專(zhuān)利名稱(chēng)：一種擬穴青蟹微衛(wèi)星分子標(biāo)記的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種擬穴青蟹微衛(wèi)星 分子標(biāo)記的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)幾乎存在于所有真核生物基因組中，由1-6個(gè) 核苷酸組成的簡(jiǎn)單序列重復(fù)(Simple Sequence Repeats, SSR)，是近十幾年發(fā)展起來(lái)的一 種新型分子標(biāo)記技術(shù)。微衛(wèi)星具有數(shù)量多、隨機(jī)分布、多態(tài)性高、重復(fù)性強(qiáng)、呈共顯性遺傳及 操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于群體遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源保護(hù)與管理、遺傳連鎖圖 譜構(gòu)建及QTL定位等領(lǐng)域中。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已在大多數(shù)的重要水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中開(kāi)發(fā)了微衛(wèi)星標(biāo)記。如Guo等開(kāi) 發(fā)了大黃魚(yú)的6個(gè)多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記；李紹戊等開(kāi)發(fā)了團(tuán)頭魴的19個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記；馬洪雨等 報(bào)道了圓斑星鰈的40個(gè)多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記和條斑星鰈的31個(gè)多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記；Wang等開(kāi)發(fā) 了太平洋牡蠣的17個(gè)EST來(lái)源的多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記；Elf strom等開(kāi)發(fā)了扇貝的16個(gè)微衛(wèi)星 標(biāo)記；Yap等篩選到梭子蟹的8個(gè)多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記；An等篩選了中華絨螯蟹的9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo) 記。這些多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用到群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、親緣關(guān)系鑒定、遺傳連鎖 圖譜構(gòu)建等研究中。擬穴青蟹(Scylla paramamosain)屬節(jié)肢動(dòng)物門(mén)(Arthropoda)、甲殼綱 (Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、青蟹屬(Scylla)，主要分布于 太平洋、印度洋的熱帶、亞熱帶和溫帶沿岸，在我國(guó)主要分布于東南沿海各省，以福建、廣東 和海南最多，是我國(guó)重要的養(yǎng)殖蟹類(lèi)之一。為了鑒定和保護(hù)在我國(guó)廣泛分布的青蟹資源，馬 凌波等對(duì)我國(guó)東南沿海的青蟹的線(xiàn)粒體進(jìn)行了研究，結(jié)果證實(shí)在我國(guó)廣泛分布的青蟹絕大 多數(shù)為擬穴青蟹，而不是先前認(rèn)為的鋸緣青蟹。目前，可利用的擬穴青蟹微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)量非 常少，嚴(yán)重限制了相關(guān)遺傳學(xué)研究的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種擬穴青蟹微衛(wèi)星分子標(biāo)記及其構(gòu)建方法 和應(yīng)用，該方法具有操作簡(jiǎn)單，快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，一次可獲得幾百、甚至上千條微衛(wèi) 星序列，并且所獲得的大多數(shù)的微衛(wèi)星序列均可設(shè)計(jì)引物，在擬穴青蟹遺傳變異分析、種質(zhì) 資源保護(hù)與管理、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及標(biāo)記輔助育種等領(lǐng)域中具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的一種擬穴青蟹微衛(wèi)星分子標(biāo)記的構(gòu)建方法，包括(1)擬穴青蟹基因組DNA的提取并稀釋備用；(2)基因組DNA的酶切、連接接頭及預(yù)擴(kuò)增；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物與探針和磁珠雜交及再次PCR擴(kuò)增；(4)擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆及測(cè)序；(5)序列分析及微衛(wèi)星特異引物設(shè)計(jì)；
