié)核分枝桿菌 得到了充分的利用，使藥敏試驗的初始菌量大，減少增菌培養(yǎng)時間，從而節(jié)約整個試驗 時間。②增殖培養(yǎng)階段的時間短。由于本發(fā)明的增殖培養(yǎng)是在液態(tài)增菌培養(yǎng)基中進行， 相對而言，細菌在液態(tài)增菌培養(yǎng)基中的增殖速度比在固體培養(yǎng)基上的增殖速度快；再加 上充分利用了提供標本中的待檢結(jié)核分枝桿菌，使增殖培養(yǎng)前的初始數(shù)量大，因此，增 殖培養(yǎng)階段的時間短，最多只需7天。如果結(jié)核病人的病情檢測結(jié)果是++++，由于其提供用于藥敏試驗標本中的結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量很大，在做藥敏試驗時可以省掉增殖培 養(yǎng)。③藥敏檢驗階段時間短。由于本發(fā)明是將增殖培養(yǎng)后的液態(tài)增菌培養(yǎng)標本II與液態(tài) 的固體培養(yǎng)基III混合，采用傾注法制成帶藥敏紙片的固態(tài)藥敏試驗標本V，這樣，增殖 培養(yǎng)后的結(jié)核分枝桿菌全部都用于藥敏檢驗，使得藥敏檢驗的起始菌量大，比較容易形 成藥物抑菌圈，加上指示劑的指示作用，使抑菌圈能被目測到，藥敏檢驗階段只需5到 15天，比現(xiàn)有的紙片檢驗法相比所需的時間短。④使用了快速顯色指示劑。由于本發(fā) 明利用亞碲酸鹽作指示劑，經(jīng)發(fā)明人反復試驗證明，亞碲酸鹽能使固態(tài)藥敏試驗標本中 形成的菌落在2-48小時內(nèi)呈黑色或深灰色。⑤使用了前指示劑。由于本發(fā)明在固體培 養(yǎng)基中加入尿素，結(jié)核分枝桿菌會產(chǎn)生尿素酶分解尿素，使固態(tài)藥檢試驗標本呈粉紅色 或淡黃色，在藥敏試驗階段，通過觀察固態(tài)藥敏試驗標本的顏色，初步判斷固態(tài)藥敏試 驗標本中結(jié)核分枝桿菌生長情況，在固態(tài)藥敏試驗標本呈粉紅色或淡黃色后，說明固態(tài) 藥敏試驗標本中的結(jié) 核分枝桿菌數(shù)量達到了形成抑菌圈需要的數(shù)量，滴入亞碲酸鹽指示 齊U，在2到48小時內(nèi)即能形成明顯的抑菌圈，這樣就可以縮短藥敏檢驗階段時間。經(jīng)發(fā) 明人反復試驗證明，利用本發(fā)明結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法進行結(jié)核桿菌藥敏試驗，平 均檢出時間10天左右。綜上所述，與現(xiàn)有的紙片檢驗法和濃度檢驗法相比，本發(fā)明實現(xiàn) 了試驗過程時間短的目的。本發(fā)明投資少、使用成本低的原因是實施本發(fā)明所需的設(shè)備只需配套離心裝 置、培養(yǎng)箱、加熱恒溫機等。上述離心裝置、培養(yǎng)箱、加熱恒溫機等制造簡單、生產(chǎn)成 本低，因此，完成整個試驗所需要的設(shè)備投資少；實施本發(fā)明需要配套使用一次性試驗 容器以及包括營培養(yǎng)基、指示劑等試劑，這些一次性試驗容器和試劑的成本低且使用的 數(shù)量少，加上本發(fā)明儀器設(shè)備的投資少使用成本低，進一步減少了本發(fā)明的使用成本。 因此，與利用儀器鑒定藥物敏感性的方法相比，本發(fā)明有效地實現(xiàn)了投資少、使用成本 低的目的。本發(fā)明使用安全方便的原因是本發(fā)明濃集待檢標本、結(jié)果判讀均可以在一 次性密閉容器內(nèi)進行，不會污染其他器材，操作完成后進行統(tǒng)一消毒處理，并且整個檢 驗過程手工操作的程序很少且簡單，這樣就減少了結(jié)核分枝桿菌對工作人員和環(huán)境的影 響，大大地提高了試驗的生物安全性；減少了被其他細菌污染的機會，能有效地減少錯 誤檢驗結(jié)果的出現(xiàn)。因此，與現(xiàn)有的紙片檢驗法和濃度檢驗法相比，本發(fā)明能有效地實 現(xiàn)使用安全方便的目的。


下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法及指示劑的應(yīng)用及 固體培養(yǎng)基作進一步說明圖1所示為本發(fā)明中的加熱恒溫機俯視圖示意圖。圖2為圖1所示加熱恒溫機的A-A剖視圖示意圖。圖3所示為本發(fā)明中的培養(yǎng)盒去掉盒蓋后的俯視圖示意圖。圖4為圖3所示培養(yǎng)盒的剖視圖示意圖。1、機殼，2、倒板卡槽，3、混合杯卡孔，4、導熱塊，5、隔熱墻，6、高溫杯 卡孔，7、控制面板，8、恒溫杯卡孔，9、電加熱裝置，10、盒體，11、藥敏紙片，12、標尺，13、盒蓋。
