專利名稱：Udp-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的編碼基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的編碼基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
高山紅景天(Rhodiola sachalinensis A. Bor)又名庫頁紅景天，是景天科 (Crassulaceae)紅景天屬(Rhodiola rosea L.)植物，為多年生草本或亞灌木，常具肉 質(zhì)匍匐根狀莖，是長白山珍稀藥用植物之一。紅景天屬植物的主要活性成分為紅景天甙 (salidroside)和甙元酪醇(tyrosol)等，現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明紅景天甙具有明顯的 抗缺氧、抗寒冷、抗疲勞、抗輻射、抗病毒、延緩機(jī)體衰老等功效，對于航天、深海、沙漠、高 原、體育等行業(yè)是一種極具開發(fā)應(yīng)用前景的環(huán)境適應(yīng)藥物，同時(shí)對高輻射從業(yè)人員、微機(jī)使 用頻繁人員、強(qiáng)腦力勞動(dòng)者、中老年人群具有積極的滋補(bǔ)保健作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的編碼基因及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，人工合成，命名為RsmUGT73B6，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中的序列4的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中的序列4氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且具有UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶功能和/或與紅景天甙合成相關(guān)的由1)衍生 的蛋白質(zhì)。上述序列4由480個(gè)氨基酸殘基組成，上述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加為不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。所述蛋白質(zhì)的編碼基因RsmUGT73B6也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述編碼基因?yàn)槿缦?) -5)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列3所示的DNA分子；2)序列表中序列3自5’末端第1位到第1443位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列3自5’末端第4位到第1443位核苷酸所示的DNA分子；4)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼具有UDP-葡萄糖基 轉(zhuǎn)移酶功能和/或與紅景天甙合成相關(guān)的蛋白所示的DNA分子；5)與1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、 至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有 98%或至少具有99%同源性且編碼具有UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶功能和/或與紅景天甙合成 相關(guān)的蛋白所示的DNA分子。上述序列3由1564個(gè)核苷酸組成，OFR的序列為序列3的自5，末端第1-1443位 核苷酸序列。所述嚴(yán)格條件可為在0. IXSSPE(或0. 1XSSC)，0. 1 % SDS的溶液中，在65°C下雜 交，并用該溶液洗膜。
含有上述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、表達(dá)盒或重組病毒也是本 發(fā)明保護(hù)的范圍。所述重組載體為將上述編碼基因插入載體pET_30b (+)的NdeI和SalI識別位點(diǎn) 間得到的重組載體。擴(kuò)增上述編碼基因全長或任一片段的引物對也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述引物對 如下所示一條引物序列如序列表中序列5所示，另一條引物序列如序列表中序列6所示。上述蛋白質(zhì)在合成紅景大甙中的應(yīng)用，上述編碼基因在合成紅景天甙中的應(yīng)用都 是本發(fā)明要保護(hù)的范圍。所述合成紅景天甙為體外合成紅景天甙。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備苯亞甲基丙酮的方法。本發(fā)明提供的方法為以酪醇和UDP-葡萄糖為底物，在權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的催 化作用下，得到紅景天甙。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，采用定點(diǎn)突變(V361T/T373I/G376S)技術(shù)對UGT73B6進(jìn)行了 突變研究，UGT73B6的三聯(lián)體突變體命名為RsmUGT73B6，結(jié)果顯示，突變后的RsmUGT73B6紅 景天甙合成能力較UGT73B6提高了 1.9倍。RsmUGT73B6突變基因及其應(yīng)用為紅景天甙的生 物合成提供了直接有效的技術(shù)及應(yīng)用基礎(chǔ)。