(6)使用引物對(duì)擬穴青蟹不同地理群體或群體內(nèi)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò) 增；(7)使用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；(8)根 據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的不同遷移距離確定每個(gè)個(gè)體的基因型，共獲得20個(gè)多態(tài)性的 微衛(wèi)星標(biāo)記，從而獲得擬穴青蟹遺傳變異的多態(tài)性圖譜。所述步驟(1)中的擬穴青蟹基因組DNA的提取并稀釋?zhuān)ㄒ韵虏襟E剪取擬穴青 蟹少量肌肉組織100-150mg，置于500 μ 1組織提取液的中剪碎，加入終濃度為20mg/ml的蛋 白酶K和終濃度為100 μ g/ml的RNaseA，55°C消化2_3個(gè)小時(shí)；用酚氯仿異戊醇混合 液按體積比為25 24 1混合，抽提兩次；然后用2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀DNA，經(jīng)70% 乙醇洗滌和自然干燥后，溶解于TE中；最后將DNA濃度稀釋為lOOng/μ 1，于-20°C保存?zhèn)?用。所述步驟(2)中的基因組DNA的酶切是利用限制性?xún)?nèi)切酶MseI消化DNA，于37°C 酶切3個(gè)小時(shí)；之后于70°C保溫15分鐘使內(nèi)切酶失活；所述的連接街頭是在酶切片斷兩端連接上序列特異的接頭，其序列為oligo A 5，-CTACTCAGGACTCAT-3，；oligo B :5，-GAGTCCTGAGTAGCA-3，，連接反應(yīng)在 16°C進(jìn)行 10 個(gè) 小時(shí)，之后將連接產(chǎn)物稀釋10倍待用；所述的預(yù)擴(kuò)增是利用接頭特異性引物通過(guò)PCR擴(kuò)增，達(dá)到富集連接產(chǎn)物的目的， 預(yù)擴(kuò)增引物MseI-N的序列為5’ -GATGAGTCCTGAGTAA-3’ ；用1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，并回收大小在250-800bp之間的擴(kuò)增產(chǎn)物。所述步驟(3)中的擴(kuò)增產(chǎn)物與探針和磁珠雜交及再次PCR擴(kuò)增，包括以下步驟將 步驟(2)回收的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物與生物素標(biāo)記的微衛(wèi)星重復(fù)探針((CAA)ltl和(GATA)8)進(jìn)行雜 交，再利用該雜交產(chǎn)物與磁珠雜交，然后將非目的片斷洗脫，從而獲得微衛(wèi)星重復(fù)片斷，最 后利用PCR擴(kuò)增法富集微衛(wèi)星重復(fù)片斷。所述步驟(4)中的克隆及測(cè)序，包括以下步驟首先是將PCR富集片段連接到 PMD19-T載體中，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞ToplO中，接種到LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，再利 用載體通用引物和PCR擴(kuò)增法鑒定陽(yáng)性克隆，挑取插入片段大小在250-800bp的陽(yáng)性克隆 并進(jìn)行測(cè)序。所述步驟(5)中的序列分析及微衛(wèi)星特異引物設(shè)計(jì)，包含以下步驟首先利用生 物學(xué)軟件DNAMAN 4.0對(duì)所獲得的所有序列進(jìn)行比對(duì)分析，去掉相同的序列；然后使用軟件 SSRHUNTER 1. 3查找含有微衛(wèi)星核心重復(fù)的序列，查找標(biāo)準(zhǔn)為2_5個(gè)堿基重復(fù)單元、重復(fù) 次數(shù)> 4次；再利用BLAST方法搜索這些微衛(wèi)星序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中是否存在相同的 序列，并去掉那些相同的序列；最后利用生物學(xué)軟件Primer Premier 5. 0對(duì)含有完整側(cè)翼 序列的微衛(wèi)星序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；引物應(yīng)符合以下標(biāo)準(zhǔn)(1)引物長(zhǎng)度在18-25bp之間；(2)GC含量在40-60%之間； (3)退火溫度在48-60°C之間；(4) PCR產(chǎn)物的預(yù)期長(zhǎng)度在130_350bp之間；其中，所述的擬穴青蟹微衛(wèi)星分子標(biāo)記及其對(duì)應(yīng)的特異引物序列，如下所示ScpOl 長(zhǎng)度 337bpstaaccacatc cacccgtcca ctcaaccact caaccatatc cactcactca cctacttacccacactcata acgccatcct tctatccact aactcacact cacccgacca cccacctccg
ttagcccacc catccactca ctcaaccaca accacccatc cacccaccgc acactacctacaggctcatc cacctatcta tccatccatc cgctcatcta cctgtaaacc acccacccacactcacacat tcatcatccc acccacatcc accaaaccag ccaccccacc atccagtacacattggccta tccatccaca actacaacct cccatta