具體實施例方式圖1、圖2所示為加熱恒溫機，在機殼1上安裝有導熱塊4，導熱塊4分為高溫 區(qū)和恒溫區(qū)，高溫區(qū)的溫度為在50°C-95°C范圍內(nèi)可調(diào)，其中最佳溫度為90°C;恒溫區(qū) 的溫度為在25°C-45°C范圍內(nèi)可調(diào)，其中最佳溫度為42°C;在高溫區(qū)中設(shè)有高溫杯卡孔 6和控制面板7，在恒溫區(qū)中設(shè)有恒溫平衡區(qū)和混合區(qū)，在恒溫平衡區(qū)中設(shè)有恒溫杯卡孔 8，在混合區(qū)中設(shè)有混合杯卡孔3和倒板卡槽2，在高溫區(qū)和恒溫區(qū)之間設(shè)有隔熱墻5，在 導熱塊4中設(shè)有電加熱裝置9，在機殼1中設(shè)有溫度控制裝置。圖3、圖4所示為培養(yǎng)盒，盒體10為周壁和底部封閉、上端敞開的結(jié)構(gòu)形式，在 盒體10的底部設(shè)有標尺12，在盒體10底部的上側(cè)面上貼有藥敏紙片11，在盒體10的敞 開端配套有盒蓋13。下面給出本發(fā)明結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法及指示劑的應(yīng)用及固體培養(yǎng)基的實 施例本實施例的培養(yǎng)盒，在盒體10底部的上側(cè)面上貼有六片藥敏紙片11，盒體10的 容積為30ml。1、將患者晨痰標本留取5ml用2%氫氧化鈉和0.5% NALC混合液消化；2、置于離心機中，以4500轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心分離10分鐘，將標本中結(jié)核分 枝桿菌充分沉淀；3、去掉上清液，制成濃集標本，完成標本的前處理；4、用IOml液體增菌培養(yǎng)基I將濃集標本洗脫制成液體菌懸液形式的液態(tài)增菌培 養(yǎng)標本II ；5、將液態(tài)增菌培養(yǎng)標本放入37°C的培養(yǎng)箱中增菌培養(yǎng)，具體增菌培養(yǎng)的時間視 患者排菌量定，如果結(jié)核病人的病情檢測結(jié)果是++++，則可以不增菌培養(yǎng)；6、制作液態(tài)結(jié)核分枝桿菌藥檢試驗標本(1)將加熱恒溫機中的高溫區(qū)溫度設(shè)定為90°C，恒溫區(qū)溫度設(shè)定為42°C ；(2)將固體培養(yǎng)基III放入加熱恒溫機高溫區(qū)中的高溫杯卡孔6中加熱熔化至液 態(tài)；液態(tài)增菌培養(yǎng)標本II與液態(tài)的固體培養(yǎng)基III混合后的體積為30ml;固體培養(yǎng)基III 的物理性能為在溫度上升到90°C時，固體培養(yǎng)基III從固態(tài)熔化為液態(tài)；而當溫度下降 時到40°C后，又從液態(tài)凝固成固態(tài)；(3)將液態(tài)的固體培養(yǎng)基III放入加熱恒溫機恒溫平衡區(qū)中的恒溫杯卡孔8中降 溫，使液態(tài)的固體培養(yǎng)基III的溫度降至42°C，此時，固體培養(yǎng)基III仍呈液態(tài)；(4)將增菌培養(yǎng)后的液態(tài)增菌培養(yǎng)標本II放入加熱恒溫機恒溫區(qū)中的恒溫平衡區(qū) 中的恒溫杯卡孔8中，使其溫度上升到42°C。(5)將溫度為42°C的液態(tài)固體培養(yǎng)基III和溫度為42°C的液態(tài)增菌培養(yǎng)標本II倒 入混合杯中混合，制成液態(tài)藥敏試驗標本IV。為了確?；旌掀陂g固體培養(yǎng)基III呈液態(tài)， 混合杯應(yīng)放入加熱恒溫機恒溫區(qū)中的混合杯卡孔3中進行混合；7、制作固態(tài)藥檢試驗標本(1)將去掉盒蓋13后的盒體10放入加熱恒溫機恒溫區(qū)中的倒板卡槽2中，使其溫度上升到42°C。；(2)將液態(tài)藥敏試驗標本IV倒入盒體10中；(3)蓋上盒蓋13，取出培養(yǎng)盒，放在常溫下使液態(tài)藥敏試驗標本IV凝固，制成固態(tài)藥檢試驗標本V;8、將固態(tài)藥敏試驗標本V放入37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察固態(tài)藥敏試驗標本的 顏色，當顏色呈粉紅色或淡黃色時，即可以進行下一試驗步驟。9、取掉盒蓋13，向固態(tài)藥檢試驗標本中滴入亞碲酸鉀指示劑lml，蓋上盒蓋；10、將其放入37°C的培養(yǎng)箱中，觀察抑菌圈，根據(jù)抑菌圈大小判斷藥物對細菌 的作用效果。本實施例中的液體增菌培養(yǎng)基I采用7H9。本實施例中的固體培養(yǎng)基III與液體增菌培養(yǎng)基I混合配比比例為每100ml7H9 加一份固體培養(yǎng)基。每一固體培養(yǎng)基含卵黃液75ml，可溶性淀粉4.6g，L-酪蛋白0.25g， 酚紅4ml，瓊脂糖1.25g，尿素0.2g，抑菌劑孔雀綠適量。本實施例中的指示劑還可以選用亞碲酸鈉。本發(fā)明固體培養(yǎng)基III中的瓊脂糖的作用是使藥敏試驗時的培養(yǎng)基凝固，除瓊脂 糖外，還可以用瓊脂。