專利名稱：一種提高綿羊卵母細胞體外利用效率的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及磷酸二酯酶抑制劑(PDE)milrin0ne，對經(jīng)過BCB篩選后的質量不好的 BCB陰性卵母細胞進行抑制的方法，能顯著提高綿羊卵母細胞體外成熟率。
背景技術：
PDEs是一類能水解細胞內(nèi)環(huán)核苷酸第二信使的同工酶，在哺乳動物中，根據(jù)PDE 動力學、底物特異性、組織細胞中的分布、抑制劑和激動劑以及氨基酸序列而將其分為11 類，PDE3是其中一類。許多研究表明，哺乳動物卵母細胞減數(shù)分裂恢復受第二信使cAMP調(diào) 節(jié)，而PDE是調(diào)控細胞內(nèi)cAMP水平的一種關鍵酶，因此PDE能夠阻滯體外培養(yǎng)卵母細胞減 數(shù)分裂的恢復，在卵母細胞成熟分裂的調(diào)控過程中起重要作用。在前期研究的一種用于綿羊卵母細胞體外的篩選培養(yǎng)方法(專利申請?zhí)?200910113567. 9)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過BCB篩選后的陰性卵母細胞成熟率極顯著低于陽性卵母細 胞，因而，如何提高陰性卵母細胞質量成為亟待解決的問題。文獻檢索披露1. Biology of Reproduction, 69 (2003)，2045-2052，作者D. Nogueira 等，發(fā)表的《磷酸二酯酶抑制劑 3 在 小鼠體外未成熟卵母細胞發(fā)育能力中的作用》文章得出，10 u Mol/L PDE3抑制劑短暫阻滯 小鼠卵母細胞減數(shù)分裂，能促進其發(fā)育能力。2. Fertility and Sterility, 91, 5 (2009), 2037-2042，作者Byimg Chul Jee, M. D.發(fā)表的《成熟培養(yǎng)液中磷酸二酯酶抑制劑3對小 鼠胚胎發(fā)育的作用》文章內(nèi)容是，比較了 1 P Mol/L、5 ii Mol/L、10 u Mol/L濃度的PDE3抑制 劑分別作用6h和24h，對小鼠卵母細胞的成熟、受精及后期發(fā)育沒有影響。3.Biology of Reproduction, 66 (2002)，180-184，作者Mario A. Mayes 等發(fā)表的《PDE3 和 PDE4 在維持牛 卵母細胞減數(shù)分裂阻滯中的作用》的文章中得出，PDE3在維持牛卵母細胞減數(shù)分裂阻滯中 起重要作用，而 PDE4 不起作用。4. Biology of R印roduction，74 (2006)，177-184，作者 D. Nogueira等發(fā)表的《PDE3能提高人卵母細胞體外成熟及后期發(fā)育能力》，文章得出用 PDE3抑制的人卵母細胞將近98%阻滯在減數(shù)分裂時期，成熟率極顯著高于未抑制組。國內(nèi)有廣西大學動物繁殖研究所卞桂華等5人發(fā)表的《磷酸二酯酶抑制劑對水牛 卵母細胞減數(shù)分裂成熟的影響》、內(nèi)蒙古大學哺乳動物生殖生物學與生物技術教育部重點 實驗室周波等4人發(fā)表的《磷酸二酯酶亞型抑制劑與細胞周期蛋白抑制劑對綿羊卵母細胞 體外成熟的影響》、中國農(nóng)業(yè)大學生物學院卜淑敏等3人發(fā)表的《3種磷酸二醋酶對小鼠卵 母細胞自發(fā)成熟的影響》以及西北農(nóng)林科技大學生物工程研究所馬利兵等5人發(fā)表的《磷 酸二酯酶抑制劑對山羊卵母細胞體外成熟及孤雌胚發(fā)育的影響》。本發(fā)明將PDE3與BCB篩 選技術相結合作為本方法的切入點，展開的方法學與應用學的研究，具有重要的實踐意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目在于為提高綿羊卵母細胞的質量，即先采用BCB染色篩選，再對篩選 后的質量差的卵母細胞用milrinone進行抑制培養(yǎng)，效果十分明顯，該方法簡單易操作，實 用性極強。