專利名稱：一種人源化抗體及其人源化改造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人源化抗體及其人源化改造方法。
背景技術(shù)：
P185是由癌基因Her2/erbB-2編碼的一種細(xì)胞表面的重要的受體酪氨酸激酶，屬 于表皮生長(zhǎng)因子受體家族。P185/Her2受體與該家族其他成員類似，由胞外區(qū)，跨膜區(qū)和胞 內(nèi)區(qū)三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其中胞外區(qū)(ECD)又分為四個(gè)亞區(qū)，其中的I、III亞區(qū)為亮氨酸富含 區(qū)，II、IV 亞區(qū)為半胱氨酸富含區(qū)(Carpenter G. (1987) Receptors of epidermal growth factor and other polypeptide mitogens. Annu. Rev. Biochem. 56 :881_914)。表皮生長(zhǎng)因 子家族受體廣泛地分布于多種組織，尤其在上皮組織、間質(zhì)組織以及神經(jīng)發(fā)生組織中表達(dá)， 在調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、發(fā)育、黏附和遷移中起到了重要的作用。P185/Her2作為表皮生長(zhǎng) 因子受體家族的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中最重要的一員，其表達(dá)水平的異常與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂、 腫瘤的發(fā)生和惡性發(fā)展緊密相關(guān)(Nancy EH, Heidi A, Lane N. (2005) ErbB receptors and cancer :the complexity of targeted inhibitors Nat. Rev. Cancer 5 :341_354)。近年來P185/Her2 —直作為腫瘤治療領(lǐng)域中的熱點(diǎn)被廣泛研究。1985年， Greene Μ. I.研究組發(fā)現(xiàn)，抗P185/Her2胞外區(qū)的單克隆抗體能夠使已經(jīng)轉(zhuǎn)化的Her2高 表達(dá)的NIH3T3表型逆轉(zhuǎn)，使腫瘤細(xì)胞的表型趨于正?；?，同時(shí)可以下調(diào)Her2受體的表達(dá) 7ΚΨ (Drebin JA, Link VC, Stern DF, Weinberg RA, Greene, MI. (1985)Down-modulation of an oncogene protein product and reversion of the transformed phenotype by monoclonal antibodies. Cell 41:695-706)。隨后該實(shí)驗(yàn)室又發(fā)現(xiàn)，抗Her2的單克隆抗 體能抑制移植入裸鼠體內(nèi)的Her2轉(zhuǎn)化的OTH3T3腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而第一次通過體內(nèi)實(shí) 驗(yàn)證明了抗Her2單抗可能對(duì)Her2高表達(dá)腫瘤有臨床治療的價(jià)值(Drebin JA, Link VC, Weinberg RA,Greene MI. (1986)Inhibition of tumor growth by a monoclonal antibody reactive with an oncogene—encoded tumor antigen. Proc Natl Acad Sci USA 83 9129-9133)。這一發(fā)現(xiàn)大大促進(jìn)了抗Her2單克隆抗體的抗腫瘤作用的研究，也揭示了抗體 在腫瘤治療上應(yīng)用的前景。但是，由于目前雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體都是鼠源抗體，應(yīng) 用于人體時(shí)會(huì)產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA)反應(yīng)，所以不能直接用于人體內(nèi)的疾病治療。因此必 須對(duì)單克隆抗體進(jìn)行人源化改造，以減少和消除鼠源蛋白的免疫原性。最早用于單克隆抗體人源化改造的方法是構(gòu)建嵌合抗體(Vaughan TJ, Osbourn JK, Tempest PR. (1998)Human antibodies by design. Nat. Biotechnol 6:535-539)。該 方法是將鼠源抗體的可變區(qū)和人抗體恒定區(qū)通過基因工程技術(shù)連接起來，即將鼠源抗體的 恒定區(qū)基因替換為人抗體恒定區(qū)基因，與抗原結(jié)合的可變區(qū)部分仍然是鼠源抗體。此方法 構(gòu)建出的工程化嵌合抗體最大限度的保留了識(shí)別靶抗原能力的鼠源抗體可變區(qū)，同時(shí)又 擁有了人抗體所有的恒定區(qū)的免疫學(xué)殺傷效應(yīng)，而且由于這種嵌合抗體的免疫原性相比 原始的鼠源抗體降低了 2/3，所以可以應(yīng)用于人體治療(Davis ΤΑ. (1999)Final report on the safety and efficacy of retreatment with rituximab for patients with
4non-Hodgkin，s lymphoma. Blood 94:88a)。但由于其分子中還保留了 1/3的鼠源部分，用 于長(zhǎng)期臨床治療還有可能發(fā)生人抗鼠抗體反應(yīng)。 因此，為了進(jìn)一步降低嵌合抗體的免疫原性，需要對(duì)嵌合抗體的鼠源可變區(qū)進(jìn)行 進(jìn)一步的人源化改造，獲得全人源化抗體。目前應(yīng)用較多的全人源化方法是將鼠源抗體可 變區(qū)內(nèi)參與抗原結(jié)合的部分與選擇用于做模板的人抗體可變區(qū)的框架區(qū)重新拼接，使抗體 可變區(qū)中除高度可變的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)來源于鼠抗體外，其余部分都換成人源的。由于 抗體可變區(qū)中參與抗原結(jié)合的一般是其6個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，故此過程也被稱為“CDR移 植”，然后為了克服由于“CDR移植”可能導(dǎo)致的親和力下降，需通過一系列對(duì)框架區(qū)殘基的 突變，逐步恢復(fù)或提高抗體的抗原結(jié)合能力，從而得到人源化程度更高的重構(gòu)抗體(Jones PT，Dear PH, Foote J. (1986)Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse，Riechmann L，Clark M，Waldmann H. (1988) Reshaping human antibodies for therapy, Chothia C， Lesk AM， Tramontano. (1989)A Conformat ions of immunoglobulin hypervariable regions)。已 艮道的構(gòu)建重構(gòu)抗體 的方法依照其人源化改造使用的模板的選擇和回復(fù)抗體結(jié)合能力的方法，主要又可以分成 兩種。其一，通過序列對(duì)比，以序列相似性為標(biāo)準(zhǔn)分別選擇相似性最高的抗體輕鏈和重鏈可 變區(qū)的人源抗體為模板序列，在經(jīng)過CDR移植后的輕、重鏈序列基礎(chǔ)上，針對(duì)可能影響結(jié)合 能力的框架殘基分別構(gòu)建一系列突變體，鑒別合適的突變組合。這些突變體需各自獨(dú)立制 備及測(cè)試其抗原結(jié)合能力，然后將較好的突變組合起來，即需要對(duì)各個(gè)可能的殘基的突變、 篩選的重復(fù)循環(huán)實(shí)驗(yàn)，所以步驟繁復(fù)，效率低，效果不理想。其二，也是目前抗體人源化的一 種通用方法。具體的做法是，將非人源(例如鼠源)抗體的CDR移植于通用的人源抗體可 變區(qū)模板VL κ I-VHIII的構(gòu)架上，通過對(duì)一組選定的關(guān)鍵框架區(qū)殘基進(jìn)行隨機(jī)誘變，構(gòu)建 抗體Fab的噬菌體文庫，再通過噬菌體親和力篩選鑒別出最佳框架序列。此方法相比第一 種可以更快速地獲得優(yōu)化的框架序列，并可在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高抗體的抗原親和力；但 是由于其選用的是通用模板，雖有普適性，但對(duì)不同抗體來講可能不是最優(yōu)的，另外通過構(gòu) 建噬菌體庫篩選高親和力抗體的方法也比較復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的蛋白，是如下任一所述蛋白質(zhì)a)由序列表中序列3中自N末端起第1_253位氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(Hl_2 VL+Linker+VH)b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(Hl-2 :VL+Linker+VH+Fc)c)將a)限定的蛋白中自其N末端起第115-134位(linker)氨基酸經(jīng)過一個(gè)或幾 個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白質(zhì)；d)將b)限定的蛋白中自其N末端起第115-134位(linker)氨基酸和/或第 254-489位(Fe片段)氨基酸經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的 具有相同功能的蛋白質(zhì)；e)由序列表中序列1中自N末端起第1-253位氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(H1-1 VL+Linker+VH)
