專利名稱：一種防治雞球蟲病的活載體疫苗制備方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明提供一種具有防治雞球蟲病的活載體疫苗制備方法及其用途。
背景技術：
雞球蟲病是一種對養(yǎng)雞業(yè)危害很大的原蟲病，集約化養(yǎng)雞場是球蟲病爆發(fā)的最適 宜場所，78. 7 %的集約化養(yǎng)雞場存在著不同程度的感染，全世界因雞球蟲病造成的經(jīng)濟損 失每年約20億英鎊(Lee，2010)。雞球蟲病主要由一種或幾種艾美耳球蟲傳染造成，主要 由艾美耳屬球蟲寄生于雞腸道上皮細胞內(nèi)所引起的一種寄生性原蟲?。欢喟l(fā)于3月齡以內(nèi) 的仔雞，尤以15日齡 50日齡的雛雞最易感染；溫暖潮濕的月份多發(fā)，冬季發(fā)病較少?；?急性型球蟲病，病程數(shù)日至2 3周，多數(shù)雞于發(fā)病后6 IOd死亡，雛雞死亡率為50 %。 慢性型多發(fā)生于4 6月份，成雞病程緩慢，死亡率較低。其發(fā)病率可達100%，病死率為 20% 30%，嚴重者可高達80%。搞好雞舍的環(huán)境衛(wèi)生是防制球蟲病的中心環(huán)節(jié)，藥物預防是防制球蟲病的重要手 段。自從Levine發(fā)現(xiàn)磺胺類藥物具有抗球蟲作用以來，用作預防球蟲的藥物有50多種。按 其化學結構和生產(chǎn)過程大致分為三大類一類是聚醚類離子載體抗生素，另一類是化學合 成類抗球蟲藥，第三類是中草藥制劑。由于化學藥物防治球蟲病存在著抗藥性，用藥方法不 當和藥物殘留等缺點及免疫預防尚存的不足，人們嘗試著開發(fā)中草藥資源，用以防治雞球 蟲病，一些研究表明，中草藥不僅有抑殺球蟲的作用，而且還能增強雞體的免疫功能，促進 雞的生長發(fā)育，提高增重率和生產(chǎn)性能。目前已經(jīng)研究利用和開發(fā)了多種中草藥抗球蟲劑， 防治球蟲病效果明顯(晉愛蘭，2009，李旭紅and劉毅，2009)。又如專利200910304688. 1 公開了一種治療雞寄生球蟲病的中藥組合物，其組合物吸收快、安全系數(shù)高，無藥殘、無毒 副作用，不會產(chǎn)生抗藥性。但由于目前我國中草藥存在著提取復雜、研究程度的限制和研究 技術、經(jīng)費投入等的不足，仍難以看到突破性進展的曙光。使用強毒苗和致弱球蟲苗接種預防不失為一種手段，但強毒苗僅適用于種雞，不 完全適用于蛋雞和肉雞，肉雞雖可用弱毒球蟲苗，便又存在穩(wěn)定性差，接種量難于控制，費 用高等問題。球蟲細胞表面抗原直接與宿主細胞接觸，參與球蟲侵入宿主細胞及其后的內(nèi) 化過程，并作為主要抗原成分激發(fā)宿主的免疫反應，所以是研制重組疫苗理想的候選抗原。 子孢子表面抗原是指在孢子生殖過程中表達的抗原，研究較多的主要有3-1E、cSZl (覃宗 華，2005)、cSZ2 (Shah, 2010)、TA4 (Xu，2008，張莉，2006)等，其中 3-1E 在子孢子和裂殖子階 段均有表達。如專利200510108341. 1公開了利用雞球蟲的3-1E基因等構建了融合基因和 嵌合疫苗，并制備了融合蛋白；Song等(2000)將雞堆型艾美耳球蟲(E.acervUlina)3-lE 抗原基因的cDNA插入載體pMP13，構建成DNA疫苗，E. acervulina攻蟲后檢測到較高的 循環(huán)抗體水平(Lillehoj, 2000) 0 Lillehoj等(2005)將3-1E基因分別與白介素IL-1、 IL-2、IL-6、IL-8、IL-18及Y -干擾素等細胞因子佐劑連接，重組體有明顯的免疫保護作 用(Lillehoj，2005)。覃宗華等(2005)在成功克隆E. acervulina廣東株(⑶)子孢子表 面保護性抗原基因cSZl的基礎上，構建了表達cSZl的重組減毒沙門氏菌，而后以108或109CFU/只經(jīng)口免疫4日齡雛雞，25日齡時2個試驗組均能誘導腸道特異性IgA的分泌； 且分別能降低25. 和46. 