ScpO 1標(biāo)記的特異弓丨物序列F:tcataacgccatccttctatR:tgggaggttgtagttgtgga ；Scp02 長(zhǎng)度 243bpsaacaacgcag cgcaacacaa tataatgcaa tgtaacaaca caacacaaca caacacaacacaacaccgca acgcaacacc ggcttagggt gacagcacgt aacacctcgc agcgtgcatgaagccaaaac agcaacactg aatgggaaga catacaagag caatccaatg ttggcgcagcaggaatcctg tgtccctatc agcaggtcac gcttgcctcc atttcaaatc cactcgcacattaScp02標(biāo)記的特異引物序列F:gcaacacaatataatgcaatgtaaR:agcgtgacctgctgatagg ；Scp03 長(zhǎng)度 298bpstaataataac aataacagaa acaatgactc taccttctaa cacaggaatg gtcctcaacaacctcattgg caagaagggg tcactgtcat cactgcaaga ctactgggac gtggccaccttctttgagat cagcgtgttg gcagaggatt atggaaaggc ggtgcaggca gctgagtgcatgtttagatt gaagcctcct aattggtgag tggtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtaagggtggtgcattgt gggagtgtgt ttagtgttgg tgagagaatg gtaggtggta cgtcattaScp03標(biāo)記的特異引物序列F:tggtcctcaacaacctcattR:atgacgtaccacctaccattct ；Scp04 長(zhǎng)度 509bpstaatgtcaga cgcagtgatg taggcagaaa tgttaagaat aaagcaacac catcaccaacattaccatta tcatcaccag C3-CC3-CC3-3-CaattaCCatCactatatcta caactcatca caacctctaa tcaccaccac caccatcatc accagtcaacaccagtgcac cacaggaacg aaaacaccac cccactcatc tccctcctca tctcctgctcctgtttcgtc tattccagtt tcccctcgtg taccaatttc ctggacttgc ttgcgtaaacgtcactccat tttctgtcat tcgtttttct ctcatgcatc cctcggcctc gtgtgtgtgtgtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgtgtgtggtgac Bgcgggtgtg gactcctgtg tgcgtgattg ttgctgtgta cacacgccgcacacacaagg agtagcgagg cgcgagttaScp04標(biāo)記的特異引物序列F:ttcctggacttgcttgcgtaaaR:gcgcctcgctactccttgtg ；Scp05 長(zhǎng)度 334bpstaaccactca accaccccca atccacttac ccatccattc aaccacccgt ccactcacac catccatcta tccacacaac tattcacact catccaccca tctaacaaca cacctaccta aaccatccac ttactcttcc atccacattt atgaatgcag ctacccattc acacacccct Scp05標(biāo)記的特異引物序列 F:cagccattgactcctatcga R:tgcattcatgtacggctaaa ； Scp06 長(zhǎng)度 237bps
C3.3.C3.3.C3.3.C Q.Q.CQ.Q.CQ.Q.CQ. Q.CQ.Q.CQ.Q.CQ.Q.
tccctccttg ttttccttcc ttcatctctt tggtggtgga ggacgatatt acaaacaagc actaacaaag gaacaaacaa ataatgacta Scp06標(biāo)記的特異引物序列 F:ccttgttttccttccttcatct R:gagagaagcctgcagttagtcat ； Scp07 長(zhǎng)度 301bps
Q.Q.CQ.Q.CQ.Q.CQ. Q.CQ.Q.CQ.Q.CQ.Q. C3.3.C3.3.C3.3.C
aggagaaaac aataataact actactacta ttaatatttc ttttactgga acaactgcca ccaccaccac caccagcaca taccaatacc atcactgcat tataaaaccc acgaactgtt a
Scp07標(biāo)記的特異引物序列
F agcaacagcaggagaaaacaat Rcctattatgaacagttcgtggg ； Scp08 長(zhǎng)度 271bps taacccttcc tttgtaaagt tagcgcgtca attccatgta ttcttcttct tcttcttctt gttattatta tacttttgtt gtgttcggtt ttgttacact ttttcttttg ttgttgtggt tttgctttgg ttttgagtca taataagtgg ScpOS標(biāo)記的特異引物序列 F:cgctctttgtattgtgattcc R :atgactcaaaaccaaagcaaa ； Scp09 長(zhǎng)度 315bps taagccgcca gagcaaggcc agtattgaaa ttctgtccgt ttgtctgtgt gtatgctgtt
caatccatcc acactctaca ctcatccacc caactcattc caatccaccc ccat
agccattgac cacacattca tacccctcta atccatccat atccattcat
C 3.3. C 3.3. C 3.3. C
ccactattat attcacacag actgcaggct
Q.Q.CQ.Q.CQ.Q.CQ.