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f)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(Hl-1 :VL+Linker+VH+Fc)g)將e)限定的蛋白中自其N末端起第115-134位(linker)氨基酸經(jīng)過一個(gè)或幾 個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白質(zhì)；h)將f)限定的蛋白中自其N末端起第115-134位(linker)氨基酸和/或第 254-489位(Fc片段)氨基酸經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的 具有相同功能的蛋白質(zhì)；i)由序列表中序列5中自N末端起第1-253位氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(H1-V1 VL+Linker+VH)j)由序列表中序列5所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(Hl-Vl :VL+Linker+VH+Fc)k)將i)限定的蛋白中自其N末端起第115-134位(linker)氨基酸經(jīng)過一個(gè)或幾 個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白質(zhì)；1)將j)限定的蛋白中自其N末端起第115-134位(linker)氨基酸和/或第 254-489位(Fc片段)氨基酸經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的 具有相同功能的蛋白質(zhì)。所述編碼基因?yàn)槿缦氯我凰?)編碼所述a)所示蛋白的編碼基因?yàn)?起第1-759位核苷酸所示DNA分子；2)編碼所述b)所示蛋白的編碼基因?yàn)?子；3)編碼所述e)所示蛋白的編碼基因?yàn)?起第1-759位核苷酸所示DNA分子；4)編碼所述f)所示蛋白的編碼基因?yàn)?子；5)編碼所述i)所示蛋白的編碼基因?yàn)?起第1-759位核苷酸所示DNA分子；6)編碼所述j)所示蛋白的編碼基因?yàn)?子；7)在嚴(yán)格條件下與1)_6)任一限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；8)與1)-6)任一限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA 分子。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組病毒或表達(dá) 盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組載體是在pSeCtag2A載體的多克隆位點(diǎn)插入所述編碼基因得到的。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種抗體。本發(fā)明所提供的抗體，由兩個(gè)相同的上述任一所述蛋白組成；所述兩個(gè)相同的蛋 白通過二硫鍵連接。上述任一所述蛋白在制備預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。上述任一所述抗體在制備預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的核苷酸序列是序列表中序列4自5'末端 核苷酸序列是序列表中序列4所示DNA分 核苷酸序列是序列表中序列2自5'末端 核苷酸序列是序列表中序列2所示DNA分 核苷酸序列是序列表中序列6自5'末端 核苷酸序列是序列表中序列6所示DNA分保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種抗體的人源化改造的方法。本發(fā)明提供的抗體的人源化改造的方法包括如下步驟(1)、按照如下I或II所述方法選擇得到人源化抗體模板I、選擇重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)分別與待改造抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū) 的氨基酸序列相似性均在50%以上或60%以上的人源化抗體，將其作為預(yù)人源化抗體模 板；從所述預(yù)人源化抗體模板中選擇與待改造抗體的可變區(qū)空間結(jié)構(gòu)相似性值最高 的人源化抗體作為人源化抗體模板；II、選擇滿足如下i)和ii)所示條件的人源化抗體，將其作為預(yù)人源化抗體模 板；i)重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)分別與待改造抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨 基酸序列相似性均在50%以上或60%以上；ii)重鏈可變區(qū)的框架區(qū)和輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)分別與待改造抗體的重鏈可變區(qū) 的框架區(qū)和輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)的氨基酸序列相似性均在50%以上或60%以上；從所述預(yù)人源化抗體模板中選擇與待改造抗體的可變區(qū)空間結(jié)構(gòu)相似性值最高 的人源化抗體作為人源化抗體模板；所述可變區(qū)空間結(jié)構(gòu)為如下a)和/或b)所示a)重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)一起 構(gòu)成的空間結(jié)構(gòu)；b)重鏈可變區(qū)中的框架區(qū)和輕鏈可變區(qū)中的框架區(qū)一起構(gòu)成的空間結(jié) 構(gòu)；未知空間結(jié)構(gòu)的抗體，可通過軟件模擬出其空間結(jié)構(gòu)，包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可 變區(qū)一起構(gòu)成的空間結(jié)構(gòu)，和重鏈可變區(qū)中的框架區(qū)和輕鏈可變區(qū)中的框架區(qū)一起構(gòu)成的 空間結(jié)構(gòu)。(2)、按照如下III或IV所示方法獲得被置換后的人源化抗體模板III、用所述待改造抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)中的至少一個(gè)⑶R氨基酸序 列置換所述人源化抗體模板中對(duì)應(yīng)的CDR氨基酸序列，獲得被置換后的人源化抗體模板；(未知⑶R區(qū)的抗體，可通過綜合Kabat等人和Chothia等人的序列定義進(jìn)行鑒 定，將兩種方法鑒定結(jié)果的綜合值作為最終值，即取兩鑒定結(jié)果中的最小值至最大值區(qū)段 作為CDR區(qū))。IV、用所述待改造抗體的抗原結(jié)合區(qū)氨基酸序列置換所述人源化抗體模板中對(duì)應(yīng) 的抗原結(jié)合區(qū)氨基酸序列，獲得被置換后的人源化抗體模板；(3)、將所述步驟(2)中的被置換后的人源化抗體模板作為改造后的目的人源化 抗體；(4)用基因工程方法表達(dá)得到所述改造后的目的人源化抗體。上述方法中，在所述步驟(2)后，所述步驟(3)前，包括如下回變步驟將所述步驟 (2)得到的抗體的框架區(qū)的至少一個(gè)氨基酸殘基替換為所述待改造抗體中相應(yīng)位置的氨基 酸殘基，至得到的抗體空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，將得到的抗體作為改造后的目的人源化抗體。(回變滿足如下兩個(gè)條件1)人源化程度高，2)使得到的抗體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；所述可變 區(qū)為重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)；)
