專利名稱：一種密碼子偏愛優(yōu)化的二羥基聯(lián)苯雙加氧酶基因rrbphci降解多氯聯(lián)苯的的生物學(xué)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種密碼子偏愛優(yōu)化的二羥基聯(lián)苯雙加氧酶基因降解多氯聯(lián)苯的生物學(xué)方法。
背景技術(shù)：
多氯聯(lián)苯是一種結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、毒性大和水溶性低的芳香族化合物，具有致癌、致突變和生殖發(fā)育毒性，是《斯德哥爾摩公約》中禁止使用的12種有機(jī)污染物之一。生物修復(fù)多氯聯(lián)苯(Polychlorinated biphenyls, PCBs)作為一種很有潛力的修復(fù)方法優(yōu)勢(shì)明顯。綜合考慮各種因素的生物修復(fù)系統(tǒng)也是將來的一個(gè)研究方向。微生物降解PCBs主要分為兩個(gè)方向，即好氧菌的氧化作用和厭氧菌的還原脫氯作用Furukawa，J Gen Appl Microbiol, 2000,46 :283-296。近年來，許多研究都集中在分離降解PCBs的菌株上，分析降解PCBs的機(jī)理，分離相關(guān)基因，然后進(jìn)一步改造基因構(gòu)建新的降解工程菌株。PCBs的降解是一系列聯(lián)苯降解酶控制輔助代謝的過程Abramowicz，Cri Rev Biotech,1990，10 :241-251 ；Furukawa, Biodegradation,1994,5 :289_300。這些酶主要分為四類，包括聯(lián)苯雙加氧酶(BphA)，二氫二羥基脫氫酶(BphB)，2，3 二羥基雙加氧酶 (BphC)和水解酶(BphD)Furukawa 和 Fuiihara，J Biosci Bioeng，2008，105 :433_449。 這一系列酶是由bph的基因簇編碼的，根據(jù)基因的結(jié)構(gòu)該家族可以分為四類Hong等， Int BiodeterBiodegr, 2009,63 :365-370。第一類 bph 基因簇是在 Burkholderia sp.LB400Erickson 禾口 Mondello，J Bact,1992,174:2903-2312 ；Hofer 等，Gene, 1994,144:9-16
禾口 Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 [Furukawa 禾口 Miyazaki, Bacteriol，1986，166 :392-398]中間發(fā)現(xiàn)的，包含 bphRAlA2A3A4BCKHJID 基因；第二類基因簇(bphSEGFAlA2A;3BCDA4)是在 Achromobactergeorgiopolitanum strain KKS10Kimbara 等，J Bact，1989，171 :2740-2747 ；Kikuchi 等，J Bact，1994，176 :4269_4276和 Alcaligenes eutrophus ASpringael 等，J Bact,1993,175 :1674-1681 ；Mouz 等，Mol gen genet, 1999,262 :790-799中發(fā)現(xiàn)的；第三類由bphAlA2A3A4CBST組成的基因簇是在 Rhodococcus sp.strain RHAlMasai ·， Appl Environ Micro，1995，61 :2079_2085胃現(xiàn)的；最近一種新的 bph 基因簇(bphBCAlA2A3A4D)在 Rhodococcus sp. strain R0Yang 等，J Appl Micro，2007，103 :2214-2224和 Rhodococcus sp.strain K3Taguchi 等， Biosci Biotechnol Biochem, 2007, 71 :1136_1144中被發(fā)現(xiàn)，而且與過去報(bào)道的基因簇不同，故歸類為第四種bph家族。為了提高微生物降解PCBs的能力，許多科研工作者將目光對(duì)準(zhǔn)了基因，從基因下手，改造基因，從而改變這些基因編碼酶的氨基酸序列，然后適當(dāng)?shù)睾Y選，從而獲得降解能力更強(qiáng)的菌株。Erickson禾口 Mondello利用定點(diǎn)突變技術(shù)(site-directed mutagenesis), 將I^seudomonas sp. strain LB400的bphA基因突變，使得突變后的菌株比原先菌株擁有更廣泛的底物特異性，而且提高了降解能力。也表明了聯(lián)苯雙加氧酶(BphA)的氨基酸亞基在底物選擇性上起著有很重要的作用Erickson和Mondello，Appl Environ Microbiol, 1993,59 :3858_3862。