ctactactac atactaccac agcagtagtg cataataggg
ttttaacagt cttcttgttc acttatgaaa ttagctcagt t
tcctatcgat tccatccatc ctgaccagcc ccatctatcc ttagccgtac
tttcctgaca ttcccttata acagacagac tctctcactc
catcttttcc gtagtggtgg agacagacaa aggctta
Q.CQ.Q.CQ.Q.CQ.Q.
tattaaattt caccaccacc aagaggcacg gcaatcaatt
cagcaacagc attactacta accaccagca gttacataac agtgcatatt
tgtgcgctct ttgttcttgt agctctcgtt ttttactttc
ttgtattgtg tcttcttatt ttgtgtcttg gtttgtgtct
tgatagggta gatgacacct cgccaggatt gcttgcctgt gtgtctgttt tcctttatat
ttgtctgttt gtcagtgtct gtctgtttgt gtgtctgtcg taaagtctca ctcttcttttctttgtctgt ctgtccttac ttctgactgt caatctctcc ctctctctct ctctctctctctctctctct gcttgttctc gccgttgtta ccgtcgggag ttgcttttgt cgttgttgttgttgttgttg ttgttScp09標(biāo)記的特異引物序列FcagtattgaaatgatagggtagatgacRcggtaacaacggcgagaac ；ScplO 長(zhǎng)度 274bpstaacgaagct aacacaacta gcgccgcccc tcgtgcgtgt gtgtgtgtgg cgagacgagtgcaagcaaga gagtgtttat ctacttgtct tgacttgtct gcacctacaa gagcaatatttgtcttgtac tgtgtttccc gggccgacag aaagcagcgg tgtgggtgag agggaatatgatacagtgcg gagataaggc cagtaatccc cgagtgtgta gggttgtgca gcgcgaggtcttaaggctgg gtagtgatct agacgcgact tacaScplO標(biāo)記的特異引物序列F:acaactagcgccgcccctcgR:acccagccttaagacctcgc ；Scpll 長(zhǎng)度 262bpstaacacacac tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctctctaagcttt tttcatttca tcttccatcc gatatttttt tttttcactt ttccttccttccctcgttcc ttcctgactt tctctcttcg tccctcttcc taaccttttt ctccggtctcttcttttact cctttatctc ctttcatctc gctgttcttt tgcattattt tatctggttcttttctctca acttgtatct taScpll標(biāo)記的特異引物序列F:ttcatcttccatccgatattRgaaccagataaaataatgcaaa ；Scpl2 長(zhǎng)度 294bpstaataatatc aacatggcgg tcacccatcc aagaactaac cgaacccccc gttgcttaacctcacttaca acacgaaaag ctgcgtattg aacatagtaa ggtcgttggc acacacacacacacacacac acacacacac acgcaatgat ctagagtaac atgcatccaa attacaagtttttttttctc tctttctctc atagtaatta gcgtcattca attaacacct gctcgtgattgatgagggga agttaatgac tgatgcattt gttgctaata attaggcgaa gateScpl2標(biāo)記的特異引物序列F:cacccatccaagaactaaccR :caatcacgagcaggtgttaa ；Scpl3 長(zhǎng)度 273bpstaagcactat ttgtttggat tcttcttttc agtgtccaca ttcgttaatg agttgtttgtggtgctggtg aatctgagct agaggattga gtagtggtag gtgattctga ttatgatagtgagtttgaat ttaggttaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacacaC3.C3.C3.C3.C3. ccttccgaag cttgctgcca gcgcccacat gccactctca caccctgtac