4%的卵囊產(chǎn)生(覃宗華，謝明權，2005)；相似的是，Shah等以 cSZ2構建DNA疫苗，結果表明CSZ2DNA疫苗能誘導免疫反應，通過減少腸損害，體量減輕和 卵囊率并形成了區(qū)部的保護(Shah, Yan, 2010) 0 Xu等(2006)將Ε. tenella 3-1E抗原基因 和雞Y-干擾素基因融合形成嵌合基因(prolE)，構建了嵌合DNA疫苗和嵌合蛋白(rlE)， 研究表明與DNA疫苗(proE)，DNA疫苗(prolE)能更大程度上減少卵囊脫落，但DNA疫苗 (prolE)未能增加抗體滴度和體重；但嵌合蛋白(rlE)則更大程度上減少卵囊脫落，同時也 能增加抗體滴度和體重(Xu，2006)?？梢?，球蟲的免疫保護作用越來越受到人們的重視，尤 其以子孢子抗原或基因的重組生物制劑效果最佳。然而在規(guī)?；B(yǎng)殖中，重組蛋白保護效果卻不盡人意，尤其通過口服途徑，抗原在 消化道降解、吸收率低等原因造成保護劑量的不足。以上文獻和專利公開的生產(chǎn)疫苗，采用了在弱毒疫苗、DNA疫苗、重組蛋白和中草 藥復劑來提高雞的免疫保護作用。而利用弱毒疫苗，有毒力返強的危險，抗體維持時間不 長，有的疫苗由于減毒不徹底，有一定的副作用和不利于運輸保存；DNA疫苗產(chǎn)生安全性問 題，包括可能致癌和產(chǎn)生DNA抗體及基因漂移等；重組蛋白存在制作過程復雜、成本較高和 疫苗需低溫保存等缺點；而中草藥存在提成本高、作用機制復雜等缺陷。上文中提及的參考文獻具體如下1. Lee, B. H.，W. H. Kim, J. Jeong, J. Yoo, Y. K. Kwon, B. Y. Jung, J. H. Kwon, H.S.Li 1Iehoj, and W. Min, Prevalence and Cross-Immunity of Eimeria Species on Korean Chicken Farms. JVet Med Sci, 2010. (L ee, B. H. , W. H. Kim, J. Jeong, J. Yoo, Y. K. Kwon, B. Y. Jung, J. H. Kwon, H. S. Lillehoj，和 W. Min，不同艾美球菌在韓國雞場的流行 和交叉免疫.J Vet Med Sci,2010.)2.晉愛蘭，陳秀真，張供領，李亞峰，許騰，and萬雙秀，中藥常山及其組方與西藥 對雞球蟲病的療效對比試驗.中國動物檢疫，2009 (008) :p. 56-57.3.李旭紅和劉毅，中草藥復方制劑抗雞球蟲效果的研究.湖南農(nóng)業(yè)科學， 2009(005) :p. 146-148.4.覃宗華，謝明權，蔡建平，艾哈邁德，and葉秀華，堆型艾美耳球蟲cSZl基因在減 毒沙門氏菌的表達及免疫保護效果研究.寄生蟲與醫(yī)學昆蟲學報，2005. 12(001) :p. 6-13.5. Shah, Μ. Α. , R. Yan, L. Xu, Χ. Song, and X.Li, A recombinant DNA vaccine encodingEimeria acervulina cSZ-2 induces immunity against experimental E. tenella infection. VetParasitol，2010. 169(1—2) :p. 185—9. (Shah,M. A. , R. Yan,L. Xu, X. Song,和X. Li，編碼堆形艾美耳球蟲cSZ-2的重組DNA疫苗誘導免疫抵抗柔嫩艾美耳球蟲 侵染.Vet Parasitol, 2010. 169(1-2) :ρ· 185-9.)6. Xu, Q. , X. Song, L. Xu, R. Yan, Μ. Α. Α. Shah, and Χ. Li, Vaccination of chickens witha chimeric DNA vaccine encoding Eimeria tenella TA4 and chicken IL-2 induces protectiveimmunity against coccidiosis. Veterinary parasitology, 2008. 156(3-4) :p. 319-323. (Xu, Q.，X. Song, L. Xu, R. Yan, M. A. A. Shah，和 X. Li，接種編碼 柔嫩艾美耳球蟲TA4和雞IL-2的嵌合DNA疫苗的雞誘導保護免疫抵抗球蟲病.Veterinary parasitology,2008. 156(3—4) :ρ·319—323.)