Suenaga 等利用 DNA 改組技術(shù)(DNA shuffling)對(duì) Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 禾口 Burkholderia cepacia LB400 的相關(guān)基因進(jìn)行了改組，獲得聯(lián)苯雙加氧酶突變庫(kù)，利用大腸桿菌表達(dá)進(jìn)行突變聯(lián)苯雙加氧酶篩選， 獲得顯著對(duì)苯、甲苯和烷基苯降解能力顯著提高的突變菌株Suenaga等，J Bacteriol, 2001，183 :5441-5444。同時(shí)利用引物隨機(jī)重組技術(shù)(Random priming recombination)對(duì) Pseudomonas pseudoalcaligenesKF707的相關(guān)基因進(jìn)行了功能進(jìn)化，獲得多功能的雙加氧酶，突變酶不僅僅可以降解多氯聯(lián)苯，而且可以降解其它一些類似物Suenaga等，J Biol Chem, 2001, 276 :22500-22506。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種密碼子偏愛優(yōu)化的二羥基聯(lián)苯雙加氧酶基因RRBPHCI降解多氯聯(lián)苯的生物學(xué)方法，根據(jù)本發(fā)明方法，可獲得一種降解多氯聯(lián)苯微生物基因工程菌株，并將其應(yīng)用于降解多氯聯(lián)苯。所述密碼子偏愛優(yōu)化的二羥基聯(lián)苯雙加氧酶基因RRBPHCI在制備降解多氯聯(lián)苯工程菌株中的應(yīng)用，具體包括以下步驟首先，構(gòu)建二羥基聯(lián)苯雙加氧酶基因RRBPHCI的熒光假單胞菌表達(dá)基因載體；其次，對(duì)含有該二羥基聯(lián)苯雙加氧酶基因RRBPHCI的熒光假單胞菌表達(dá)載體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化； 最后，對(duì)上述所得轉(zhuǎn)化子降解二羥基聯(lián)苯結(jié)果進(jìn)行測(cè)定。所述二羥基聯(lián)苯雙加氧酶基因RRBPHCI的合成采取PTDS方法Xiong，aisheng 等，2004，Nucl Acids Res 32，e98，共設(shè)計(jì)22根引物用于基因的合成，每個(gè)引物的長(zhǎng)度為 60bp。參見表1。引物兩端分別引入BamH I和Mc I的酶切位點(diǎn)。引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成(http://www. sanRRon, com/)。表 權(quán)利要求
1.一種密碼子偏愛優(yōu)化的二羥基聯(lián)苯雙加氧酶基因RRBPHCI降解多氯聯(lián)苯的生物學(xué)方法，其特征在于，包括以下步驟首先，構(gòu)建二羥基聯(lián)苯雙加氧酶基因RRBPHCI熒光假單胞菌表達(dá)基因載體； 其次，對(duì)含有二羥基聯(lián)苯雙加氧酶基因RRBPHCI表達(dá)載體熒光假單胞菌進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化；最后，對(duì)上述所得轉(zhuǎn)化子降解二羥基聯(lián)苯結(jié)果進(jìn)行測(cè)定。
2.權(quán)利要求1所述方法在制備降解多氯聯(lián)苯微生物基因工程菌株中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述方法在降解多氯聯(lián)苯中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種密碼子偏愛優(yōu)化的二羥基聯(lián)苯雙加氧酶基因RRBPHCI降解多氯聯(lián)苯工程菌株的生物學(xué)方法，具體包括以下步驟首先，構(gòu)建密碼子偏愛優(yōu)化的二羥基聯(lián)苯雙加氧酶基因RRBPHCI熒光假單胞菌表達(dá)載體；其次，對(duì)含有該偏愛密碼子優(yōu)化的二羥基聯(lián)苯雙加氧酶基因RRBPHCI的熒光假單胞菌表達(dá)載體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化；最后，對(duì)上述所得轉(zhuǎn)化子降解2，3-二羥基聯(lián)苯結(jié)果進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)本發(fā)明方法表明構(gòu)建熒光假單胞菌表達(dá)載體能夠顯著提高二羥基聯(lián)苯的降解能力。本發(fā)明方法可用于制備降解多氯聯(lián)苯微生物基因工程菌株。
文檔編號(hào)C12R1/39GK102373228SQ20101025220
公開日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2010年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月12日
發(fā)明者付曉燕, 姚泉洪, 帥建軍, 彭日荷, 朱波, 熊愛生, 田永生, 許晶, 趙偉, 金曉芬, 陳晨, 韓紅娟 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院