tcctgtggta tagaagtctt aattatactg ttaScpl3標(biāo)記 的特異引物序列F:tgtttggattcttcttttcagR:taccacaggagtacagggtg ；Scpl4 長(zhǎng)度 359bpstaaacacaaa tacactgttg tgaaaacgta agacagaccg gtagacacaa agaccgaaagtttttatagt attgtagatt atatgacaca cacacacaca cacacacaca cacacacacacgtgtagagg aggacagcca aggccagaaa aacagagtga aaataatgaa cgttaaattaattgcggctc ccacattgac aactggagag tttccaaaac gctggccagt tcattttctgagatgtcttg atatttccct catgcaatag ttgtaattat aagaaggaga aaaagagaaacaagtaaagt gttttagagt ttgccactga aatgcatgaa agagtgaaaa ttgcggttaScpl4標(biāo)記的特異引物序列FttgtgaaaacgtaagacagacR:aattacaactattgcatgagg ；Scpl5 長(zhǎng)度 422bpstaacacagac tacgaatgta gactttttta tgcatgtgat atgggatatg cgtgtgtattgtgtgctgga tgaatacgag taagaacgtt cagatgtgtg tatatgtgat ggcgtatgagatggtaaagt atgcgtgtag gatagcaaat gtataaactc gtgtttatga atatagtgtgtgtgtgtgtg tgtgttctaa tcaatcattg gctatgcctt ccctctagtc gctagcgagtgaagatgaca cgctgccatt gccttgtgct aaggaagcag acactaacgt cggccgtcggcccttcaagc cagacagtat agttggcgga ggtgactgag acacgtatta caatgcagtattacaatgac gtgagggtac gggatgagta C 3. C C 3. C 3.3. C 3. ttcataacca gctaattgattaScpl5標(biāo)記的特異引物序列FtaacacagactacgaatgtagacttR:gcatagccaatgattgattaga ；Scpl6 長(zhǎng)度 262bpstaactccaaa ggaatgtggt gagtgaaagc aaacccaagt aactgaggag tggtgtgtgtgtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtatgtgtgt gtgtgtgtgtgtgtatgtgt gtgtgtgtgt gtgtattcaa ccctttgact gccacttggt acacctttccctacagccac attcgatctt tgaactggga agaaattgca aaatgtattc tatttcgtaactaactttct tgtagatgct taScpl6標(biāo)記的特異引物序列F :aaacccaagtaactgaggagR gtagggaaaggtgtaccaag ；Scpl7 長(zhǎng)度 187bpsagatagacag acacagaggc atactgaaac acaaataata ggccattcag tcagtccaattgacatatat acataccttc tgacaaacac acagatgcag agagataactacacacacac acacacacac acacacacac acacacacac aactccggta tgcgaatgccBggtgtggct aatgagtccc ggaggaggaa gaaagaggaa gtgatggagg gaagaagaaa aggaaaaaaa gaagagaagg gctttgcgtt ggggcaggcg
tcccaggcgc tggaggaagg agaaggaaag aaagctgcaa ggaggagaga gagagagaggacgttaScpl7標(biāo)記的特異引物序列F:agatagacagacacagaggcatactR:taacgtcggcattcgcatac ；Scpl8 長(zhǎng)度 307bpstaactgcagt cccttacctg aagatgctac aggtgtgctccacacctgtc ccctcccaca cctggcaagg gaaaatggaaaagaaggagg aggaaaaaag tggaaaaatg agagaaggaaaaaggaatag gagaaaagag aagaggtgaa gagaggaaaggatgaaggaa gaagggagag agagagagag