上述方法中，所述回變步驟中，被替換的氨基酸殘基為影響步驟(2)得到的抗體 的CDR區(qū)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性或影響步驟(2)得到的抗體的抗原結(jié)合區(qū)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的氨基酸殘基；上述方法中，所述回變步驟中，被替換的氨基酸殘基位于所述步驟(2)得到的抗 體的游標(biāo)區(qū)和/或被替換的氨基酸殘基位于所述步驟(2)得到的抗體的側(cè)鏈中距離所述 CDR氨基酸殘基3埃以內(nèi)；上述方法中，在所述回變后，所述步驟(3)前，包括如下人源突變步驟將所述回 變得到的抗體的框架區(qū)內(nèi)非人源的且不同于所述待改造抗體中相應(yīng)位置氨基酸的氨基酸 殘基突變?yōu)槿嗽窗被釟埢瑢⒌玫降目贵w作為改造后的目的人源化抗體。由上述任一所述方法得到的人源化抗體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的抗體是特異識(shí)別腫瘤表面抗原Pl85H 2/ertB_2的嵌合抗體ChA21的人源化 抗體變異體。本發(fā)明所提供的ChA21的人源化抗體變異體包括原嵌合抗體ChA21中鼠源的單鏈 抗體被完全人源化的scFv、鉸鏈區(qū)和人源的Fc區(qū)。其中被人源化的scFv的氨基酸序列為DIVLTQSPDSLAVSLGERVTINC KSSQTLLYSNNQKNYLA WYQQKPGQSPKLLIS ffAFTRKSG VPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYC QQYSNYPffT FGAGTKLEIKR GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKAS GYSFTGYFIN ffVKQNPGQRLEfflGHISSSYATSTYNQKFKG KATLTVDTS ASTAYMELSSLRSEDTAVYYCVR SGNYEEYAMDYffGQGTLVTVS.下劃線部分分別為抗體的3個(gè)輕鏈和3個(gè)重鏈順序排列的共6個(gè)互補(bǔ)決定區(qū) (⑶Rs)，黑體部分為輕重鏈可變區(qū)之間的連接區(qū)(Linker)。本發(fā)明改造后的抗體構(gòu)架未改變的最初的嵌合抗體相比，與抗原的親和力相近， 并已經(jīng)達(dá)到了完全的人源化，具有更好的臨床應(yīng)用前景。本發(fā)明的人源化抗體改造方法包括如下步驟基于目標(biāo)抗體的可變區(qū)序列和結(jié)構(gòu)信息的人源抗體模板的選擇首先，將需人源化的目標(biāo)抗體(ChA21)輕、重鏈可變區(qū)的序列分別通過 IgBLAST(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/igblast/)進(jìn)行序列相似性搜索，將輕、重鏈均有 較高相似性(大于50% )且有晶體結(jié)構(gòu)的若干個(gè)人源抗體作為候選的人源化模板；再通過 分子疊合比較候選模板抗體和目標(biāo)抗體框架區(qū)的結(jié)構(gòu)相似性，選擇結(jié)構(gòu)相似度最高的一種 作為抗體人源化的模板。如果目標(biāo)抗體沒有晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，可以通過同源模擬獲得模擬分 子結(jié)構(gòu)再進(jìn)行比較?？乖Y(jié)合區(qū)的移植首先，選擇目標(biāo)抗體的抗原結(jié)合區(qū)段。對(duì)于沒有晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的抗體，一般是選擇 其互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)；(抗體的⑶R序列可以通過綜合Kabat等人和Chothia等人的序列定 義加以鑒定)對(duì)于有抗體和抗原復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的抗體，可以綜合CDR序列和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)獲 得其抗原結(jié)合區(qū)域。然后，將選擇的區(qū)段殘基替換人源模板抗體相應(yīng)位置上的殘基，得到最初版本的 人源化抗P185/Her2抗體序列命名為為H1，并通過計(jì)算機(jī)同源模擬得到HI的模擬的空間結(jié) 構(gòu)?？蚣軈^(qū)殘基回復(fù)突變位點(diǎn)的選擇基于模擬的HI結(jié)構(gòu)，采用計(jì)算生物學(xué)方法，對(duì)一些重要的框架區(qū)殘基進(jìn)行突變方向的篩選。這些殘基包括所有游標(biāo)殘基(Vernier)和所有側(cè)鏈距離⑶R殘基3埃以內(nèi)的框 架區(qū)殘基，選擇更符合抗體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的位點(diǎn)為需要突變的方向。具體到本例中，最初人源 抗體HI的輕鏈可變區(qū)VL的第4和49位殘基以及重鏈可變區(qū)VH的第71和93位殘基，被 選擇需突變?yōu)槟繕?biāo)抗體上的相應(yīng)殘基，即VL第4殘基甲硫氨酸被亮氨酸取代，第49位殘基 酪氨酸被絲氨酸取代；VH的第71殘基丙氨酸被纈氨酸取代，第93位殘基蘇氨酸被纈氨酸 取代。由此獲得人源化的抗P185/Her2抗體序列H1-1。根據(jù)改造后親和力分析結(jié)果和進(jìn)一 步提高人源化程度的需要，還可對(duì)一些CDR區(qū)以外的非抗原結(jié)合殘基進(jìn)行人化修飾，如具 體到本例子為H1-1中VL區(qū)的殘基5、21和106以及VH區(qū)的殘基61、62、80和91，則選擇數(shù) 據(jù)庫中人源抗體相應(yīng)位置上出現(xiàn)頻率較高的殘基將它們分別替換，最終獲得比最初版本人 源化程度更高的抗P185/Her2抗體序列H1-2。本發(fā)明所提供的方法與現(xiàn)有抗體人源化改造方法相比，有如下優(yōu)點(diǎn)和特異性首先，本方法在人源化模板抗體的選擇上，不同于以往方法分別選擇與輕鏈和重 鏈相似的的兩個(gè)人源模板序列，而是選擇輕重鏈均與目標(biāo)抗體有較高相似度的一種人源抗 體作為模版，且候選模板抗體盡量選擇有晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的，通過比較候選模版抗體和目標(biāo) 抗體的整體結(jié)構(gòu)的相似性，最終決定出模板抗體。這種將抗體的輕重鏈作為一個(gè)整體來考 慮，所選輕重鏈模板來自于同一個(gè)抗體，本身就是來自天然構(gòu)架，相比以往人為組合輕重鏈 的方法更有利于輕重鏈框架區(qū)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，而且在選擇框架區(qū)殘基突變時(shí)，可以不用再 考慮是否需要突變輕重鏈界面殘基來使輕重鏈相互作用更穩(wěn)定的問題。其次，按結(jié)構(gòu)相似性選擇模板相比以往單純的通過序列相似性篩選模板更具有結(jié) 構(gòu)合理性。因?yàn)榭贵w與抗原的結(jié)合直接取決于抗體互補(bǔ)決定區(qū)的構(gòu)象，而互補(bǔ)決定區(qū)又是 搭建于框架區(qū)所構(gòu)建的平臺(tái)之上的，所以人源模板與目標(biāo)抗體的空間結(jié)構(gòu)相似性越高越利 于移植后的互補(bǔ)決定區(qū)構(gòu)象的維持，即越利于保持抗體結(jié)合抗原的能力。序列相似性雖然 在一定程度上可以代表結(jié)構(gòu)相似性，但并不很精確。例如本發(fā)明實(shí)施例一中，具有最高序列 相似性的若干模板卻不是結(jié)構(gòu)相似性最好的。再次，在選擇框架區(qū)殘基突變時(shí)，結(jié)合抗體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)分析，可以直觀迅速的作出應(yīng) 突變位點(diǎn)的選擇。根據(jù)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的需要來選擇游標(biāo)殘基中的那些有可能影響CDR區(qū)結(jié)構(gòu)的 殘基以及決定其他一些位于抗體分子表面且可以進(jìn)一步人源化的殘基是否突變以及突變 的方向，將以往需要多輪突變篩選或是通過噬菌體庫篩選突變的方式大大簡(jiǎn)化，將所有突 變選擇集中在一起進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析及其可行性，直接一步獲得最終的突變方案。因此相比以 往方法，本方法更加簡(jiǎn)捷明確。最后，相比于現(xiàn)有人源化方法，本方法的改造效果也更高一些。通過本方法得到的 ChA21抗體人源化的版本H1-2具有與原始抗體相當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合活性，相對(duì)親和力約為原始 抗體的93%左右。而已報(bào)道的通過通用抗體人化方法改造后的抗體的親合力有高有低，水 平很不穩(wěn)定(Carter P,Presta L, Gorman CM,Ridgway JB,Henner D,ffong WL, Rowland AM, Kotts C, Carver ME, Shepard HM. (1992)Humanization of an anti_pl85HER2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci USA 89 :4285_4289,Presta LG,Chen H,0 Connor SJ, Chisholm V, Meng YG,Krummen L, Winkler M, Ferrara N, (1997)Humanization of an anti-VEGFmonoc1ona1 antibody for the therapy of solid tumors and other disorders, Cancer Res. 57 =4593-4599) 為直接比較本方法和通用方法的改造效果，在本發(fā)明實(shí)施例中同時(shí)應(yīng)用通用人源化方法中的通用人源模板VL k I-VHIII對(duì)ChA21進(jìn)行人源 化改造，得到ChA21的另一個(gè)人源化版本H2-1，通過親和力測(cè)定發(fā)現(xiàn)H2-1的親和力相比原 始抗體下降了一倍以上，說明就本例中的抗體ChA21而言，本發(fā)明中的人化方法的改造效 果明顯好于現(xiàn)有其他方法。