圖1為RsmUGT73B6原核表達(dá)載體的構(gòu)建圖2為原核表達(dá)載體的NdeI和BamHI雙酶切鑒定圖3為UGT純化SDS-PAGE分析圖4為HPLC檢測結(jié)果
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、UGT73B6的定點(diǎn)突變的獲得1. UGT73B6的定點(diǎn)突變?nèi)斯ず铣蒛GT73B6 (序列表中的序列1)。UGT73B6 的定點(diǎn)突變(V361T/T373I/G376S)采用 QuikChange site-directed mutagenesis kit (購自Stratagene，Catalog#200518)試劑盒方法，具體突變引物如下(突 變位點(diǎn)用下劃線標(biāo)出)UGT73B6 V361T/T373I/G376S(5，-GGACCACCAGTCT ACCGGGGGTTTT GTGTCACATTGTGGATGGAACTCAATTTTGGAAAGTATCTCAGCAGGG-3’ )，模板為人工合成 UGT73B6， 進(jìn)行PCR得到的PCR產(chǎn)物，將該P(yáng)CR產(chǎn)物送去測序，結(jié)果表明，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序 列2的序列，該P(yáng)CR產(chǎn)物的基因命名為RsmUGT73B6，OFR為序列表中序列3的自5，末端第 1-1443位核苷酸，RsmUGT73B6編碼的蛋白命名為RsmUGT73B6，該蛋白的氨基酸序列為序列 表中的序列4。RsmUGT73B6與UGT73B6相比，突變位點(diǎn)為第1081-1083位由GTG突變?yōu)?ACC，第 1117-1119 位由 ACA 突變?yōu)?ATT，第 1126-1128 位由 GGT 突變?yōu)?AGT。RsmUGT73B6 與UGT73B6(序列2)相比，突變位點(diǎn)為第361位由Val (纈氨酸)突變?yōu)門hr(蘇氨酸)，第 373位由Thr (蘇氨酸)突變?yōu)镮Ie (異亮氨酸)，第376位由甘氨酸Gly突變?yōu)镾er (絲氨酸)。2. RsmUGT73B6異源表達(dá)和蛋白純化RsmUGT73B6cDNA的ORF使用含有特定限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的N-末端和C-末端引 物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。正義引物為5，-GGAATTCCATATGGGTTCTGAAACTCGGCC-3，(序列 5)，下 劃線表示 NdeI 酶切位點(diǎn)；反義引物為5，-CGGGATCCCTAGACTTTCTTTAACTTGAGTTCC-3’ (序 列6)，下劃線表示BamHI酶切位點(diǎn)。以步驟1)獲得的PCR產(chǎn)物(或人工合成的序列3) 為模板，進(jìn)行PCR，得到的PCR產(chǎn)物(序列2中自5’末端第4-1443為核苷酸序列)經(jīng) 過Ndel/BamHI雙酶切后，連接到經(jīng)過相同酶切的原核表達(dá)載體pET_30b (+) (Novagen, Darmstadt, Germany)上，獲得重組載體(圖1為載體結(jié)構(gòu)示意圖)，將重組載體進(jìn)行酶切 鑒定，結(jié)果如圖2(M，DL15000+2000Marker ;1-3，陽性質(zhì)粒。)所示，從圖中看出，得到約 1. 5Kb的DNA片段，將酶切鑒定結(jié)果正確的重組陽性質(zhì)粒測序，測序正確的重組載體命名為 pET-30b (+) -RsmUGT73B60 經(jīng)過測序，pET_30b (+) -RsmUGT73B6 為在 pET_30b (+)的 NdeI 和 BamHI識別位點(diǎn)間插入序列2中自5’末端第4-1443為核苷酸序列得到的，進(jìn)一步證明載體 構(gòu)建正確。將pET-30b(+)_RsmUGT73B6 轉(zhuǎn)入大腸桿菌 E. coli BL21_Rosetta(DE3) (TransGen, Beijing, China)菌株中，獲得重組菌，將重組菌提取質(zhì)粒后酶切鑒定，獲得大小 為 1. 5Kb 的 DNA 片段的重組菌命名為 BL21/pET-30b(+)-RsmUGT73B6。采用同樣的方法將空載體pET_30b(+)導(dǎo)入大腸桿菌Ε. coli BL21_Rosetta(DE3) (TransGen, Beijing, China)菌株中，獲得重組菌BL21/pET_30b (+)，再將該重組菌采用上 述方法發(fā)酵、純化獲得對照組蛋白。將BL21/pET-30b (+) -RsmUGT73B6 接入 IOml 含有卡那霉素(50 μ g ι Γ1)和氯霉素 (34 yg ml—1)的LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過夜，次日稀釋100倍接入200ml LB培養(yǎng)基中于37°C、 200rpm繼續(xù)培養(yǎng)至OD6tltl為0. 6-0. 8時(shí)，添加終濃度為ImM的IPTG，降溫至30°C，6h后，通 過離心收集菌體并重懸于3ml 0. IM磷酸鉀緩沖液(pH 7. 5)，超聲波冰上破碎菌體。冰上破 碎的菌體勻漿于4°C 10，OOOg下離心lOmin，收集上清。上清通過Ni2+-瓊脂糖柱(Novagen).用含有0. 5M NaCl and 40mM咪唑 (imidazole)的0. IM磷酸鉀緩沖液洗滌Ni2+-瓊脂糖柱三次后，用含有400mM imidazole的 0. IM磷酸鉀緩沖液洗滌洗脫，收集洗滌洗脫液，為了長期保持重組蛋白活性，再將洗脫緩沖 νβ PD-10 ft (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)10% (v/v)