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種提高綿羊卵母細胞體外利用效率的方法，將染 色分離獲取的質次BCB-卵母細胞，用含有50-100 u Mol/L的PDE3抑制劑milrinone的成 熟培養(yǎng)液洗滌2-3次，培養(yǎng)6-9小時，用不含有milrinone的成熟培養(yǎng)液洗滌2_3次，培養(yǎng) 至24小時；脫去卵母細胞周圍的顆粒細胞，移至洗滌液內(nèi)，撿出排出第一極體的卵母細胞， 統(tǒng)計極體排除率即成熟率；將排出第一極體的卵母細胞用5 u Mol/L離子霉素激活4-5分 鐘，洗滌液洗滌1-3次，再用2-3小時前在C02箱平衡好的2mMol/L 6-甲氨基嘌呤激活2_3 小時，用2小時前在C02箱平衡好的培養(yǎng)液洗滌3-4次，入培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)48小時后統(tǒng)計卵 裂率，168小時后統(tǒng)計囊胚率即可；其中BCB-卵母細胞的獲取摘取宰殺30分鐘內(nèi)的綿羊卵巢，置入溫度在 30-35°C，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml鏈霉素的生理鹽水中，3小時內(nèi)用生理鹽水清洗 3-4次；用吸有1ml抽卵液，帶有9號針頭的10ml注射器抽吸卵巢表面2_8mm大小的卵泡， 將注射器內(nèi)回收的卵泡液打在35-60mm的皿內(nèi)，在顯微鏡下?lián)斐雎涯讣毎?，放入添加濃?為25-30 u Mol/L的BCB染色液，至于35-39°C水浴中染色80-90分鐘；在顯微鏡下將BCB+ 和BCB-卵母細胞分離；其中染色分離的BCB+卵母細胞用成熟培養(yǎng)液洗滌2-3次，培養(yǎng)至24小時，直接利 用即可；其中實驗液體的配制抽卵液TCM199-h印es+lmg/ml PVA+0. 7mg/ml 肝素鈉；亮甲酚藍染色液26iiMol/L亮甲酚藍+PBS+5mg/ml BSA ；含有milrinone 的成熟培養(yǎng)液50_100 ii Mol/L milrinone+TCM199-HC03+10 % FBS+0. 05IU/ml FSH+0. 05IU/ml LH+1 u g/ml estradiol+24. 2 ii g/ml 丙酮酸鈉+0. ImM/L半 胱氨酸 +10ng/ml EGF+lOOIU/ml 雙抗；成熟培養(yǎng)液TCM199-HC03+10% FBS+0. 05IU/ml FSH+0. 05IU/ml LH+1 u g/ mlestradiol+24. 2 u g/ml 丙酮酸鈉 +0. ImM/L 半胱氨酸 +10ng/ml EGF+lOOIU/ml 雙抗；洗滌液10%FBS+90% TCM199-hepes ；S0F 6. 29mg/ml NaCL+0. 534mg/ml KCL+0. 162mg/ml KH2P04+0. 6 u 1/ml 乳酸鈉 +0. 089mg/mlMgS04+2. lmg/mlNaHC03+0 . 0 3 5 7mg/ml 丙酮酸鈉 +0. 299mg/mlCaCL2 2H20 ；培養(yǎng)液S0F+3mg/mlBSA ;離子霉素5iiMol/L離子霉素+1 % 二甲基亞砜+10 %胎牛血清+89 % TCM199-hepes；6-甲氨基嘌呤2mMol/L 6-甲氨基嘌呤+1 %二甲基亞砜+10%胎牛血清+89% TCM199-HC03。所述的提高綿羊卵母細胞質量的方法，顯微鏡下的著藍色的卵母細胞被設為 BCB+，沒著藍色的卵母細胞設為BCB-，BCB-的卵母細胞細胞質量顯著低于BCB+。