本領(lǐng)域已知有各種不同方法可用于表達(dá)和純化人源化的抗體。如大腸桿菌表達(dá)系 統(tǒng)，操作簡(jiǎn)單快速，成本低，但是可溶性抗體表達(dá)量低(100ug/L)，表達(dá)產(chǎn)物不能正確修飾， 容易形成包含體，純化困難，不同突變體克隆之間表達(dá)量差異很大，使下一步抗體親和力的 測(cè)定受抗體濃度影響，不易判斷；酵母表達(dá)系統(tǒng)，如PPIC9K載體，分泌表達(dá)，可用His-tag柱 純化，純化較方便，但需要構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株，周期長(zhǎng)，表達(dá)量雖然比大腸桿菌系統(tǒng)高(一般 在mg/L級(jí)別)，但不同突變體克隆之間表達(dá)量差異也很大；而本發(fā)明中采用的293T真核瞬 時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，以pSeCtag2A為載體，可分泌表達(dá)，產(chǎn)物可用His-tag柱或蛋白A柱純化，因此 將設(shè)計(jì)好的人源化抗體的重組質(zhì)粒DNA經(jīng)脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，表達(dá)產(chǎn)物能正確修 飾，純化簡(jiǎn)單，表達(dá)量較高(3-10mg/L)，且不同突變體克隆之間表達(dá)量差異小，雖然花費(fèi)相 對(duì)較高，但用此系統(tǒng)表達(dá)純化的抗體性質(zhì)測(cè)定結(jié)果明確、穩(wěn)定。另外，應(yīng)用ELISA法測(cè)定抗 體表達(dá)量和相對(duì)親和力，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，且無需對(duì)表達(dá)上清進(jìn)行純化，便于快速鑒定 篩選出人源突變體。


圖1為抗體ChA21輕鏈和重鏈的可變區(qū)氨基酸序列，序列編號(hào)依照Kabat規(guī)則排 序。下劃線部分為綜合Kabat和Chothia的序列定義劃分出的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs)。圖2為抗體ChA21的單鏈可變區(qū)(scFv，PDB號(hào)2GJJ)同選定的人源模板抗體 huCC49(PDB號(hào)1ZA6)的可變區(qū)的空間結(jié)構(gòu)比對(duì)結(jié)果。圖3為抗體ChA21的單鏈可變區(qū)與其識(shí)別抗原部分亞區(qū)的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。圖4用于說明通過ChA21的抗原結(jié)合區(qū)移植獲得的最初版本的人源化抗體HI的 氨基酸序列，以及同原始鼠源抗體和人源模板抗體的可變區(qū)一級(jí)序列比對(duì)。圖5是通過計(jì)算機(jī)同源模擬得到的人源化抗體H1-1的分子模型。圖6用于說明在人源化抗體HI序列及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行一系列的框架區(qū)殘基突變 的選擇結(jié)果，以及和獲得的新的人源化抗體變異體H1-1和H1-2的序列的比較?；パa(bǔ)決定 區(qū)用方框標(biāo)出。圖7用于說明以基于通用模板VLK I-VHIII獲得的人源化抗體hu4D5 (PDB號(hào) 1FVC)為人源模板對(duì)ChA21進(jìn)行人源化改造，以及獲得的人源化抗體H2-1的氨基酸序列。圖8為人源化抗體H1-1和H1-2重組表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。圖9為抗體ChA21和其各種人源化突變體的抗原結(jié)合曲線。將各種轉(zhuǎn)染的293T 細(xì)胞的上清中的抗體的起始濃度都配制成lug/ml，再通過ELISA檢測(cè)各種突變體與抗原的 結(jié)合曲線。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
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實(shí)施例1、嵌合抗體chA21的人源化改造嵌合抗體chA21的序列早已由L. S. Cheng等人描述(Chen L. S.，Liu A. P.，Liu. J. Construction, expression and characterization of the engineered antibody against tumor surface antigen P185c*2. Cell Res. 2003，13 :35_48)，如圖 1 所示。嵌 合抗體chA21的結(jié)構(gòu)兩條相同的蛋白鏈通過在Fc區(qū)形成的二硫鍵結(jié)合。每條蛋白鏈依次 由輕鏈可變區(qū)(VJ、linker、重鏈可變區(qū)(VH)和Fc區(qū)依次連接組成，其氨基酸序列如SEQ ID NO :9 所示，其中，第 1-114 位為 Vl，第 115-134 位為 linker，第 135-253 位為 VH，第 254-489 位為Fc。一、人源抗體模板的選擇序列相似性比對(duì)將chA21的輕鏈可變區(qū)與人源化抗體的輕鏈可變區(qū)進(jìn)行氨基酸 序列相似性比對(duì)，將chA21的重鏈可變區(qū)與人源化抗體的重鏈可變區(qū)進(jìn)行氨基酸序列相似 性比對(duì)。通過 IgBLAST(http://www.ncbi. nlm.nih. gov/igblast/)在蛋白數(shù)據(jù)庫(PDB, Protein Data Bank)中分別進(jìn)行序列相似性搜索。具體選擇搜索參數(shù)如下程序blastp ； 提交序列來源m0USe ；數(shù)據(jù)庫pdb ；比對(duì)序列來源human。顯示比對(duì)結(jié)果的數(shù)量可以根據(jù) 比對(duì)結(jié)果來具體選擇，其他參數(shù)可選擇默認(rèn)參數(shù)。在搜索的結(jié)果中，選擇與輕、重鏈均有較高序列相似性的抗體作為候選人源化抗 體模板，一般選擇相似性在50%以上作為選擇閾值，也可以根據(jù)具體的搜索結(jié)果選擇不同 的閾值。在ChA21的比對(duì)結(jié)果中，由于序列相似性高于50%的候選模板太多，所以提高選擇 閾值，選擇兩條鏈相似性均高于60%的抗體作為候選人源化抗體模板；結(jié)構(gòu)相似性比對(duì)再應(yīng)用PyMOL軟件通過分子疊合(align)比較候選人源化抗體 模板和ChA21的可變區(qū)(scFv，PDB號(hào)2GJJ)的整體空間結(jié)構(gòu)相似性(即蛋白中重鏈可變 區(qū)和輕鏈可變區(qū)一起組成的空間結(jié)構(gòu))和框架區(qū)空間結(jié)構(gòu)相似性(即蛋白中重鏈可變區(qū)中 框架區(qū)和輕鏈可變區(qū)中框架區(qū)一起組成的空間結(jié)構(gòu))(由RMS表示其結(jié)構(gòu)間差異的大小)， 各候選模板的序列比對(duì)和空間結(jié)構(gòu)比對(duì)結(jié)果見表1 (所有表中的序列編號(hào)均采用Kabat序 列編號(hào))。選擇結(jié)構(gòu)相似度最高的huCC49(PDB :1ZA6)(表中看應(yīng)該是最低)作為嵌合抗體 ChA21人源化的模板，兩抗體空間結(jié)構(gòu)的比對(duì)見圖2。其中模板1FVC是抗體4D5基于通用人源抗體模板VL k I-VHIII進(jìn)行人源改造而 獲得的已經(jīng)人源化的抗體hu4D5，其框架區(qū)序列與VLk I-VHIII基本一致，基于此通用模板 結(jié)構(gòu)對(duì)ChA21同時(shí)進(jìn)行人源化改造，用以比較本發(fā)明方法和通用方法的人化改造效果。表1、ChA21可變區(qū)與各候選模板序列和結(jié)構(gòu)相似性比對(duì) 二、抗原結(jié)合區(qū)的移植選擇ChA21的抗原結(jié)合區(qū)段?？贵wChA21的⑶R序列可以通過結(jié)合Kabat等人和 Chothia等人的序列定義加以鑒定，CDR序列劃分結(jié)果見表2。最終劃定的各CDR區(qū)為圖1 中帶下劃線的區(qū)段。表2、ChA21的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)序列劃分結(jié)果 由于抗體ChA21的單鏈可變區(qū)與其識(shí)別抗原部分亞區(qū)的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)已 經(jīng)獲得解析，其抗原結(jié)合區(qū)段可以直觀地從復(fù)合物結(jié)構(gòu)上獲得，如圖3所示?？梢钥闯鲋?