agtcactctactttctcScplS標(biāo)記的特異引物序列F :cccttacctgaagatgctR :caacgcaaagctagagtg ；Scpl9 長(zhǎng)度 179bpstaagggcgat gattattggt tggccagaac aagcggccccgaggtggaag gaaggaagga agaagaagaa gaaaagaaagataaaaaaaa ggacgaatcg ggtgaagtga gtcagtggatScpl9標(biāo)記的特異引物序列F:ggcgatgattattggttggcR:ttcacccgattcgtcctttt ；Scp20 長(zhǎng)度 155bpstaacccgcgt gcttgtgtat ttatttgtgt attggatatacatgcattag gagggcgaag tagagtgaca gagatcaggggggagagaga gagaaggggt atgggagcgg tgtgtScp20標(biāo)記的特異引物序列FtggatataaagtggaactgatggcgR :cacaccgctcccataccccttο所述步驟(6)中的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系總體積為25μ 1，包括基因組DNA模 板1μ 1、上下游引物終濃度均為0.4μπιΟ1/1、Μβ2+終濃度為1.5mm0l/L、dNTP終濃度為 0. 2mmol/L、Tag DNA聚合酶0. 75U、IXPCR buffer，最后補(bǔ)充滅菌雙蒸水至總體積為25 μ 1 ； 反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒、引物特異的退火溫度退火50秒、72°C延伸 50秒，30個(gè)循環(huán)；最后于72°C延伸7分鐘。所述步驟(7)中的檢測(cè)步驟包括將步驟(6)的PCR產(chǎn)物于95°C變性后，上樣3μ 1 于6%的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，再經(jīng)染色、顯色后獲得了擬穴青蟹的PCR產(chǎn)物電泳圖像。本發(fā)明的一種擬穴青蟹微衛(wèi)星分子標(biāo)記應(yīng)用于擬穴青蟹遺傳變異分析、種質(zhì)資源 保護(hù)與管理、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及標(biāo)記輔助育種等領(lǐng)域。本發(fā)明的通過(guò)擬穴青蟹兩種微衛(wèi)星富集文庫(kù)(CAA)n、(GATA)n的構(gòu)建，陽(yáng)性克隆的
aagtggaact gatggcgact ctgtgtgagg ggcgtgtgag鑒定及測(cè)序，序列分析及微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)，最終獲得20個(gè)擴(kuò)增條帶清晰的多態(tài)性的微衛(wèi) 星標(biāo)記，將這20個(gè)多態(tài)性標(biāo)記用于擬穴青蟹不同地理群體或群體內(nèi)不同個(gè)體的遺傳學(xué)分 析，獲得擬穴青蟹的遺傳變異的多態(tài)性圖譜。有益效果本發(fā)明提供了一種可快速、大量的制備擬穴青蟹的微衛(wèi)星標(biāo)記，一次可獲得幾百、 甚至上千條微衛(wèi)星序列，并且所獲得的大多數(shù)的微衛(wèi)星序列均可設(shè)計(jì)引物，具有操作簡(jiǎn)單， 快 速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，一周內(nèi)可完成一個(gè)過(guò)程，大大提高了構(gòu)建微衛(wèi)星標(biāo)記的效率，在擬 穴青蟹遺傳變異分析、種質(zhì)資源保護(hù)與管理、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及標(biāo)記輔助育種等領(lǐng)域中 具有良好的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定 的范圍。實(shí)施例11、擬穴青蟹基因組DNA的提取剪取擬穴青蟹少量肌肉組織約100-150mg，置于500 μ 1組織提取液(lOmmol/L Tris-CI,pH8. 0 ；IOOmmo 1/L EDTA，pH8. 0 ；IOOmmo 1/L NaCl ；0. 5% SDS)中剪碎，加入蛋白酶 K (終濃度為20mg/ml)和RNaseA (終濃度為100 μ g/ml)，充分混勻，55°C消化2-3個(gè)小時(shí)至 澄清；用酚氯仿異戊醇混合液(體積比為25 24 1)抽提兩次；然后用2倍體積的 無(wú)水乙醇沉淀DNA，經(jīng)70%乙醇洗滌和自然干燥后，溶解于50 μ L TE(10mmol/L Tris-HCl, ρΗ8. 0 ； 10mmol/L EDTA, pH8. 