所述的提高綿羊卵母細胞質量的方法，脫去卵母細胞周圍的顆粒細胞，是將卵母 細胞置于濃度為0. 1 %的透明質酸酶溶液內(nèi)，經(jīng)反復吹吸即可。所述的提高綿羊卵母細胞質量的方法，所用試劑均為專項訂購或市售產(chǎn)品。本發(fā)明的構思及研究機理表明添加PDE3特異性抑制因子(如c i 1 ostami de， milrinone)能有效抑制PDE3活性，維持胞內(nèi)cAMP高濃度，從而阻滯卵母細胞的自發(fā)減數(shù)分裂，為核質同步成熟提供時間，恢復成熟培養(yǎng)后，體外培養(yǎng)囊胚發(fā)育率能顯著提高。本發(fā)明在前期的研究中，已經(jīng)驗證了亮甲酚藍染色(BCB)(專利申請?zhí)?200910113567. 9)可用于測定G6PDH活性，根據(jù)G6PDH活性的不同，BCB染色呈現(xiàn)不同程度 的著色；并且發(fā)現(xiàn)BCB-卵母細胞體外培養(yǎng)的成熟率、卵裂率、囊胚率顯著低于BCB+組，因此 采用milrinone抑制劑與BCB篩選技術相結合；就是將BCB-卵母細胞使用milrinone抑制 劑進行抑制，能提高BCB-卵母細胞質量，而BCB+卵母細胞質量不受任何影響，從而能提高 卵母細胞總體利用率。本發(fā)明構思以提高卵母細胞總體利用率為切入點，采用milrinone抑制劑與BCB 篩選技術相結合的技術路線科學合理，組合方法達到了創(chuàng)新效果，且有獨到之處，彰顯技術 進步。
具體實施例方式實施例實驗操作方法摘取宰殺30分鐘內(nèi)的綿羊卵巢，置入溫度在30_35°C，含1000IU/ml青霉素和 1000IU/ml鏈霉素的生理鹽水中，3小時內(nèi)用生理鹽水清洗3次；用吸有1ml抽卵液，帶有9 號針頭的10ml注射器抽吸卵巢表面6mm大小的卵泡，將注射器內(nèi)回收的卵泡液打在45mm 的皿內(nèi)，在顯微鏡下?lián)斐雎涯讣毎?，放入添加濃度?0iiMol/L的BCB染色液，至于36°C 水浴中染色90分鐘；在顯微鏡下將BCB+和BCB-卵母細胞分離；BCB+卵母細胞直接用成 熟培養(yǎng)液洗滌2次，培養(yǎng)至24小時；再將BCB-卵母細胞用含有80 u Mol/L的PDE3抑制劑 milrinone的成熟培養(yǎng)液洗滌2次，培養(yǎng)8小時，用不含有milrinone的成熟培養(yǎng)液洗滌3 次，培養(yǎng)至24小時；脫去卵母細胞周圍的顆粒細胞，移至洗滌液內(nèi)，撿出排出第一極體的卵 母細胞，統(tǒng)計極體排除率即成熟率；將排出第一極體的卵母細胞用5 y Mol/L離子霉素激活 4分鐘，洗滌液洗滌2次，再用3小時前在C02箱平衡好的2mMo 1/L 6-甲氨基嘌呤激活3 小時，用2小時前在C02箱平衡好的培養(yǎng)液洗滌3次，入培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)48小時后統(tǒng)計卵裂 率，168小時后統(tǒng)計囊胚率即可；其中染色分離的BCB+卵母細胞用成熟培養(yǎng)液洗滌3次，培養(yǎng)至24小時，直接利用 即可；其中實驗液體的配置抽卵液TCM199-h印es+lmg/mlPVA+0. 7mg/ml 肝素鈉；亮甲酚藍染色液26 u Mol/L亮甲酚藍+PBS+5mg/ml BSA ；含有milrinone 的成熟培養(yǎng)液50_100 ii Mol/L milrinone+TCM199-HC03+10 % FBS+0. 05IU/ml FSH+0. 05IU/ml LH+1 u g/ml estradiol+24. 2 ii g/ml 丙酮酸鈉+0. ImM/L半 胱氨酸 +10ng/ml EGF+lOOIU/ml 雙抗；成熟培養(yǎng)液TCM199-HC03+10% FBS+0. 