鏈CDR2的后半段位于抗體分子的表面，既不參與抗原結(jié)合，對(duì)其他CDR區(qū)結(jié)構(gòu)也沒有影 響，也不參與抗體輕重鏈之間的相互作用，所以從提高序列人源化程度的要求考慮，將其 作為非抗原結(jié)合區(qū)，而不移植ChA21的重鏈⑶R2上的此段序列。將其余⑶R區(qū)域的殘基 替換抗體huCC49 (1ZA6)相應(yīng)位置上的CDR區(qū)域的殘基，得到最初版本的人源化抗體序列 HI (序列比較結(jié)果見圖4)，并應(yīng)用蛋白結(jié)構(gòu)模擬軟件MODELLER通過同源模擬得到其模擬的 空間結(jié)構(gòu)。(表3中給出的H3為H95-H102，此序列編號(hào)為Kabat序號(hào)，而非序列實(shí)際順序 編號(hào)，如圖1中所標(biāo)識(shí)的⑶R區(qū)H3序列為H95-H102 (SGNYEEYAMDY)，相對(duì)圖4中其位置為 101-111 (SGNYEEYAMDY)這一段。)三、HI框架區(qū)殘基的突變選擇(回變)基于最初版本人源化抗體HI的模擬的空間結(jié)構(gòu)，對(duì)一些重要的框架區(qū)殘基進(jìn)行 突變方向的篩選首先考慮的一類殘基是可能影響互補(bǔ)決定區(qū)構(gòu)象或結(jié)構(gòu)的殘基，或是可能直接影響抗原結(jié)合的殘基，根據(jù)之前對(duì)于此類框架殘基的研究，列出此類殘基的清單 (見表3)，這些殘基包括近30多種對(duì)⑶R結(jié)構(gòu)有潛在貢獻(xiàn)的游標(biāo)殘基(Vernier)；另外，在 模擬的HI結(jié)構(gòu)中選擇所有側(cè)鏈距離CDR殘基3埃以內(nèi)的殘基，從結(jié)構(gòu)角度考慮這些殘基也 可能直接影響CDR區(qū)殘基的構(gòu)象，而且它們恰好都包括在表3所列的游標(biāo)殘基之中。通常需 要將這些殘基全部突變?yōu)樵伎贵wChA21的相應(yīng)位點(diǎn)的殘基，稱為“回變”，但這樣做有可 能會(huì)因?yàn)樘砑恿朔侨嗽葱蛄械脑鴮?dǎo)致免疫原性增大的危險(xiǎn)，因此，在對(duì)游標(biāo)殘基的回 變選擇過程中，可保留一些側(cè)鏈位于抗體分子表面的游標(biāo)殘基，同時(shí)對(duì)于回變之后可能會(huì) 導(dǎo)致回變的殘基與其周圍殘基發(fā)生結(jié)構(gòu)沖突的殘基也應(yīng)選擇不回變，例如H69Leu- > Phe。 通過選擇回變得到人源化序列H1-1，其模擬結(jié)構(gòu)如圖5所示。表3、游標(biāo)殘基突變選擇
游標(biāo)殘基人源模板殘基鼠源ChA21殘基人源化Hl-1序列L2lielielieL4MetLeuLeuL35TrpTrpTrpL36TyrTyrTyrL46LeuLeuLeuL47LeuLeuLeuL48lielielieL49TyrSerSerL64GlyGlyGlyL66GlyGlyGlyL68GlyGlyGlyL69ThrThrThrL71PhePhePheL98PhePhePheH2ValValValH47TrpTrpTrp
13H48lielielieH49GlyGlyGlyH67AlaAlaAlaH69LeuPheLeuH71AlaValValH73ThrThrThrH78AlaAlaAlaH93ThrValValH94ArgArgArgH103TrpTrpTrp四、人源突變?cè)賹?duì)一些非抗原結(jié)合殘基進(jìn)行人化修飾。因?yàn)樗x人源模板抗體huCC49為已經(jīng) 人源化的抗體，其框架序列上也存在一些其人源化過程中回變?yōu)橛H代鼠源抗體的殘基，這 些殘基包含一些鼠源抗體共有的殘基和一些huCC49親代鼠源抗體mCC49特有的殘基，而后 者對(duì)于其他鼠源抗體來講不是必要的，因此從提高人源化程度的角度看，在不影響結(jié)構(gòu)穩(wěn) 定的基礎(chǔ)上，需要將這些殘基突變?yōu)橄鄳?yīng)的人源殘基。具體到H1-1的序列中，通過序列比 對(duì)，找到框架序列中既不同于ChA21也不同于人源化抗體huCC49的人源模板序列(huCC49 輕鏈模板序列LEN和huCC49重鏈模板序列21/28’CL)的位點(diǎn)，它們是VL中的殘基5、21和 106以及VH中的殘基61、62、80和91，選擇突變?yōu)槿嗽茨０逍蛄蠰EN和21/28，CL相應(yīng)位置 上的殘基(見表4)。最終獲得人源化序列H1-2，所有序列的比對(duì)結(jié)果見圖6。表4、非抗原結(jié)合序列人化改造
序列輕鏈VL重鏈Vh名稱L5L21L106H61H62H80H91Hl-1SerLeuLeuGluArgValPheChA21ThrMetlieGinLysMetTyrLEN 21/28， CLThrlielieGinLysMetTyrHl-2ThrlielieGinLysMetTyr 另外，以人源化抗體hu4D5(PDB :1FVC，通常被視為通用模板)為模板，通過相同方 法獲得人源化序列H2-1 (圖7)，該人源化的抗體作為對(duì)照，與本發(fā)明中人源化模板選擇方
14法得到的人源抗體相互比較對(duì)抗體親和力的影響。圖7中，hu4D5為人源化模板(即通用 模板)，H2為⑶R置換后得到的抗體(置換方法與上述步驟二中一致)，HumanVL-KappaI為 抗體hu4D5的輕鏈可變區(qū)對(duì)應(yīng)的人源序列，HumanVH-III為抗體hu4D5的重鏈可變區(qū)對(duì)應(yīng) 的人源序列，H2-1為最終人源化后的序列。實(shí)施例2、各種抗體的表達(dá)載體構(gòu)建一、pSectag2A_dFc 載體構(gòu)建pSectag2A載體購自Invitrogen公司。利用PCR擴(kuò)增Fc片段，設(shè)計(jì)引物在Fc片 段N端和C端分別加入EcoRI和Xhol酶切位點(diǎn)，然后將Fc片段用EcoRI和Xhol雙酶切，回 收雙酶切后片段；同時(shí)將pSeCtag2A質(zhì)粒用EcoRI和Xhol進(jìn)行雙酶切，回收雙酶切后片段； 將雙酶切后的Fc片段和pSectag2A載體用T4-DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入ToplO 感受態(tài)細(xì)胞，抽提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果，pSeCtag2A的EcoRI和Xhol酶切 位點(diǎn)間插入的基因序列如SEQ ID NO 2中第760-1470位核苷酸所示(即Fc片段)，表明 構(gòu)建的重組載體正確，將此載體記作pSectag2A-dFc，作為人源化抗體的表達(dá)載體。以scFv-Fc/pEE14(中國(guó)專利CN1613873)為模板，用如下引物，PCR擴(kuò)增，得到Fc 片段?；蛘呷斯ず铣蒘EQ ID NO 2中第760-1470位核苷酸所示的Fc片段。dFc-EcoRI 5，-AATGAATTCGCGGCCGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAA-3‘(下劃線為 EcoRI 和 NotI 位點(diǎn))dFc-XhoI :5，-TTTCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3'(下劃線為 Xhol 位點(diǎn))二、人源化抗體H1-1重組表達(dá)載體的構(gòu)建人工合成SEQ ID NO 2中第1-759位核苷酸所示基因(即VL+Linker+VH)，導(dǎo)入 載體pMD-19T(由大連寶生物合成)，命名為PMD-19T-H1-1。以pMD_19T-Hl_l為模板，在 引物 PO(PHl-Sfil) :5，-ATATGGCCCAGCCGGCCGACATCGTTTTGTCTCAATCTCCAGACTCTTTG-3，和 P7 (Hl-Rv-Notl) 5，-ATATGCGGCCGCAGAAACAGTAACCAAAGTACC-3，的引導(dǎo)下進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，對(duì) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收目的條帶，命名為“H1-1”。用限制性內(nèi)切 酶Sfil和Not I對(duì)獲得的H1-1基因片段分別進(jìn)行單酶切，再將酶切片段分別與經(jīng)相同酶 酶切的質(zhì)粒pSectag2A-dFc用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO或 DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性重組子，抽提質(zhì)粒DNA，測(cè)序，結(jié)果在pSectag2A-dFc的Sfil和 Not I位點(diǎn)間插入的基因序列如SEQ IDN0 2中第1-759位核苷酸所示。將陽性重組質(zhì)粒命 名為pSectag2A-dFc-Hl-l。該重組載體中含有SEQ ID NO :2所示基因，該基因中第1-342 位是\，第343-402位是Linker，第403-759位是VH，第760-1470位是Fc ；該基因編碼的蛋 白如SEQ ID NO :1所示，該蛋白中第1-114位是Vl，第115-134位是Linker，第135-253位 是乂11，第 254-489 位是 Fc。三、人源化抗體H1-2重組表達(dá)載體的構(gòu)建(一)表達(dá)H1-V1的重組載體構(gòu)建在得到的H1-1的基因序列基礎(chǔ)上通過點(diǎn)突變的方法獲得H1-2的編碼序列。