本發(fā)明中的固體培養(yǎng)基III的物理性能為在常溫下為固態(tài)；當溫度上升直到低 于熔化溫度前仍為固態(tài)，當溫度上升到高于熔化溫度后，才熔化成液態(tài)；當溫度下降直 到高于凝固溫度前仍為液態(tài)，當溫度下降到低于凝固溫度后，才凝固為固態(tài)。本發(fā)明中的固體培養(yǎng)基III的熔化溫度的選擇標準為①當固體培養(yǎng)基的溫度上 升達到熔化溫度時，其中的營養(yǎng)成份不被破壞；②當固態(tài)藥敏試驗標本放入37°C的培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)時，藥敏試驗標本仍呈固態(tài)；③方便操作。因此，本發(fā)明中的固體培養(yǎng)基III的 熔化溫度選擇為50°C -95°C。本發(fā)明中的固體培養(yǎng)基III的凝固溫度的選擇標準為①當固體培養(yǎng)基的溫度下 降達到凝固溫度前，結(jié)核分枝桿菌與其混合時，其溫度應(yīng)為結(jié)核分枝桿菌能夠存活的溫 度；②能較快達到37°C的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)溫度；③方便操作。根此，本發(fā)明中的固體 培養(yǎng)基III的凝固溫度選擇為25°C-45°C。如果凝固溫度太低就可能低于室溫，特別在天 氣較熱的時候，需要放入冷藏設(shè)備中才能凝固，不方便操作；同時，距37°C的結(jié)核分枝 桿菌培養(yǎng)溫度相距較大，不便于盡快達到結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)溫度。如果凝固溫度太高， 不利于結(jié)核分枝桿菌的存活。本發(fā)明的指示劑可以選用生長指示劑或生化反應(yīng)指示劑。對生長指示劑的要求 是能夠指示結(jié)核分枝桿菌生長繁殖并形成可觀察的變色現(xiàn)象；可以選用MTT，XTT, Alamar-Blue。對生化反應(yīng)指示劑的要求是加入后能參與結(jié)核分枝桿菌特定生化反應(yīng)中 的某種生化反應(yīng)，并形成可觀察的變色等現(xiàn)象；可以選用尿素，亞碲酸鉀，亞碲酸鈉。上述實施例中的指示劑選用的是尿素和亞碲酸鉀，此外，還可以選用尿素、 MTT、XTT、Alamar-Blue中的一種作為指示劑，其試驗過程只有8個步驟，前面7個 步驟相同，最后一個步驟為將固態(tài)藥敏試驗標本放入37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察抑菌 圈，根據(jù)抑菌圈大小判斷藥物對細菌的作用效果。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)核分支枝桿菌藥敏試驗方法，包括以下步驟(1)對提供的標本進行前處理，制成濃集標本；(2)向濃集標本中加入液體增菌培養(yǎng)基I，制成液態(tài)增菌培養(yǎng)標本II，增菌培養(yǎng)0 7天；(3)將固體培養(yǎng)基III加溫熔化，制成液態(tài)的固體培養(yǎng)基III，然后將其溫度降至與上 述液態(tài)增菌培養(yǎng)標本II相應(yīng)的培養(yǎng)溫度或室溫；所述的固體培養(yǎng)基具有50°C 95°C的熔化溫度，25°C 45°C的凝固溫度； 所述的固體培養(yǎng)基包括有瓊脂或瓊脂糖，以及營養(yǎng)物質(zhì)；(4)將液態(tài)增菌培養(yǎng)標本II與液態(tài)的固體培養(yǎng)基III混合，制成液態(tài)藥敏試驗標本IV;(5)將液態(tài)藥敏試驗標本IV凝固，制成帶有藥敏紙片的固態(tài)藥敏試驗標本V;(6)將固態(tài)藥敏試驗標本V培養(yǎng)5 15天；(7)通過指示劑指示觀察藥物抑菌圈，確定結(jié)核分枝桿菌對藥物的敏感性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法，所采用的指示劑為結(jié)核分枝桿 菌生長或生化反應(yīng)指示劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法，所述的指示劑包括亞碲酸鹽， 或亞碲酸鹽和尿素，或尿素，或MTT，或XTT，或Alamar-Blue。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法，所述指示劑亞碲酸鹽是在完成 將固態(tài)藥敏試驗標本V培養(yǎng)5 15天后，向固態(tài)藥敏試驗標本V中滴入。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3或4所述的結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法，除亞碲酸鹽外的指示 劑成分是在液體增菌培養(yǎng)基I或固體培養(yǎng)基III中加入。