05IU/ml FSH+0. 05IU/ml LH+1 u g/ mlestradiol+24. 2 u g/ml 丙酮酸鈉 +0. ImM/L 半胱氨酸 +10ng/ml EGF+lOOIU/ml 雙抗；洗滌液10%FBS+90% TCM199_h印es ；S0F 6. 29mg/ml NaCL+0. 534mg/ml KCL+0. 162mg/ml KH2P04+0. 6 u 1/ml 乳酸鈉 +0. 089mg/mlMgS04+2. lmg/mlNaHC03+0 . 0 3 5 7mg/ml 丙酮酸鈉 +0. 299mg/mlCaCL2 2H20 ；
培養(yǎng)液S0F+3mg/mlBSA ；離子霉素5iiMol/L離子霉素+1%二甲基亞砜+10% FBS+89% TCM199_h印es ；6-甲氨基嘌呤2mMol/L 6-甲氨基嘌呤+1 % 二甲基亞砜+10 % FBS+89 % TCM199-HC03。該方法將顯微鏡下的著藍色的卵母細胞設為BCB+，沒著藍色的卵母細胞設為 BCB-, BCB-的卵母細胞細胞質量顯著低于BCB+。該方法在脫去卵母細胞周圍的顆粒細胞時，是將卵母細胞置于濃度為0. 的透 明質酸酶溶液內(nèi)，經(jīng)反復吹吸即可。實驗結果及數(shù)據(jù)驗證用兩組數(shù)據(jù)驗證其采用milrinone抑制與BCB染色相結合 的方法的有效性。實驗一組未經(jīng)BCB篩選的卵母細胞用milrinone直接抑制，無法提高卵母細胞的總體效率。 結果見表1。表 1 由上表得知未經(jīng)BCB篩選的卵母細胞經(jīng)milrinone抑制后，成熟率、卵裂率和囊 胚率的數(shù)據(jù)都低于對照組。實驗二組
0048]將milrinone與BCB染色相結合，能最大限度的提高卵母細胞質量及后期發(fā)育能 力。表2 由上表得知經(jīng)milrinone抑制的BCB-卵母細胞成熟率和卵裂率皆顯著高于沒經(jīng) 抑制的BCB-卵母細胞，囊胚率也顯著高于沒經(jīng)抑制的BCB-卵母細胞。
權利要求
一種提高綿羊卵母細胞體外利用效率的方法，其特征在于將染色分離獲取的質次BCB 卵母細胞，用含有50 100μMol/L的PDE3抑制劑milrinone的成熟培養(yǎng)液洗滌2 3次，培養(yǎng)6 9小時，用不含有milrinone的成熟培養(yǎng)液洗滌2 3次，培養(yǎng)至24小時；脫去卵母細胞周圍的顆粒細胞，移至洗滌液內(nèi)，撿出排出第一極體的卵母細胞，統(tǒng)計極體排除率即成熟率；將排出第一極體的卵母細胞用5μMol/L離子霉素激活4 5分鐘，洗滌液洗滌1 3次，再用2 3小時前在CO2箱平衡好的2mMol/L 6 甲氨基嘌呤激活2 3小時，用2小時前在CO2箱平衡好的培養(yǎng)液洗滌3 4次，入培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)48小時后統(tǒng)計卵裂率，168小時后統(tǒng)計囊胚率即可；其中BCB 卵母細胞的獲取摘取宰殺30分鐘內(nèi)的綿羊卵巢，置入溫度在30 35℃，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml鏈霉素的生理鹽水中，3小時內(nèi)用生理鹽水清洗3 4次；用吸有1ml抽卵液，帶有9號針頭的10ml注射器抽吸卵巢表面2 8mm大小的卵泡，將注射器內(nèi)回收的卵泡液打在35 60mm的皿內(nèi)，在顯微鏡下?lián)斐雎涯讣毎湃胩砑訚舛葹?5 30μMol/L的BCB染色液，至于35 39℃水浴中染色80 90分鐘；在顯微鏡下將BCB+和BCB 卵母細胞分離；其中染色分離的BCB+卵母細胞用成熟培養(yǎng)液洗滌2 3次，培養(yǎng)至24小時，直接利用即可；其中實驗液體的配制抽卵液TCM199 