的0. IM Tris-HCl (pH7. 5)置換緩沖液重新洗脫，收集洗脫液，得到重組蛋白RsmUGT73B6， 保存于_80°C。重組蛋白的純化效率用SDS-PAGE檢測。 組氨酸六聚體標(biāo)簽構(gòu)筑在重組蛋白的N末端上。將上述純化得到的重組蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖3 (M，分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，RsmUGT73B6純化結(jié)果；2，UGT73B6純 化結(jié)果)所示，結(jié)果顯示純化的重組蛋白在50kDa的位置上形成一個(gè)單一條帶。對照組蛋 白中未有目的蛋白條帶。實(shí)施例2、突變體的功能研究1、體外酶促反應(yīng)及產(chǎn)物分析250 μ 1標(biāo)準(zhǔn)體外酶促反應(yīng)體系包括50mM Tris-HCl緩沖液(pH 7. 5)，500 μ M酪醇(Sigma-Aldrich Catalog #79058)，2mM UDP-葡萄糖(Sigma-Aldrich Catalog冊4625) 和10 μ g由實(shí)施例1獲得的重組蛋白RsmUGT73B6。37°C反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后加入250 μ 1 甲醇，12000g離心lOmin，反應(yīng)產(chǎn)物用于HPLC分析。以實(shí)施例1獲得的重組蛋白UGT73B6 和對照組蛋白為對照。1個(gè)酶活力單位(U)定義為1小時(shí)內(nèi)催化酪醇產(chǎn)生Inmol紅景天甙的酶量。反應(yīng) 時(shí)間為60min，測定溫度為37°C。酶促產(chǎn)物的分析使用配備有Kromosil C18反相柱(5 μ m，250mmX4. 6mm ； Macherey Nage 1)的Waters Alliance 2695高效液相色譜系統(tǒng)(HPLC)完成。流動(dòng)相為水 (A)和甲醇(B)，流速為0. 6ml miiT1，使用以下梯度條件30% B3分鐘、30-70% B 27分鐘、 70-80% B 2分鐘、80-95% B 3分鐘以及95% B 5分鐘。檢測波長為275nm。用紅景天甙 標(biāo)準(zhǔn)品(上海同田生物技術(shù)有限公司，Catalog E-0069)進(jìn)行定量。對于高效液相色譜-質(zhì)譜分析，液相分離由Shimadzu LC-10ADvp HPLC系統(tǒng)完成。 質(zhì)譜測定由 Shimadzu LCMS-2010A質(zhì)譜系統(tǒng)完成(Shimadazu，Kyoto，Japan)。ShimadzuLC/ ESIMS-2010軟件系統(tǒng)完成數(shù)據(jù)采集和處理。液相色譜條件同前述。最適的質(zhì)譜條件如下 所有的m/z波普范圍設(shè)定在120-350 ；干燥氣體流速，1. 5L mirT1 ；CDL溫度，250°C ;block溫 度，200°C ；probe 電壓 +4. 5kV。酶促產(chǎn)物的定性及定量分析結(jié)果如圖4 (A為UGT73B6催化結(jié)果，B為RsmUGT73B6 催化結(jié)果)所示，顯示，RsmUGT73B6催化生成的紅景天甙的保留時(shí)間為8. 3分鐘，UGT73B6 催化生成的紅景天甙的保留時(shí)間為8. 3分鐘。RsmUGT73B6與酪醇A和UDP-葡萄糖共同在標(biāo)準(zhǔn)酶促反應(yīng)體系中孵育且酶促反應(yīng) 體系PH值為7. 5時(shí)，對于紅景天甙的合成，RsmUGT73B6的酶比活為4263U mg"1 ；UGT73B6的 的酶比活為1470U mg—1。因此，RsmUGT73B6能夠高效地生成紅景天甙為主產(chǎn)物，且活性遠(yuǎn)高 于UGT73B6。對照組蛋白沒有酶活性。質(zhì)譜檢測結(jié)果為紅景天甙標(biāo)準(zhǔn)品分子量為300. 31，RsmUGT73B6催化生成紅景天 甙的分子量為300. 3LUGT73B6催化生成紅景天甙的分子量為300. 31，表明，得到的物質(zhì)為