7.張莉，秦澤榮，崔尚金，何召慶，and劉尚高，柔嫩艾美耳球蟲TA4抗原基因cDNA 在乳酸乳球菌中的克隆與表達.中國預防獸醫(yī)學報，2006. 28(003) :p. 271-274.8. LilIehoj, H. S.，K. D. Choi, Μ. C. Jenkins, V. N. Vakharia, K. D. Song, J. Y. Han, and E. P. Lillehoj, A recombinant Eimeria protein inducing interferon-gamma production comparison ofdifferent gene expression systems and immunization strategies for vaccination againstcoccidiosis. Avian Dis,2000. 44(2) :p. 379-89. (Lillehoj, H. S. ， K. D. Choi, M. C. Jenkins, V. N. Vakharia, K. D. Song, J. Y. Han,禾口 Ε. P. Lillehoj，重組艾美球菌蛋白誘導λ干擾素產(chǎn)生比較疫苗抵抗球菌病的不同基因表 達系統(tǒng)和免疫策略· Avian Dis, 2000. 44(2) :ρ· 379-89.)9. Lillehoj, H. S.，X. Ding, R. A. Dalloul, Τ. Sato, Α. Yasuda, and Ε. P. Lillehoj, Embryovaccination against Eimeria tenella and Ε. acervulina infections using recombinant proteins andcytokine adjuvants. J Parasitol,2005. 91(3) :p.666-73. (Lillehoj, H. S. , X. Ding, R. A. Dalloul, T. Sato, A. Yasuda,禾口 Ε· P. Lillehoj, Embryo.利用 重組蛋白和細胞因子佐劑的胚胎接種疫苗抵抗柔嫩艾美耳球蟲和堆形艾美耳球蟲侵染.J Parasitol, 2005. 91(3) :ρ· 666—73.)10. Xu, S. Ζ. , Τ. Chen,and Μ. Wang,Protective immunity enhanced by chimeric DNAprime-protein booster strategy against Eimeria tenella challenge. Avian Dis, 2006. 50(4) :p. 579-85. (Xu，S. Z.，T. Chen，and M. Wang，通過嵌合 DNA 主要蛋白增強策略增 加保護免疫抵抗柔嫩艾美耳球蟲侵染.Avian Dis, 2006. 50(4) :p. 579-85.)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種使用安全且能有效防治雞球蟲病的活載體 疫苗及相應的口服生物制劑。為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種防治雞球蟲病的活載體疫苗的制備方 法將柔嫩艾美耳球蟲子孢子抗原基因3-1E基因的成熟肽與枯草芽孢桿菌的表達載體相 連獲重組表達載體，再將重組表達載體轉入枯草芽孢桿菌宿主獲得重組菌株，培養(yǎng)該重組 菌株，即得防治雞球蟲病的活載體疫苗。