專利名稱：魔芋軟腐病病原菌拮抗菌快速分離方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種魔芋軟腐病病原菌拮抗菌快速分離的方法，屬于植物病害防治技 術領域。本發(fā)明所述的魔芋軟腐病病原菌是由軟腐歐式桿菌(Pectobacterium Species) 侵染引起。
背景技術：
魔芋是單子葉多年生草本植物，主要分布在東南亞和非洲。魔芋球莖中富含的葡 苷聚糖使其在食品、醫(yī)藥、化工和農(nóng)業(yè)中具有廣泛的應用。隨著魔芋加工產(chǎn)業(yè)對原料需求 日益旺盛，種植面積不斷擴大，而軟腐病的發(fā)生也越來越嚴重，已成為魔芋產(chǎn)業(yè)發(fā)展主要障 礙。目前，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中對軟腐病的防治主要有農(nóng)業(yè)防治與化學防治。農(nóng)業(yè)防治效果并 不顯著，同時可調控性較差。因此，化學防治是目前應用最為普遍和廣泛的防治方法，但是 化學藥劑的毒副作用，往往帶來環(huán)境污染和生態(tài)破壞。尋找新的防治途徑和方法來解決軟 腐病的危害成為迫在眉睫的事。生物防治在病害防治方面開辟了新天地，同時符合環(huán)境保護、綠色食品生產(chǎn)和農(nóng) 業(yè)可持續(xù)發(fā)展的方針。生物防治技術就是把自然狀態(tài)下，病原微生物存在拮抗作用或競爭 關系的極少量微生物，通過人工篩選培養(yǎng)、繁殖后，再用到作物上，增大拮抗菌的種群量?；?是將拮抗菌中起作用的有效成分分離出來，以工業(yè)化大批量生產(chǎn)，作為農(nóng)藥使用，達到防治 病害的目的。前者稱微生物農(nóng)藥，后者為農(nóng)藥抗菌素。近幾年，不少研究者開始嘗試開發(fā)生 物制劑來防治魔芋軟腐病。如云南大學姬廣海等人采用解淀粉芽孢桿菌C3及其發(fā)酵液制 成針對魔芋軟腐病的生物制劑(ZL200510048755)；取得了高于46. 7%的防效及其一定的 增產(chǎn)作用，但該方法由于存在制備技術要求高以及生物安全性有待考證，植株一旦感病一 樣很難控制等多方面原因，尚未得到廣泛的應用。關于魔芋軟腐病菌生物防治的報道極少，僅周盈等從魔芋愈傷組織繼代培養(yǎng)中出 現(xiàn)的細菌中篩選到了一株能抑制魔芋軟腐病病原菌生長的枯草芽孢桿菌。但植物各個生長 階段的內生菌數(shù)量和種類各有不同，且篩選高效和活性穩(wěn)定的拮抗菌株是保證生物防治獲 得成功的先決條件。自然界中微生物種類及其豐富，如何快速有效的獲得魔芋軟腐病病原 菌拮抗菌的報道尚未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種魔芋軟腐病病原菌拮抗菌快速分離的方法。利用 一物降一物的自然規(guī)律，通過分離感染軟腐病魔芋組織的細菌，縮小拮抗菌的篩選范圍。本 發(fā)明具有操作簡便、方法易行、能快速有效的篩選出抗魔芋軟腐病病原菌拮抗菌，同時為其 他作物拮抗菌快速篩選提供了思路。為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術措施一種魔芋軟腐病病原菌拮抗菌快速分離的方法，其步驟是
A、標樣選擇選取具有典型軟腐病癥狀的魔芋組織，在發(fā)病擴展前沿病健交界處， 切割0. 5-1. 5cm組織塊；B、組織消毒將組織塊用自來水沖洗，選用75% (體積比)酒精消毒60-90S，然后 用無菌水沖洗2-4次，在放有吸水紙的托盤上用手術刀在無菌操作臺上切成0. 5X0. 5cm左 右的組織塊，接到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上；C、細菌的獲得將組織塊周邊長出的菌采用平板劃線分離法進行分離，24-28°C培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72h后觀察，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等細菌培養(yǎng)性狀，挑選單菌落，然后將細菌 純培養(yǎng)保存；D、軟腐病病原菌的篩選將獲得的純培養(yǎng)細菌接種到歐文氏菌具有特色的結晶紫 聚果膠選擇性培養(yǎng)基(CVP)上，24-28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72h后觀察，菌體凹陷生長的為軟 腐病病原菌；E、采用點接法進行拮抗菌的初篩將營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)的濃度為 IX IO8CfuAil的魔芋軟腐病病原菌菌懸液0. Iml涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，然后在每 個平板上用無菌牙簽均勻接種四個從魔芋軟腐病病建交接處分離到的非軟腐病病原菌，每 個接菌平板平行做三份。本實驗步驟重復三次。30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后測定其抑菌 圈直徑；F、采用牛津杯法進行拮抗菌的復篩將初篩的拮抗菌株在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中 200r/min, 30°C培養(yǎng)2d，發(fā)酵液6000g離心20min，上清液用0. 22 μ m微孔濾膜過濾，經(jīng)營養(yǎng) 瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)無菌落生成，視為無菌濾液。取過夜培養(yǎng)的濃度為IX 108CfU/ml魔芋軟腐 病病原菌菌懸液0. Iml均勻涂于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，在每個平板上擺放四個牛津杯，然后 在每個牛津杯中加入0. 