紅景天甙。證明RsmUGT73B6為尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。重組蛋白動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測定是在UDP-葡萄糖濃度飽和(濃度為2mM/l)的情況 下，用酪醇A介于其Km的0. 2-6. 0范圍內(nèi)的5個(gè)濃度值進(jìn)行計(jì)算獲得。實(shí)驗(yàn)使用上述標(biāo)準(zhǔn)的250 μ 1 0. IM磷酸鉀緩沖液反應(yīng)體系，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。反 應(yīng)體系的PH值為7. 5，上述反應(yīng)體系置于37°C下30分鐘后，加入終濃度為5%的甲醇，之后 用250 μ 1的乙酸乙酯抽提并于10，OOOg下離心10分鐘。取上清真空干燥后，加入50 μ 1 50% (ν/ν)的甲醇水溶液。HPLC測定條件同上。&和Vmax值由Lineweaver-Burke曲線的 結(jié)果得出。突變體RsmUGT73B6 酶活性(Vmax/Km)為 8. 88，UGT73B6 酶活性(Vmax/Km)為 4. 6 ；突 變體RsmUGT73B6較UGT73B6提高1. 9倍，RsmUGT73B6突變基因及其應(yīng)用為紅景天甙的生 物合成提供了直接有效的技術(shù)及應(yīng)用基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
一種蛋白質(zhì)，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中的序列4的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中的序列4氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有UDP 葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶功能和/或與紅景天甙合成相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦?)-5)中任一 所述的DNA分子1)序列表中序列3所示的DNA分子；2)序列表中序列3自5’末端第1位到第1443位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列3自5’末端第4位到第1443位核苷酸所示的DNA分子；4)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼具有UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移 酶功能和/或與紅景天甙合成相關(guān)的蛋白所示的DNA分子；5)與1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至 少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98% 或至少具有99%同源性且編碼具有UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶功能和/或與紅景天甙合成相關(guān) 的蛋白所示的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、表達(dá)盒或重 組病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為將權(quán)利要求2或3所 述編碼基因插入載體pET-30b(+)的多克隆位點(diǎn)間得到的重組載體。
6.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述編碼基因全長或任一片段的引物對；所述引物對如下所 示一條引物序列如序列表中序列5所示，另一條引物序列如序列表中序列6所示。
7.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)在合成紅景天甙中的應(yīng)用，或權(quán)利要求2或3所述編碼基因 在合成紅景天甙中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述合成紅景天甙為體外合成紅景天甙。
9.一種制備苯亞甲基丙酮的方法，其特征在于為以酪醇和UDP-葡萄糖為底物，在權(quán) 利要求1所述蛋白質(zhì)的催化作用下，得到紅景天甙。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的編碼基因及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，人工合成，命名為RsmUGT73B6，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中的序列3的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中的序列4氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與紅景天甙合成相關(guān)由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，采用定點(diǎn)突變(V361T/T373I/G376S)技術(shù)對UGT73B6進(jìn)行了突變研究，UGT73B6的三聯(lián)體突變體命名為RsmUGT73B6，結(jié)果顯示，突變后的RsmUGT73B6紅景天甙合成能力較UGT73B6提高了1.9倍。
文檔編號C12N15/63GK101942424SQ20101026196
公開日2011年1月12日 申請日期2010年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月24日
發(fā)明者葉和春, 師光祿, 王有年, 馬蘭青 申請人:北京農(nóng)學(xué)院