作為本發(fā)明的防治雞球蟲病的活載體疫苗的制備方法的改進，其包括以下步驟1)、將3-1E基因的目的片段克隆入載體pMD18T vector，得到含有3-1E基因的克 隆載體，命名為PMD18T-3-1E ；2)、選用枯草芽孢桿菌表達載體pBES ；3)、將3-1E基因從PMD18T-3-1E用限制性內(nèi)切酶Xba I與Pst I酶切下來，得到 酶切產(chǎn)物；再用限制性內(nèi)切酶Xba I與Pst I將枯草芽孢桿菌表達載體pBES酶切后，將上 述酶切產(chǎn)物用T4 DNA連接酶與酶切后的枯草芽孢桿菌表達載體pBES連接；得連接產(chǎn)物；4)、將上述步驟3)所得的連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞，挑取長出的 單菌落搖菌、進行菌落PCR驗證；得到含有3-1E的重組質粒，命名為ρ BES-3-1E ；5)、將上述pBES-3-lE在枯草芽孢桿菌1A751中轉化和涂板；得活載體疫苗。本發(fā)明還同時提供了上述活載體疫苗的用途用于預防和/或治療雞球蟲病。本發(fā)明還同時提供了利用上述活載體疫苗制成的防治雞球蟲病的口服生物制劑，
5該口服生物制劑由活載體疫苗和載體組成，每克口服生物制劑中含有活菌數(shù)為IO8Cfu IO9Cfu的活載體疫苗。作為本發(fā)明的防治雞球蟲病的口服生物制劑的改進載體由重量比為5-50%的 沸石粉和50-95%的玉米淀粉組成。沸石粉和玉米淀粉均能過80 200目篩。在本發(fā)明中，活載體疫苗可按照本發(fā)明提供的方法制備，沸石粉和玉米淀粉均能 通過市購的方式獲得。本發(fā)明的防治雞球蟲病的口服生物制劑的保藏條件為室溫，有效期為2年。本發(fā)明的防治雞球蟲病的口服生物制劑實際使用時，按照占雞飼料總重的 0. 的比例加入雞飼料中，均勻混合后即可按照常規(guī)方法進行喂食。本發(fā)明充分利用了枯草芽孢桿菌的以下優(yōu)勢1)高分泌能力，使得重組表達的藥 用蛋白不需要經(jīng)過下游的純化和分離，也使得分泌的抗原蛋白能有效遞呈至宿主的免疫系 統(tǒng)引起免疫應答；2)將抗原蛋白展示于芽孢外表面，可作為口服疫苗的應用；3)芽孢耐熱、 耐酸及耐鹽的特性，能耐受胃腸道環(huán)境且更利于保存；4)快速、簡捷的發(fā)酵和生產(chǎn)技術；5)本身為益生菌，若作為疫苗載體可起到佐劑的作用。本發(fā)明所提供的口服生物制劑，具有使用方便、預防治療并舉、生產(chǎn)成本低、生產(chǎn) 方便等特點。采用本發(fā)明方法制備而得的活載體疫苗不需要純化，可直接用于生產(chǎn)防治雞球蟲 病的口服生物制劑，免去蛋白質處理的復雜工序，因而具有很好的推廣使用價值。
具體實施例方式下面的實施例有助于本領域技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制 本發(fā)明。以下％均為重量％。下述實施例中所用的方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例1、含有抗原基因3-1E重組質粒的構建一、抗原3-1E基因的克隆1、3_1E基因的克隆按照常規(guī)技術從感染E. tenella的肉雞糞便中純化孢子化卵囊，并提到純種孢子 化卵囊中的總RNA，以反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，并以反轉錄的cDNA為模板，以上 游引物(SEQ ID NO 1)5P31E_bs 5，-TCTAGAAATGGGTGAAGAGGCTGATACT-3，禾口下游引物(SEQID NO 2)3P31E_bs5，-CTGCAGTTAGTGATGGTGATGGTGATGGAAGCCGCCCTGGTACAGGT-3，進行 PCR，獲 得目的基因(3-1E基因)。PCR反應體系為cDNA1. 0μ 1引物5P31E_bs (IOmM)1. 0 μ 1引物3P31E_bs (IOmM)1· 0 μ 1Taq 酶(5U/ μ 1)0. 5 μ 1
10 X PCR buffer (含 Mg2+)dNTP(10mM each)ddH20_
5. Ομ 1 1. Ομ 1 40. 5 μ 1 Total