2ml的供試拮抗菌無菌濾液。每個平板牛津杯加入拮抗菌無菌濾液 的處理平行做三份，以上實驗步驟重復三次。30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后測定其抑菌圈 直徑。本方法的有益效果利用一物降一物的自然規(guī)律，通過分離感染軟腐病魔芋組織 的細菌，縮小拮抗菌的篩選范圍，利用該方法在分離到的20余份非軟腐病病原菌中有9個 是拮抗菌，通過拮抗菌的熱穩(wěn)定性、抑菌范圍等指標，篩選出了 2株具有應用潛力的魔芋軟 腐病病原菌拮抗菌(一株為芽孢桿菌，一株為熒光假單胞桿菌)。土壤微生物及其豐富，細 菌占土壤微生物總量的70% _90%，要從土壤中篩選到病原菌的拮抗菌，一般要挑選上百 種細菌，具有一定的盲目性。用該方法分離的魔芋軟腐病病原菌拮抗菌，操作簡單，簡單易 行，成本低。該方法除用于分離魔芋軟腐病病原菌的拮抗菌外，還可廣泛用于分離其他作物 病害拮抗菌。
具體實施例方式實施例1 一種魔芋軟腐病病原菌拮抗菌快速分離的方法，其步驟是A、標樣選擇選取具有典型軟腐病癥狀的魔芋組織，在發(fā)病擴展前沿病健交界處， 切割0. 5-1. 5cm組織塊；B、組織消毒將組織塊用自來水沖洗，選用75% (體積比)酒精消毒60或70或 80或90s，然后用無菌水沖洗2或3或4次，在放有吸水紙的托盤上用手術刀在無菌操作臺
4上切成0. 5X0. 5cm左右的組織塊，接到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上；C、細菌的獲得將組織塊周邊長出的菌采用平板劃線分離法進行分離，24-28°C培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)48或51或54或57或60或64或67或70或72h后觀察，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色 等細菌培養(yǎng)性狀，挑選單菌落，然后將細菌純培養(yǎng)保存；D、軟腐病病原菌的篩選將獲得的純培養(yǎng)細菌接種到歐文氏菌具有特色的結晶紫 聚果膠選擇性培養(yǎng)基(CVP)上，24或25或26或27或28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48或50或53或 56或59或61或63或66或69或72h后觀察，菌體凹陷生長的為軟腐病病原菌；E、采用點接法進行拮抗菌的初篩將營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)的濃度為 IX IO8CfuAil的魔芋軟腐病病原菌菌懸液0. Iml涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，然后在每 個平板上用無菌牙簽均勻接種四個從魔芋軟腐病病建交接處分離到的非軟腐病病原菌。每 個接菌平板平行做三份。本實驗步驟重復三次。30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后測定其抑菌 圈直徑；F、采用牛津杯法進行拮抗菌的復篩將初篩的拮抗菌株在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中 200r/min, 30°C培養(yǎng)2d，發(fā)酵液6000g離心20min，上清液用0. 22 μ m微孔濾膜過濾，經(jīng)營養(yǎng) 瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)無菌落生成，視為無菌濾液。取過夜培養(yǎng)的濃度為IX 108CfU/ml魔芋軟腐 病病原菌菌懸液0. Iml均勻涂于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，在每個平板上擺放四個牛津杯，然后 在每個牛津杯中加入0. 2ml的供試拮抗菌無菌濾液，每個平板牛津杯加入拮抗菌無菌濾液 的處理平行做三份。本實驗步驟重復三次。30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后測定其抑菌圈直 徑。所述的CVP培養(yǎng)基的配制將攪碎器預加熱，在1 OOOml煮沸的蒸餾水，將以 下成分依次加入，用低速攪拌。10% (質量比)結晶紫的水溶液2.0ml、lmol/l氫氧 化鈉(NaOH) 9. OmlU % (質量比)新鮮配制的氯化鈣(CaCl2 · 2H20) 9ml、瓊膠4g、硝酸(NaN03)2g>(Polygalacturonic acid sodiumsalt from citrus fruit) 18g加入，高速攪拌15s，分裝三角瓶中于121°C滅菌15min后立即倒入培養(yǎng)皿(由于 聚果膠酸鈉極易凝固，且加熱不易溶解，所以必須趁熱倒平板)，制成平板干燥后使用。所述的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的配方為牛肉膏3g、蛋白胨lO.Og、氯化鈉5.0g、瓊脂 20g、水1000ml。在燒杯中加水，稱取牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉和瓊脂，加熱(100°C )溶化后， 調節(jié)PH值至7. 0-7. 2。分裝，121°C滅菌20min。所述的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的配方為牛肉膏3g、蛋白胨10.0g、氯化鈉5. OgjK 1000ml。在燒杯中加水，稱取牛肉膏、蛋白胨和氯化鈉，加熱(100°C )溶化后，調節(jié)pH值至 7.0-7.2。分裝，121°C滅菌 20min。