具體 方法如圖8所示，分兩輪點(diǎn)突變進(jìn)行，先對(duì)H1-1進(jìn)行第一輪點(diǎn)突變獲得H1-V1中間突變體， 再對(duì)H1-V1進(jìn)行第二輪點(diǎn)突變獲得H1-2的序列。對(duì)人源化抗體H1-1的突變位點(diǎn)如表5所示表5、人源化抗體H1-V1基因的突變位點(diǎn)表位點(diǎn)L5L21L106H80H91H1-1S(TCT)L (TTG)L (TTG)V (GTT)F (TTC)H1-V1T (ACT)I (ATT)I (ATT)M(ATG)Y (TAC)采用定點(diǎn)突變法分三段擴(kuò)增帶有上述突變位點(diǎn)的序列，然后用搭橋PCR法，擴(kuò)增 得到人源化抗體H1-V1編碼基因序列，具體方法包括以下步驟1)人源化抗體H1-V1編碼基因的5’端序列的擴(kuò)增以 pMD-19T-Hl-l 為模板，在引物 P2 (P5T_21I_Fw) 5，-ACTCAATCTCCAGACTCTTTGGC TGTTTCTTTGGGTGAAAGAGTTACTATTAACTGT-3’和P3 (P112I-Rv) :5，-CTAAGTTGGAAATTAAGAGAGG TGGTGG-3’的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的條帶，命名為“H1-V1-5’ ”。2)人源化抗體H1-V1編碼基因的中間段序列的擴(kuò)增以 pMD-19T-Hl 為模板，在引物 P4 (P112I_Fw) 5，-CTAAGTTGGAAATTAAGAGAGGTGGTG G-3，和 P5(P215M-RV) :5，-GTCTTCCGATCTCAAAGAAGACAATTCCATGTAAGCAG-3，的引導(dǎo)下進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，回收目的條帶，命名為“Hl-Vl-m”。3)人源化抗體H1-V1編碼基因的3’端序列的擴(kuò)增以 pMD-19T-Hl 為模板，在引物 P6 (P229Y_Fw) 5，-GTCTTCTTTGAGATCGGAAGACACTGC TGTTTACTACTGTG-3，和 P7(Hl-Rv-Notl) :5， -ATATGCGGCCGCAGAAACAGTAACCAAAGTACC-3，的 引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的條帶，命名為“H1-V1-3’ ”。4)人源化抗體H1-V1編碼基因的獲得以步驟1)擴(kuò)增的H1-V1-5’、步驟2)擴(kuò)增的Hl-Vl-m和步驟3)擴(kuò)增的H1_V1_3’ 基因這三個(gè)片斷為模板在引物PI (P5T-Sfil) :ATATGGCCCAGCCGGCCGACATCGTTTTGACTCAATCTCCAGACTCTTTG和P7的引導(dǎo)下進(jìn)行搭橋PCR擴(kuò)增，回收目的條 帶，命名為“H1-V1”5)人源化抗體H1-V1編碼基因的表達(dá)載體的獲得用限制性內(nèi)切酶Sfil和NotI對(duì)步驟4)獲得的H1-V1基因片段分別進(jìn)行單酶切， 再將酶切片段分別與經(jīng)相同酶雙酶切的質(zhì)粒pSectag2A-dFc連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿 菌ToplO感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性重組子，抽提質(zhì)粒DNA，測(cè)序，結(jié)果在pSectag2A-dFc的Sfil 和NotI位點(diǎn)間插入的基因序列如SEQ ID NO 6中第1-759位核苷酸所示。將陽性重組質(zhì) 粒命名為pSeCtag2A-dFC-Hl-Vl。該重組載體中含有SEQ ID NO :6所示基因，該基因中第 1-342位是\，第343-402位是Linker，第403-759位是VH，第760-1470位是Fc ；該基因 編碼的蛋白如SEQ ID NO :5所示，該蛋白中第1-114位是八，第115-134位是Linker，第 135-253 位是 VH，第 254-489 位是 Fc。(二)表達(dá)H1-2的重組表達(dá)載體的構(gòu)建對(duì)人源化抗體H1-V1的以下位點(diǎn)進(jìn)行突變得到H1-2，突變位點(diǎn)如(表6)所示表6人源化抗體H1-2的突變位點(diǎn)位點(diǎn)H61H62H1-V1E(GAA)R(AGA)H1-2Q(CAA)K(AAA)采用定點(diǎn)突變法擴(kuò)增帶有上述突變位點(diǎn)的人源化抗體H1-2編碼基因，具體方法 包括以下步驟1)人源化抗體H1-2編碼基因的5’端序列的擴(kuò)增以 pSectag2A-dFc-Hl-Vl 為模板，在引物 PI 和 P8(Hl_2_Rv) 5，-GCCTTACCCTTGAA TTTTTGGTTGTAAGTAGAAG-3，的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的條帶，命名為“H1-2-5，，，。2)人源化抗體H1-2編碼基因的3’端序列的擴(kuò)增以 pSectag2A-dFc-Hl-Vl 為模板，在引物 P9 (Hl-2-Fw) 5，-CTTCTACTTACAACCAAAA ATTCAAGGGTAAGGC-3’和P7 的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的條帶，命名為“H1-2-3’ ”。3)人源化抗體H1-2編碼基因的獲得以步驟1)擴(kuò)增的H1-2-5’和步驟2)擴(kuò)增的H1-2-3’基因片斷為模板在引物P1 和P7的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的條帶，命名為“H1-2 ”。4)人源化抗體H1-2編碼基因的表達(dá)載體的獲得用限制性內(nèi)切酶Sfil和NotI對(duì)步驟3)獲得的H1-2基因片段分別進(jìn)行單酶切，再 將酶切片段分別與經(jīng)相同酶雙酶切的質(zhì)粒pSectag2A-dFc連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 ToplO感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性重組子，抽提質(zhì)粒DNA，測(cè)序，結(jié)果在pSectag2A-dFc的Sfil和 NotI位點(diǎn)間插入的基因序列如SEQ ID NO 4中第1-759位核苷酸所示。將陽性重組質(zhì)粒命 名為pSectag2A-dFc-Hl-2。該重組載體中含有SEQ ID NO :4所示基因，該基因中第1-342 位是\，第343-402位是Linker，第403-759位是VH，第760-1470位是Fc ；該基因編碼的蛋 白如SEQ ID NO :3所示，該蛋白中第1-114位是八，第115-134位是Linker，第135-253位 是乂11，第 254-489 位是 Fc。四、人源化抗體H2-1重組表達(dá)載體的構(gòu)建合成SEQ ID N0:8中自5'末端起第1_759位核苷酸所示基因，并導(dǎo)入載體 PMD-19T，測(cè)序驗(yàn)證，將陽性重組子命名為pMD-19T-H2-l。以pMD_19T-H2_l為模板，在引 物 P10(PH2-Sfil) :5’ -ATAT GGCC CAGCC GGCC GACATCCAATTGACTCAATCTCCATCTTCTTTG-3’ 和 P7 (Hl-Rv-Notl) :5，-ATATGCGGCCGCAGAAACAGTAACCAAAGTACC-3，的引導(dǎo)下進(jìn)行 PCR 擴(kuò) 增，回收目的條帶，命名為“H2-1”。用限制性內(nèi)切酶Sfil和NotI對(duì)獲得的H2-1基因片 段分別進(jìn)行單酶切，再將酶切片段分別與經(jīng)相同酶雙酶切的質(zhì)粒pSeCtag2A-dFC連接，得 到的陽性重組質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果在pSectag2A-dFc的Sfil和NotI位點(diǎn)間插入的基 因序列如SEQ ID NO :8中自5'末端起第1-759位核苷酸所示，將陽性重組質(zhì)粒命名為 pSectag2A-dFc-H2-l。該重組載體中含有SEQ ID NO :8所示基因，該基因中第1-342位是 \，第343-402位是Linker，第403-759位是VH，第760-1470位是Fc ；該基因編碼的蛋白如 SEQ ID NO :7所示，該蛋白中第1-114位是八，第115-134位是Linker，第135-253位是VH， 第 254-489 位是 Fc。