50. Ομ 1稍離心，置于PCR儀中；PCR反應條件94°C預變性2min ；94°C變性30s，40°C退火 30s，72°C延伸40s,反應5個循環(huán)；94°C變性30s, 50°C退火30s, 72°C延伸40s,反應30個循 環(huán)；72°C IOmin ；4°C保存。PCR產(chǎn)物標記為3-1E，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。并割膠回 收，瓊脂糖凝膠回收步驟見試劑盒(AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒，AxyGEN公司)說明。將513bp的3-1E基因(序列見GenBank EF069437)的目的片段克隆入載體 pMD18Tvector (購于TaKaRa生物工程有限公司(大連))中，得到含有3-1E基因的克隆載 體,命名為 PMD18T-3-1E。2、構建枯草芽孢桿菌表達載體pBES 可參照傅玲琳《對蝦白斑綜合征病毒囊膜蛋白VP28枯草工程菌的構建與VP28卵 黃抗體的制備及其抗病性研究.浙江大學博士論文，2008》進行構建，具體內(nèi)容如下2. 1引物設計根據(jù)pUS186質粒啟動子-信號肽序列兩端設計引物，序列如下5Pbl8-l :5’ -AGGCTTTTAAGCCGTCTGTACGTTC-3，(SEQ ID NO 3)3Pbl8-l :5’ -AAATGCCTCACATTTGTGCCACCTA-3’ (SEQ ID NO 4)2. 2PCR擴增啟動子-信號肽序列以質粒pUS186為模板，5Pbl8_l和3Pbl8_l為引物，PCR擴增長度為581bp的含 B. subtilis強啟動子PE σ 43和芽孢桿菌淀粉酶天然信號肽SP序列的基因片段。PCR擴增 條件是94°C變性2min后進入循環(huán)，94°C變性45s，58°C復性Imin，72°C延伸Imin，35個循環(huán) 后在72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物標記為PCR/BPS，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。2. 3PCR 產(chǎn)物 PCR/BPS 純化瓊脂糖凝膠回收步驟見試劑盒(AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒，AxyGEN公司)說 明。2. 4雙酶切PCR/BPS片段與pBE2載體枯草芽孢桿菌一大腸桿菌穿梭載體pBE2，是pUBl 10的衍生載體，可按郭興華等方 法(郭興華，熊占，周民，賈士芳，許怡.枯草桿菌一大腸桿菌多功能穿梭載體的構建.生 物工程學報.1991，7 (3) 224-229)構建保存。分別將質粒pBE2和PCR產(chǎn)物PCR/BPS進行 EcoRI和XbaI雙酶切，37°C水浴過夜。雙酶切體系分別如下
7 2.5 連接在1· 5ml 離心管中加入 pBEC (EcoRI-XbaI) 3 μ 1、PCR/BPS (EcoRI-XbaI) 5 μ 1、 T4DNA連接酶1μ 1、10ΧΤ4 DNA ligase buffer 1 μ 1，輕輕混勻，稍離心后，置16°C恒溫儀 連接過夜。所得的連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞，挑取長出的單菌落搖菌、進行 菌落PCR驗證。上述構建而得的枯草芽孢桿菌表達載體pBES含有強啟動子和信號肽。3、將3-1E基因從PMD18T-3-1E用限制性內(nèi)切酶Xba I與Pst I酶切下來，得到酶 切產(chǎn)物；再用限制性內(nèi)切酶XbaI與Pst I將枯草芽孢桿菌表達載體pBES酶切后，將上述酶 切產(chǎn)物用T4DNA連接酶與其連接(3-1E基因可與任何枯草菌表達載體相連)，連接反應時間 為16小時；得連接產(chǎn)物。