hepes+1mg/ml PVA+0.7mg/ml肝素鈉；亮甲酚藍染色液26μMol/L亮甲酚藍+PBS+5mg/ml BSA；含有milrinone的成熟培養(yǎng)液50 100μMol/L milrinone+TCM199 HCO3+10％FBS+0.05IU/ml FSH+0.05IU/ml LH+1μg/ml estradiol+24.2μg/ml丙酮酸鈉+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/ml EGF+100IU/ml雙抗；成熟培養(yǎng)液TCM199 HCO3+10％FBS+0.05IU/ml FSH+0.05IU/ml LH+1μg/mlestradiol+24.2μg/ml丙酮酸鈉+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/ml EGF+100IU/ml雙抗；洗滌液10％FBS+90％TCM199 hepes；SOF6.29mg/ml NaCL+0.534mg/ml KCL+0.162mg/ml KH2PO4+0.6μl/ml乳酸鈉+0.089mg/mlMgSO4+2.1mg/mlNaHCO3+0.0357mg/ml丙酮酸鈉+0.299mg/mlCaCL2·2H2O；培養(yǎng)液SOF+3mg/mlBSA；離子霉素5μMol/L離子霉素+1％二甲基亞砜+10％胎牛血清+89％TCM199 hepes；6 甲氨基嘌呤2mMol/L 6 甲氨基嘌呤+1％二甲基亞砜+10％胎牛血清+89％TCM199 HCO3。
2.按照權利要求1所述的提高綿羊卵母細胞質量的方法，其特征在于顯微鏡下的著 藍色的卵母細胞被設為BCB+，沒著藍色的卵母細胞設為BCB-，BCB-的卵母細胞細胞質量顯 著低于BCB+。
3.按照權利要求1所述的提高綿羊卵母細胞質量的方法，其特征在于脫去卵母細胞 周圍的顆粒細胞，是將卵母細胞置于濃度為0. 的透明質酸酶溶液內(nèi)，經(jīng)反復吹吸即可。
4.按照權利要求1所述的提高綿羊卵母細胞質量的方法，其特征在于所用試劑均為 專項訂購或市售產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明提供的一種提高綿羊卵母細胞體外利用效率的方法，將染色分離獲取的質次BCB-卵母細胞，用含有50-100μMol/L的PDE3抑制劑milrinone的成熟培養(yǎng)液洗滌2-3次，培養(yǎng)6-9小時，用不含有milrinone的成熟培養(yǎng)液洗滌2-3次，培養(yǎng)至24小時；脫去卵母細胞周圍的顆粒細胞，移至洗滌液內(nèi)，撿出排出第一極體的卵母細胞，統(tǒng)計極體排除率即成熟率；將排出第一極體的卵母細胞用5μMol/L離子霉素激活4-5分鐘，洗滌液洗滌1-3次，再用2-3小時前在CO2箱平衡好的2mMol/L 6-甲氨基嘌呤激活2-3小時，用2小時前在CO2箱平衡好的培養(yǎng)液洗滌3-4次，入培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)48小時后統(tǒng)計卵裂率，168小時后統(tǒng)計囊胚率即可。另將染色分離獲取的BCB+卵母細胞用成熟培養(yǎng)液洗滌2-3次，培養(yǎng)至24小時直接利用。該法對綿羊卵母細胞體外利用有重大的實用價值。
文檔編號C12N5/075GK101892194SQ201010196378
公開日2010年11月24日 申請日期2010年6月10日 優(yōu)先權日2010年6月10日
發(fā)明者劉明軍, 林嘉鵬, 汪立芹, 趙云程, 陳童, 黃俊成 申請人:新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學院中國-澳大利亞綿羊育種研究中心