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五、嵌合抗體ChA21重組表達(dá)載體的構(gòu)建嵌合抗體ChA21的表達(dá)載體的構(gòu)建方法與中國(guó)專利CN1613873中所述一致。實(shí)施例3、瞬轉(zhuǎn)293T細(xì)胞表達(dá)人源化抗體及表達(dá)產(chǎn)物的純化(一)抗體111-1、111-2、112-1、11141、0^21 的表達(dá)和純化293T細(xì)胞購自ATCC，產(chǎn)品目錄號(hào)為CRL-11268。DMEM培養(yǎng)基購自GIBC0，產(chǎn)品目錄號(hào)為11960。提前培養(yǎng)足夠量的293T細(xì)胞(DMEM/10%血清雙抗)(雙抗為青霉素和鏈霉 素，購自上海生工，貨號(hào)BS732)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%左右滿度，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)被用于轉(zhuǎn)染 重組抗體質(zhì)粒DNA。轉(zhuǎn)染步驟如下(1)在lml DMEM中加入20ul Lipofectamine 2000，用手指彈勻或 槍頭混勻，室溫靜置5分鐘。(2)然后在lml DMEM中加入10ug準(zhǔn)備好轉(zhuǎn)染用的質(zhì)粒DNA，混 勻。(3)將(1)和(2)混合(需要轉(zhuǎn)到一個(gè)4ml離心管)，混勻，室溫靜置20-30分鐘(混 合物需要在1小時(shí)內(nèi)做完轉(zhuǎn)染)；(4)在20-30分鐘等待時(shí)間，將293T細(xì)胞培養(yǎng)基吸掉，加 入5-8ml PBS洗滌細(xì)胞一遍(盡量除去殘余PBS)，然后加入8ml DMEM，備用；(5)將(3)的 混合液加入(4)中，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶混勻，并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染時(shí)間一般為8-16 小時(shí)。轉(zhuǎn)染16小時(shí)后換新鮮的DMEM培養(yǎng)基(加入雙抗防止染菌)。每?jī)商焓占?一次培養(yǎng)上清，上清用3000rpm離心10分鐘，收集上清，置于4°C ( 一星期內(nèi)使用)或 者-80°C (長(zhǎng)期)保存。上清中含有抗體111-1、111-2、112-1、11141或0^21。(二)CH0表達(dá)并純化的ChA21嵌合抗體(ChA21_CH0)的方法CH0表達(dá)并純化的ChA21嵌合抗體(ChA21_CH0)的方法與中國(guó)專利CN1613873中
所述一致?？贵wChA21與抗體ChA21-CH0的序列無差別，不同的是抗體ChA21是由293T細(xì)胞 表達(dá)出來的，抗體ChA21-CH0是由CH0-GS工程細(xì)胞株表達(dá)出來的。實(shí)施例4、ChA21抗體的人源化突變體的親和活性的測(cè)定一、相對(duì)親和活性測(cè)定選擇ELISA法測(cè)抗體相對(duì)親和活性。ELISA法測(cè)抗體相對(duì)親和活性步驟如下兔抗人Fc多抗購自Sigma，產(chǎn)品目錄號(hào)為A9544?？乖璆ST-EPI的制備方法如下I. GST-EPI 質(zhì)粒構(gòu)建人工合成Her2胞外I-II區(qū)基因(SEQ ID N0:10)。將合成基因使用EcoR 1(購 自Promega，貨號(hào)R6011)和Xho I (購自Promega，貨號(hào)R6161)進(jìn)行雙酶切，連接到經(jīng)同樣 酶切的PGEX/4T-1 (購自GE Healthcare，貨號(hào)27-4580-01)載體后，挑克隆雙酶切鑒定后和 測(cè)序鑒定，結(jié)果在PGEX/4T-1的EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)間插入的基因序列如SEQ ID NO 10中第1-603位核苷酸所示，測(cè)序正確的克隆命名為PGEX/4T-1-EPI。II. GST-EP I的原核表達(dá)與純化將pGEX/4T-l-EPI 轉(zhuǎn)化至 Origami B 感受態(tài)(購自 novagen，貨號(hào) 71408-3)，挑選 陽性表達(dá)克隆。將陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，待培養(yǎng)瓶中的菌液0D600值達(dá)到約0. 6左右后，加入IPTG (購自Merch，貨號(hào)420291-5GM)至終濃度為ImM進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，16°C，220rpm繼 續(xù)培養(yǎng)20h ；5000g, 10min，4°C離心收菌，液壓破碎后以16000g，20min，4°C離心收集裂解液 上清；用GSTrap FF(購自GE Healthcare，貨號(hào)17-5131-02)純化裂解上清中GST-EP I，脫 鹽后放于-80°C凍存?zhèn)溆谩?)確定瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的抗體突變體的表達(dá)量兔抗人Fc多抗稀釋于NaHC03水溶液中 (終濃度約lug/ml)鋪ELISA板，4°C冰箱過夜或者37°C烘箱2_3小時(shí)；5%脫脂奶粉溶于 TPBS，37°C封閉1小時(shí)；加入不同濃度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)抗體和各293T表達(dá)上清，室溫震蕩溫育1 小時(shí)。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)抗體(ChA21-CH0)將CH0表達(dá)并純化的ChA21嵌合抗體(ChA21_CH0)，先用 DMEM培養(yǎng)基稀釋到lug/ml，然后用封閉劑依次稀釋到100，50，25，12. 5,6. 25，3. 13，1. 56， 0. 78ng/ml，總共8個(gè)濃度，用作標(biāo)準(zhǔn)曲線；對(duì)表達(dá)上清直接用封閉劑稀釋10，40，160，640 倍。加入1 2000稀釋的羊抗人/HRP 二抗，室溫震蕩溫育1小時(shí)，0PD底物顯色，硫酸終 止。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每個(gè)突變體抗體表達(dá)量。2)測(cè)定人源化抗體突變體的相對(duì)親和力這里使用的抗原為GST-EPI，EPI即膜 抗原ErbB2胞外I/II區(qū)，它包含了 ChA21及其人源化突變體的識(shí)別表位，以GST融合蛋白 形式表達(dá)的EPI可代替全抗原ErbB2用于抗體變異體的親和力測(cè)定。GST-EPI (lmg/ml儲(chǔ) 液)，以1 4000稀釋于NaHC03水溶液中(終濃度約0. 25ug/ml)鋪ELISA板，4°C冰箱過 夜或者37°C烘箱2-3小時(shí)；5%脫脂奶粉溶于TPBS，37°C封閉1小時(shí)；加入不同濃度稀釋 的標(biāo)準(zhǔn)抗體(ChA21-CH0)和突變體轉(zhuǎn)染293T的表達(dá)上清，室溫震蕩溫育1小時(shí)。標(biāo)準(zhǔn)抗 體(ChA21-CH0)和突變體表達(dá)上清用封閉劑稀釋到1000，333，111，37，12. 33，4. 11，1.37， 0. 46ng/ml。加入1 2000稀釋的羊抗人/HRP 二抗，室溫震蕩溫育1小時(shí)。0PD底物顯色， 硫酸終止。根據(jù)曲線計(jì)算每個(gè)突變體EC50值，原始標(biāo)準(zhǔn)抗體與突變體的EC50值的比值即 為突變體的相對(duì)親和力。原始抗體和各人源突變體的抗原結(jié)合曲線如圖9所示，以293T表達(dá)的原始ChA21 嵌合抗體(抗體ChA21)活性作為對(duì)照，計(jì)算出人源化突變體Hl-1、Hl-Vl、H1-2和H2-1的 相對(duì)親和力分別為0. 95,0. 92、0. 93、0. 4。結(jié)果表明以抗體huCC49為模板進(jìn)行人源化改造 獲得的人源化突變體H1-1、H1-V1、H1_2基本維持了 ChA21的抗原結(jié)合能力，而基于通用人 化模板進(jìn)行人源化改造獲得的人源化突變體H2-1的抗原結(jié)合能力降低了一倍以上。該實(shí) 驗(yàn)也表明在293T細(xì)胞表達(dá)的ChA21嵌合抗體(抗體ChA21)與在CH0-GS工程細(xì)胞株表達(dá) 的抗體(抗體ChA21-CH0)具有相當(dāng)?shù)挠H和力。二、表面胞質(zhì)團(tuán)共振法測(cè)突變體H1-2的結(jié)合常數(shù)KdHer2 % Recombinant Human ErbB2/Fc Chimera，_ 自 R and D Systems,^ 號(hào) 1129-ER禾lj 用 Biacore 3000 (Malmqvist M. (1999) BIACORE :an affinity biosensor system for characterization of biomolecular interactions. Biochem Soc Trans. Feb ；27 (2) 335-40)測(cè)人源化抗體Hl_2與抗原的絕對(duì)親和力。選用CM_5傳感片，表面吸附 羧甲基葡聚糖。兩個(gè)流通池(pathway)均以15iil/min的流速活化6min，將2 y g抗原Her2 溶于50iU pH7.0的磷酸溶液，以lOiU/min的流速注入芯片流通池1，其表面密度約為10K Ru，抗原標(biāo)記后再用1M乙醇胺將芯片表面封閉。結(jié)合條件各檢測(cè)抗體原液濃度為10mg/ ml，依次稀釋成 200 u g/ml，100 u g/ml，50 u g/ml，25 u g/ml ,12u g/ml，0 u g/ml，以 10 yl/min的速度注入芯片的兩個(gè)流通池，上樣3min ；解離條件流速10 yl/min，解離3min。芯片 再生條件10mM NaOH, 1M NaCl。用Biacore evaluation軟件分析抗體親和常數(shù)KD。