權利要求
一種魔芋軟腐病病原菌拮抗菌快速分離的方法，其步驟是A、標樣選擇選取軟腐病癥狀的魔芋組織，在發(fā)病擴展前沿病健交界處，切割0.5 1.5cm組織塊；B、組織消毒將組織塊用自來水沖洗，選用75％體積比酒精消毒60 90s，然后用無菌水沖洗2 4次，在放有吸水紙的托盤上用手術刀在無菌操作臺上切成0.5×0.5cm的組織塊，接到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上；C、細菌的獲得將組織塊周邊長出的菌采用平板劃線分離法進行分離，24 28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 72h后觀察，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色細菌培養(yǎng)性狀，挑選單菌落，然后將細菌純培養(yǎng)保存；D、軟腐病病原菌的篩選將獲得的純培養(yǎng)細菌接種到歐文氏菌具有特色的結晶紫聚果膠選擇性培養(yǎng)基上，24 28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 72h后觀察，菌體凹陷生長的為軟腐病病原菌；E、采用點接法進行拮抗菌的初篩將營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)的濃度為1×108cfu/ml的魔芋軟腐病病原菌菌懸液0.1ml涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，然后在每個平板上用無菌牙簽均勻接種四個從魔芋病建交接處分離到的非軟腐病病原菌，每個接菌平板平行做三份，本步驟重復三次，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后測定其抑菌圈直徑；F、采用牛津杯法進行拮抗菌的復篩將初篩的拮抗菌株在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中200r/min，30℃培養(yǎng)2d，發(fā)酵液6000g離心20min，上清液用0.22μm微孔濾膜過濾，經(jīng)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)無菌落生成，為無菌濾液，取過夜培養(yǎng)的魔芋軟腐病病原菌菌懸液濃度為1×108cfu/ml的0.1ml均勻涂于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，在每個平板上擺放牛津杯，在每個牛津杯中加入0.2ml的供試拮抗菌無菌濾液，每個平板牛津杯加入拮抗菌無菌濾液的處理平行做三份，本步驟重復三次，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后測定其抑菌圈直徑。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種魔芋軟腐病病原菌拮抗菌快速分離的方法，其特征在 于所述的培養(yǎng)基為將攪碎器預加熱，在IOOOml煮沸的蒸餾水，將以下成分依次加入，用 低速攪拌。10%質量比結晶紫的水溶液2. OmlUmol/1氫氧化鈉9. 0ml、1 %質量比配制的氯 化鈣9ml、瓊膠4g、硝酸鈉2g、隨后將聚果膠酸鈉18g加入，高速攪拌15s，分裝三角瓶中于 121°C滅菌15min后倒入培養(yǎng)皿，制成平板干燥后使用。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種魔芋軟腐病病原菌拮抗菌快速分離的方法，其特征 在于所述的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基為牛肉膏3g、蛋白胨10. 0g、氯化鈉5. 0g、瓊脂20g、蒸餾 水1000ml，在燒杯中加水，稱取牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉和瓊脂，加熱溶化后，調節(jié)pH值至 7. 0-7. 2，分裝，121°C滅菌 20min。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種魔芋軟腐病病原菌拮抗菌快速分離的方法，其特征在 于所述的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基為牛肉膏3g、蛋白胨10. 0g、氯化鈉5. 0g、蒸餾水1000ml，在 燒杯中加水，稱取牛肉膏、蛋白胨和氯化鈉，加熱溶化后，PH值7. 0-7.2，分裝，1211滅菌 20mino
全文摘要
本發(fā)明公開了一種魔芋軟腐病病原菌拮抗菌快速分離的方法，其步驟是A、取感染軟腐病的魔芋組織；B、病健交界處組織表面消毒后接到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上；C、將組織邊長出的細菌劃線，挑單菌落純化、保存；D、采用歐文氏菌具有特色的結晶紫聚果膠選擇性培養(yǎng)基(CVP)篩選魔芋軟腐病病原菌；E、采用點接法進行拮抗菌的初篩；F、采用牛津杯法進行拮抗菌的復篩。本發(fā)明具有操作簡便、方法易行、能快速有效的篩選出抗魔芋軟腐病病原菌拮抗菌，同時為其他作物病害拮抗菌快速篩選提供了思路。
文檔編號C12N1/00GK101892156SQ201010221539
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月2日 優(yōu)先權日2010年7月2日
發(fā)明者向發(fā)云, 吳金平, 宋志紅, 曾祥國, 顧玉成 申請人:湖北省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所