0)中；最后將 DNA 濃度稀釋為 IOOng/μ 1，并保存在 _20°C備 用；2、擬穴青蟹基因組DNA的酶切、連接利用限制性?xún)?nèi)切酶MseI對(duì)擬穴青蟹基因組DNA進(jìn)行消化，酶切反應(yīng)總體積為 30μ 1，包括6μ 1 的 IOXbuffer R with BSA、6U 的內(nèi)切酶 Msel、10 μ 1 的基因組 DNA 及 13. 4μ 1的滅菌雙蒸水，37°C水浴消化約3小時(shí)，之后70°C保溫15分鐘使內(nèi)切酶失活；連接步驟如下首先將合成的單鏈寡核苷酸oligo A(0lig0 A 5，-CTACTCAGGACTCAT-3，)和 oligo B(5，-GAGTCCTGAGTAGCA-3，)稀釋為濃度 IOOymol/ L,然后等體積混合，再稀釋為濃度20 μ mol/L,于94°C變性5分鐘，緩慢冷卻至室溫，-20°C 保存?zhèn)溆茫贿B接反應(yīng)的總體積為17. 5 μ 1，包括1. 5μ 1的10 X T4DNAbuf f er、2. 5 μ 1的接頭、 10. 5U的T4DNA連接酶及10 μ 1的酶切產(chǎn)物，16°C連接約10小時(shí)，之后將連接產(chǎn)物稀釋10
倍待用；3、預(yù)擴(kuò)增預(yù)擴(kuò)增引物MseI-N 的序列為5’ -GATGAGTCCTGAGTAA-3’，PCR 反應(yīng)體系為 20 μ 1， 包括10Χ連接產(chǎn)物5 μ 1、引物終濃度均為0. 4μ mol/L、Mg2+終濃度為1. 5mmol/L、dNTP終 濃度為0. 2mmol/L、Tag DNA聚合酶1U、1 XPCR buffer，最后補(bǔ)充滅菌雙蒸水至總體積為20 μ 1 ；PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒、53°C退火50秒、72°C延伸1分 鐘，25個(gè)循環(huán)；最后于72°C延伸7分鐘。利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，并 回收大小在250-800bp之間的擴(kuò)增產(chǎn)物；4、回收產(chǎn)物與生物素標(biāo)記的微衛(wèi)星探針雜交 委托生物公司合成兩種微衛(wèi)星寡核苷酸探針，用生物素在其5’端進(jìn)行標(biāo)記。兩種 探針序列分別為5，-CAACAACAACAACAACAACAACAACAACAA-3，和 5，-GATAGATAGATAGATAGATA GATAGATAGATA-3，；將兩種探針稀釋為濃度40 μ mol/L,雜交體系為96 μ 1，包括70 μ 1的雜 交液(6XSSC+0. SDS)、6 μ 1的探針及20 μ 1的上述預(yù)擴(kuò)增回收產(chǎn)物，雜交反應(yīng)在PCR儀 中進(jìn)行，程序?yàn)?4°C變性5分鐘，65°C退火30分鐘，10°C暫時(shí)保存；5、磁珠雜交及洗脫首先用雜交液(6 X SSC+0. 1 % SDS)對(duì)磁珠進(jìn)行仔細(xì)的洗滌3次，每次3分鐘；然 后將上述雜交混合液與磁珠混合，在室溫下雜交約30分鐘，期間不斷的重懸磁珠；最后對(duì) 磁珠進(jìn)行洗滌，目的是去除非目的片段及雜質(zhì)。洗滌步驟如下首先用400 μ 1的雜交液 (6 X SSC+0. 1 % SDS)清洗磁珠3次，每次3分鐘；然后用400 μ 1的2 X SSC清洗磁珠3次， 每次3分鐘；最后用400 μ 1的1 X SSC清洗磁珠2次，每次3分鐘；用磁力架吸附磁珠并去 除液體后，向磁珠中加入50 μ 1的TE溶液，在95°C水浴中變性5分鐘后，快速收集TE溶液；6、雜交后的PCR擴(kuò)增對(duì)磁珠雜交后的洗脫產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系為20μ 1，包括洗脫產(chǎn)物 5 μ 1、預(yù)擴(kuò)增引物終濃度為0. 4 μ mol/L、Mg2+終濃度為1. 5mmol/L、dNTP終濃度為0. 2mmol/ L、Tag DNA聚合酶1UUXPCR buffer，最后補(bǔ)充滅菌雙蒸水至總體積為20 μ 1 ；PCR反應(yīng)程 序?yàn)?4°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒、53 °C退火50秒、72 °C延伸1分鐘，25個(gè)循環(huán) ’最 后于72°C延伸7分鐘，利用1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的濃度；7、T載體連接將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到T載體中，連接體系為ΙΟμΙ，包括solution I 5. 0μ l、pMD19-T 載體(TaKaRa) 1· 0μ 1 及 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 4. 