4、將上述步驟3所得的連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞，挑取長出的單 菌落搖菌、進行菌落PCR驗證，所用引物為上游引物5P3IE-BS 5，-TCTAGAAATGGGTGAAGAGGCTGATACT-3，和下游引物3P3IE-BS 5， -CTGCAGTTAGTGATGGTGATGGTGATGGAAGCCGCCCTGGTACAGGT-3’PCR驗證體系同步驟1。將擴增到目的片段的克隆子提質粒、用限制性內(nèi)切酶Xba I與Pst I進一步酶切 鑒定，得到513bp的酶切片段的為陽性克隆質粒。再對其進行測序列分析，得到正確的含有 3-1E的重組質粒，命名為pBES-3-lE。實施例2、重組枯草芽孢桿菌(防雞球蟲病的活載體疫苗)的制備方法將上述實施例1所構建的重組表達載體(重組質粒)pBES-3-lE在枯草芽孢桿菌 1A751(來源于美國桿菌保藏中心BGSC)中轉化(可轉化任何枯草芽孢桿菌菌株)挑斑枯草芽孢桿菌1A751于4ml GMI培養(yǎng)基中(試管)，30°C培養(yǎng)過夜，IOOr/ min (慢搖)10% (體積比)轉接于6ml GMI培養(yǎng)基(三角瓶)，37°C培養(yǎng)3. 5h，200r/min (快 搖)；10%轉接于20ml GMII培養(yǎng)基(三角瓶)，37°C培養(yǎng)90min，lOOr/min(慢搖)；離心 收集菌體(1/10體積的上清液懸浮菌體)將20ml菌液分裝到4個IOml的離心管(每管 5ml)，離心收集菌體，每管剩0. 5ml上清重新懸浮菌體；0. 5ml菌液加重組質粒5 μ 1 ；室溫 放置IOmin ；涂板直接吸200 μ 1菌液涂布LB (Kana 5 μ g/ml)平板；于37°C培養(yǎng)箱至單菌落出現(xiàn)。 挑取轉化子進行PCR和酶切驗證，鑒定擴增出513bp的克隆子即為轉化子。挑斑工程菌 B. subtilis (pBES-3-lE)至含5% (質量比)葡萄糖和0. 2% (質量比)谷胺酰胺的LB培養(yǎng)至細胞密度為109cfu/ml，收集菌體后用玉米淀粉吸附，并進 行菌落計數(shù)。具體可為每克玉米淀粉吸附IOltlCfu活載體疫苗；得菌粉。實施例3、預防雞球蟲病的口服生物制劑的制備將25重量份的沸石粉與75重量份的玉米淀粉相混合，該沸石粉和玉米淀粉均能 過100目篩；得載體。將實施例2所得的菌粉與上述載體按1 9的重量比進行混合，簡單加以攪拌混 合即得防治雞球蟲病的口服生物制劑；每克該口服生物制劑含有IO9Cfu的活載體疫苗。實施例4免疫保護試驗100只1日齡艾維音肉雞隨機分成5組，每組20只。分別為非感染非免疫對照組 (CKl)、感染非免疫對照組(CK2)、芽孢桿菌空載體對照組(B.S[pBES]，記為B. S-P，其含量 等同本發(fā)明)、口服本發(fā)明(實施例3)的生物制劑的作為試驗組(B.S[pBES-3-lE]，記為 B. S-31E)、抗球蟲藥癸氧喹酯對照組(Decoquinate，記為Dec)。芽孢桿菌空載體對照組5g芽孢桿菌空載體/kg飼料。試驗組(本發(fā)明)5g 口服生物制劑/kg飼料?？骨蛳x藥癸氧喹酯對照組0. 5g癸氧喹酯/kg飼料。預試期7天后，試驗組及對照組均采用拌料方式進行口服免疫，連續(xù)免疫10天。試 驗期間自由采食和飲水。17日齡(攻蟲前)時，每組隨機宰殺5只，取全血、血清及盲腸粘 膜，以備指標測定。24日齡時(攻蟲后第8天)全部宰殺。試驗結果如下1、增重效果表1各組雞體重變化 注同列肩標不同小寫字母代表差異顯著(P < 0.05)，含相同字母表示差異不顯 著(P > 0.05)，下同。表2各組雞體增重變化 注平均增重1是指攻蟲前雞的增重；平均增重2是指攻蟲后雞的增重；由表1和表2可見免疫前各組雞體重變化差異不顯著(P > 0. 05)。免疫后攻蟲 前，B. S-P組相對增重不僅顯著高于B. S-31E組和Dec組(P < 0. 