6.一種用于權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法的指示劑的應(yīng)用，所述的指 示劑為亞碲酸鹽，或為亞碲酸鹽和尿素；其中亞碲酸鹽是在完成將固態(tài)藥敏試驗標本V 培養(yǎng)5 15天后，向固態(tài)藥敏試驗標本V中滴入；尿素是在液體增菌培養(yǎng)基I或固體培 養(yǎng)基III中加入。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的指示劑的應(yīng)用，所述的亞碲酸鹽包括亞碲酸鈉或亞碲酸鉀。
8.一種用于權(quán)利要求1所述結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法的固體培養(yǎng)基，每一份固 體培養(yǎng)基III含有卵黃液50ml-100ml，可溶性淀粉2g_8g，L-酪蛋白0.1g_0.8g，酚紅 2ml_8ml，瓊脂或瓊脂糖0.5g_3.5g，抑菌劑適量。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基III中加入尿素，尿素在每一份固 體培養(yǎng)基III中的加入量為O.lg 0.5g。
10.權(quán)利要求8或9所述的固體培養(yǎng)基在權(quán)利要求1中的應(yīng)用，在液態(tài)藥敏試驗標本 IV中固體培養(yǎng)基III與液體增菌培養(yǎng)基I混合配比為每IOOml液體增菌培養(yǎng)基I加一份 固體培養(yǎng)基III。
11.一種用于權(quán)利要求1所述結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法的加熱恒溫機，其特征是 所述的加熱恒溫機包括有導熱塊(4)，電加熱裝置(9)和溫度控制裝置，所述導熱塊(4) 設(shè)有高溫區(qū)和恒溫區(qū)，在高溫區(qū)設(shè)有高溫杯卡孔(6)，在恒溫區(qū)設(shè)有恒溫杯卡孔(8)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的加熱恒溫機，其特征是在恒溫區(qū)設(shè)有恒溫平衡區(qū)和混 合區(qū)，在恒溫平衡區(qū)設(shè)有恒溫杯卡孔(8)，在混合區(qū)設(shè)有混合杯卡孔(3)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的加熱恒溫機，其特征是在混合區(qū)還設(shè)有倒板卡槽(2)。
14.一種用于權(quán)利要求1所述結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法的培養(yǎng)盒，其特征是包括 有周壁和底部封閉、上端敞開的盒體(10)，在盒體(10)的底部設(shè)有標尺(12)，在盒體 (10)底部的上側(cè)面上貼有藥敏紙片(11)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的培養(yǎng)盒，其特征是在盒體(10)底部的上側(cè)面上貼有六 片藥敏紙片(11)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法，及用于所述結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法的指示劑的應(yīng)用和固體培養(yǎng)基，及用于所述結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗方法的加熱恒溫機和培養(yǎng)盒，其藥敏試驗方法的步驟為對提供的標本進行前處理后，加入液體增菌培養(yǎng)基并進行增菌培養(yǎng)，將固體培養(yǎng)基加溫熔化，制成液態(tài)的固體培養(yǎng)基，將增菌培養(yǎng)后的標本與液態(tài)的固體培養(yǎng)基混合，然后冷卻凝固，制成帶有藥敏紙片的固態(tài)藥敏試驗標本，將其培養(yǎng)5-15天，通過指示劑的指示觀察藥物抑菌圈，確定對藥物的敏感性，本發(fā)明檢驗過程時間短，平均檢出時間10天左右且投資少、使用成本低、使用安全方便。
文檔編號C12M1/34GK102010886SQ20101026577
公開日2011年4月13日 申請日期2010年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月2日
發(fā)明者彭鈞 申請人:湖南省天騎醫(yī)學新技術(shù)有限公司