經(jīng)計(jì)算，H1-2抗體親和常數(shù)KD = 10_8M。
權(quán)利要求
一種蛋白，是如下任一所述蛋白質(zhì)a)由序列表中序列3中自N末端起第1 253位氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；c)將a)限定的蛋白中自其N末端起第115 134位氨基酸經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白質(zhì)；d)將b)限定的蛋白中自其N末端起第115 134位氨基酸和/或第254 489位氨基酸經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白質(zhì)；e)由序列表中序列1中自N末端起第1 253位氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；f)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；g)將e)限定的蛋白中自其N末端起第115 134位氨基酸經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白質(zhì)；h)將f)限定的蛋白中自其N末端起第115 134位氨基酸和/或第254 489位氨基酸經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白質(zhì)；i)由序列表中序列5中自N末端起第1 253位氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；j)由序列表中序列5所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；k)將i)限定的蛋白中自其N末端起第115 134位氨基酸經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白質(zhì)；l)將j)限定的蛋白中自其N末端起第115 134位氨基酸和/或第254 489位氨基酸經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的具有相同功能的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦氯我凰?)編碼所述a)所示蛋白的編碼基因?yàn)楹塑账嵝蛄惺切蛄斜碇行蛄?自5'末端起第 1-759位核苷酸所示DNA分子；2)編碼所述b)所示蛋白的編碼基因?yàn)楹塑账嵝蛄惺切蛄斜碇行蛄?所示DNA分子；3)編碼所述e)所示蛋白的編碼基因?yàn)楹塑账嵝蛄惺切蛄斜碇行蛄?自5'末端起第 1-759位核苷酸所示DNA分子；4)編碼所述f)所示蛋白的編碼基因?yàn)楹塑账嵝蛄惺切蛄斜碇行蛄?所示DNA分子；5)編碼所述i)所示蛋白的編碼基因?yàn)楹塑账嵝蛄惺切蛄斜碇行蛄?自5'末端起第 1-759位核苷酸所示DNA分子；6)編碼所述j)所示蛋白的編碼基因?yàn)楹塑账嵝蛄惺切蛄斜碇行蛄?所示DNA分子；7)在嚴(yán)格條件下與1)_6)任一限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；8)與1)_6)任一限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組病毒或 表達(dá)盒；和/或，所述重組載體是在pSectag2A載體的多克隆位點(diǎn)插入所述編碼基因得到的。
5.一種抗體，由兩個(gè)相同的權(quán)利要求1中所述蛋白組成；所述兩個(gè)相同的蛋白通過二 硫鍵連接。
6.權(quán)利要求1所述蛋白或權(quán)利要求2或3所述編碼基因或權(quán)利要求5中所述抗體在制 備預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
7.抗體的人源化改造的方法，包括如下步驟(1)、按照如下I或II所述方法選擇得到人源化抗體模板I、選擇重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)分別與待改造抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨 基酸序列相似性均在50%以上或60%以上的人源化抗體，將其作為預(yù)人源化抗體模板；從所述預(yù)人源化抗體模板中選擇與待改造抗體的可變區(qū)空間結(jié)構(gòu)相似性值最高的人 源化抗體作為人源化抗體模板；II、選擇滿足如下i)和ii)所示條件的人源化抗體，將其作為預(yù)人源化抗體模板；i)重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)分別與待改造抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸 序列相似性均在50%以上或60%以上； )重鏈可變區(qū)的框架區(qū)和輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)分別與待改造抗體的重鏈可變區(qū)的框 架區(qū)和輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)的氨基酸序列相似性均在50%以上或60%以上；從所述預(yù)人源化抗體模板中選擇與待改造抗體的可變區(qū)空間結(jié)構(gòu)相似性值最高的人 源化抗體作為人源化抗體模板；所述可變區(qū)空間結(jié)構(gòu)為如下a)和/或b)所示a)重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)一起構(gòu)成 的空間結(jié)構(gòu)；b)重鏈可變區(qū)中的框架區(qū)和輕鏈可變區(qū)中的框架區(qū)一起構(gòu)成的空間結(jié)構(gòu)；(2)、按照如下III或IV所示方法獲得被置換后的人源化抗體模板III、用所述待改造抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)中的至少一個(gè)CDR氨基酸序列置 換所述人源化抗體模板中對(duì)應(yīng)的CDR氨基酸序列，獲得被置換后的人源化抗體模板；IV、用所述待改造抗體的抗原結(jié)合區(qū)氨基酸序列置換所述人源化抗體模板中對(duì)應(yīng)的抗 原結(jié)合區(qū)氨基酸序列，獲得被置換后的人源化抗體模板；(3)、將所述步驟(2)中的被置換后的人源化抗體模板作為改造后的目的人源化抗體；(4)用基因工程方法表達(dá)得到所述改造后的目的人源化抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述步驟(2)后，所述步 驟(3)前，包括如下回變步驟將所述步驟(2)得到的抗體的框架區(qū)的至少一個(gè)氨基酸殘基 替換為所述待改造抗體中相應(yīng)位置的氨基酸殘基，至得到的抗體空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，將得到的 抗體作為改造后的目的人源化抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述回變步驟中，被替換的氨基酸殘 基為影響步驟⑵得到的抗體的CDR區(qū)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性或影響步驟⑵得到的抗體的抗原結(jié)合 區(qū)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的氨基酸殘基；和/或，所述回變步驟中，被替換的氨基酸殘基位于所述步驟(2)得到的抗體的游標(biāo)區(qū) 和/或被替換的氨基酸殘基位于所述步驟(2)得到的抗體的側(cè)鏈中距離所述CDR氨基酸殘 基3埃以內(nèi)；和/或，所述方法中，在所述回變后，所述步驟(3)前，包括如下人源突變步驟將所述 回變得到的抗體的框架區(qū)內(nèi)非人源的且不同于所述待改造抗體中相應(yīng)位置氨基酸的氨基 酸殘基突變?yōu)槿嗽窗被釟埢瑢⒌玫降目贵w作為改造后的目的人源化抗體。
10.由權(quán)利要求7-9中任一所述方法得到的人源化抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人源化抗體及其人源化改造方法。該抗體是如下任一所述蛋白質(zhì)a)由序列表中序列3中自N末端起第1-253位氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明改造后的抗體構(gòu)架未改變的最初的嵌合抗體相比，與抗原的親和力相近，并已經(jīng)達(dá)到了完全的人源化，具有更好的臨床應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101928345SQ20101021155
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2010年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月21日
發(fā)明者劉兢, 常亮, 肖衛(wèi)華, 胡思怡, 郭雨剛 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)