05)，也顯著高于CKl組 (P = 0. 048)，B. S-31E組和Dec組略低于CKl組，但差異不顯著(P > 0. 05)。以上結果表 明，含空表達載體的枯草芽孢桿菌能顯著促進肉雞的生長；表達3-1E基因的口服生物制劑 組和癸氧喹酯對肉雞生長無不良影響。攻蟲后，所有感染組雞相對增重均顯著低于非感染組(CKl組)(P < 0. 05)；在感 染組中，B. S-31E組和Dec組雞相對增重顯著高于CK2組和B. S-P組(P < 0. 05)，而B. S-31E 組和Dec組差異均不顯著。以上結果表明，口服生物制劑組、癸氧喹酯對球蟲病引起的體重 降低有一定的抑制作用，而含空表達載體的枯草芽孢桿菌無此作用。2、OPG值(克糞便卵囊數(shù))攻蟲后每天檢查糞便，從第5天開始分別收集各組糞便，連續(xù)收集6天，混勻后，每 組各取lg，加入IOmL蒸餾水制成10倍稀釋液，經(jīng)充分攪拌均勻后于顯微鏡下用紅細胞計 數(shù)板計數(shù)每克糞便中的蟲卵數(shù)。卵囊減少率(保護率)=[(感染非免疫組糞便卵囊排出 量_試驗組糞便卵囊排出量)/感染非免疫組糞便卵囊排出量]X 100%。結果如表3所示。表3各組OPG值 由表3可見，CKl組(非攻蟲組)糞便中無卵囊；與CK2組相比，B. S-P組、口服生物 制劑組和Dec組的克糞便卵囊數(shù)均極顯著降低(P < 0. 01)，其中口服生物制劑組又極顯著 低于B. S-P組和Dec組，后二者差異不顯著。以CKl組和CK2組卵囊減少率分別為100%和 0%計，B. S-P組、口服生物制劑組和Dec組的卵囊減少率分別為45. 17,63. 70和31. 87%。 以上結果表明，含空載體或3-1E抗原基因的枯草芽孢桿菌及癸氧喹酯對雞球蟲在體內(nèi)的 繁殖均有一定的抑制作用，其中口服生物制劑組的效果最好。
3、盲腸病變記分攻蟲后第8天，每組取5只撲殺，觀察盲腸病變。相對病變計分=(試驗組病變記分/感染非免疫組病變記分)X 100%按Johnson等的方法進行盲腸病變記分，將盲腸病變分為0_+4五個等級。0分，無肉眼病變+1分，盲腸壁有很少量散在的瘀點，腸壁不增厚，內(nèi)容物正常。+2分，病變數(shù)量較多，盲腸內(nèi)容物明顯帶血，盲腸壁稍增厚，內(nèi)容物正常。+3分，盲腸內(nèi)有多量血液或有盲腸芯(血凝塊或灰白色干酪樣的香蕉型塊狀物)， 腸壁肥厚明顯，盲腸中糞便含量少。+4分，因充滿大量血液或腸芯而盲腸腫大，腸芯中含有糞渣或不含，死亡雞只也記 +4分。結果如表4所示。表4各組盲腸病變記分 由表4可見，CKl組盲腸無病變；與CK2組和B. S-P組相比，口服生物制劑組和Dec 組的盲腸病變記分均極顯著降低(P < 0. 01)，說明口服生物制劑組和癸氧喹酯均對雞球蟲 造成的盲腸病變有一定的改善作用。4、抗球蟲指數(shù)(ACI)抗球蟲指數(shù)(ACI)=(存活率+相對增重率)_(病變值+卵囊值)存活率=(試驗結束時存活雞只數(shù)/試驗組雞只數(shù))X 100%相對增重率=(最后撲殺時重/非感染非免疫組增重)X 100%病變值=各試驗組的平均病變記分(0-4) X 10卵囊值按以下方法計算(如表5)，結果如表6所示。
0127]表 5
0128]_
0129]糞便卵囊排除數(shù)(106)卵囊值
0130]_
0131]小于 0.10
0132]0.1-1.01
0133]2.0-5.010
0134]6.0-10.020
0135]大于11.040
11
_以ACI≥180為保護效果顯著，ACI = 160-179為保護效果一般，ACI < 160為無
保護效果。表6、各組抗球蟲指數(shù) 由表6可見，所有攻蟲組的ACI顯著低于CKl組(P < 0. 05)，但Dec組和口服生物 制劑組ACI分別比CK2組顯著提高了 18. 5% (P = O. 002)和18. 8% (P = O. 001)，分別比 B. S-P 組顯著提高了 14. 6% (P = 0. 033)和 14. 9% (P = 0. 029)。根據(jù) “ACI 彡 180 為保 護效果顯著，ACI = 160-179為保護效果一般，ACI < 160為無保護效果”這一原則可以判 斷，表達3-1E抗原基因的枯草芽孢桿菌(本發(fā)明的口服生物制劑)和癸氧喹酯均有顯著保 護效果；枯草芽孢桿菌也有一定保護作用，但效果一般。以上結果說明，本發(fā)明的口服生物制劑是一種防預防雞球蟲病效果最好的安全 的、使用方便的生物制劑。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā) 明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容 直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
一種防治雞球蟲病的活載體疫苗的制備方法，其特征是將柔嫩艾美耳球蟲子孢子抗原基因3 1E基因的成熟肽與枯草芽孢桿菌的表達載體相連獲重組表達載體，再將重組表達載體轉入枯草芽孢桿菌宿主獲得重組菌株，培養(yǎng)該重組菌株，即得防治雞球蟲病的活載體疫苗。
2.根據(jù)權利要求1所述的防治雞球蟲病的活載體疫苗的制備方法，其特征是包括以下 步驟1)、將3-1E基因的目的片段克隆入載體pMD18Tvector,得到含有3-1E基因的克隆載 體,命名為 PMD18T-3-1E ；2)、選用枯草芽孢桿菌表達載體pBES；3)、將3-1E基因從pMD18T-3-lE用限制性內(nèi)切酶XbaI與PstI酶切下來，得到酶切產(chǎn) 物；再用限制性內(nèi)切酶Xba I與Pst I將枯草芽孢桿菌表達載體pBES酶切后，將上述酶切 產(chǎn)物用T4DNA連接酶與酶切后的枯草芽孢桿菌表達載體pBES連接；得連接產(chǎn)物；4)、將上述步驟3)所得的連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞，挑取長出的單菌 落搖菌、進行菌落PCR驗證；得到含有3-1E的重組質粒，命名為ρ BES-3-1E ；5)、將上述pBES-3-lE在枯草芽孢桿菌1A751中轉化和涂板；得活載體疫苗。
3.如權利要求1或2所述方法制備而得的活載體疫苗的用途，其特征是用于預防和/ 或治療雞球蟲病。
4.利用權利要求3所述的活載體疫苗制成的防治雞球蟲病的口服生物制劑，其特 征是所述口服生物制劑由活載體疫苗和載體組成，每克口服生物制劑含有活菌數(shù)為 IO8Cfu IO9Cfu的活載體疫苗。
5.根據(jù)權利要求4所述的防治雞球蟲病的口服生物制劑，其特征是所述載體由重量 比為5 50%的沸石粉和50 95%的玉米淀粉組成。
6.根據(jù)權利要求5所述的防治雞球蟲病的口服生物制劑，其特征是所述沸石粉和玉 米淀粉均能過80 200目篩。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種防治雞球蟲病的活載體疫苗的制備方法將柔嫩艾美耳球蟲子孢子抗原基因3-1E基因的成熟肽與枯草芽孢桿菌的表達載體相連獲重組表達載體，再將重組表達載體轉入枯草芽孢桿菌宿主獲得重組菌株，培養(yǎng)該重組菌株，即得防治雞球蟲病的活載體疫苗。該活載體疫苗能用于預防和/或治療雞球蟲病。本發(fā)明還同時公開了利用上述活載體疫苗制成的防治雞球蟲病的口服生物制劑，由活載體疫苗和載體組成，每克口服生物制劑含有活菌數(shù)為108cfu～109cfu的活載體疫苗。
文檔編號C12N15/30GK101912604SQ20101022027
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月8日 優(yōu)先權日2010年7月8日
發(fā)明者余東游, 李衛(wèi)芬, 林志偉, 毛翔飛, 鄧斌 申請人:杭州保得利生物技術有限公司