0 μ 1，4°C 過(guò)夜；8、克隆、測(cè)序?qū)⑦B接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞ToplO中，使用載體通用引物(M13-47 5，-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3，；M13-48 :5，-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3，)對(duì)克隆進(jìn) 行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系為25 μ 1，包括菌液1 μ 1、上下游引物終濃度均為0. 4 μ mol/L、 Mg2+ 終濃度為 1. 5mmol/L、dNTP 終濃度為 0. 2mmol/L、Tag DNA 聚合酶 IUU X PCR buffer, 最后補(bǔ)充滅菌雙蒸水至總體積為25 μ 1 ；PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30 秒、55 °C退火50秒、72 °C延伸50秒，25個(gè)循環(huán)；最后于72°C延伸7分鐘。最后，挑選插入片 斷長(zhǎng)度在250-800bp之間的陽(yáng)性克隆，用ABI3730測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序；9、微衛(wèi)星引物設(shè)計(jì)首先利用生物學(xué)軟件DNAMAN 4. 0對(duì)所獲得的所有序列進(jìn)行比對(duì)分析，去掉相同 的序列；然后使用軟件SSRHUNTER 1. 3查找含有微衛(wèi)星核心重復(fù)的序列，查找標(biāo)準(zhǔn)為2_5 個(gè)堿基重復(fù)單元、重復(fù)次數(shù)> 4次；再利用BLAST方法搜索這些微衛(wèi)星序列在GenBank數(shù)據(jù) 庫(kù)中是否存在相同的序列，并去掉那些相同的序列；最后利用生物學(xué)軟件PrimerPremier 5. 0對(duì)含有完整側(cè)翼序列的微衛(wèi)星序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。
引物應(yīng)符合以下標(biāo)準(zhǔn)(1)引物長(zhǎng)度在18-25bp之間；(2)GC含量在40-60%之間； (3)退火溫度在48-60°C之間；(4斤0 產(chǎn)物的預(yù)期長(zhǎng)度在130-35(^ 之間，引物信息詳見(jiàn)表 1 ；10、微衛(wèi)星標(biāo)記的PCR擴(kuò)增利用上述微衛(wèi)星 引物對(duì)擬穴青蟹群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系為25 μ 1，包括 基因組DNA模板1 μ 1、上、下游引物終濃度均為0. 4μ mol/L、Mg2+終濃度為1. 5mmol/L、dNTP 終濃度為0. 2mmol/L,Tag DNA聚合酶1UUXPCR buffer，最后補(bǔ)充滅菌雙蒸水至總體積為 25 μ 1。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒、引物特異的退火溫度(表1) 退火50秒、72°C延伸50秒，30個(gè)循環(huán)；最后于72°C延伸7分鐘，4°C保存?zhèn)溆茫?1、PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)向PCR產(chǎn)物中加入約1/2體積的變性劑(98. 0%甲酰胺，IOmmol/L EDTA，0. 25% 溴酚藍(lán)，0. 25% 二甲苯氰)，于95°C變性5分鐘，快速冷卻；然后上樣約3μ 1于6%的變性 聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。分子量標(biāo)準(zhǔn)為pBR322/MspI，電泳液為IX TBE^gS 35-40V/ cm,電泳約1-1. 5小時(shí)。電泳完成后進(jìn)行染色和顯色，其操作過(guò)程為首先用70%乙醇固定10分鐘，蒸 餾水洗5分鐘；然后用1. 5%。硝酸銀染色10分鐘，蒸餾水洗8秒鐘；最后用顯色液(2%的 NaOH+4%。的甲醛)顯色至帶型清晰，再用蒸餾水將凝膠沖洗干凈，便獲得了擬穴青蟹遺傳 變異的多態(tài)性圖譜。表1本發(fā)明所構(gòu)建的擬穴青蟹的20個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記
權(quán)利要求
一種擬穴青蟹微衛(wèi)星分子標(biāo)記的構(gòu)建方法，包括(1)擬穴青蟹基因組DNA的提取并稀釋備用；(2)基因組DNA的酶切、連接接頭及預(yù)擴(kuò)增；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物與探針和磁珠雜交及再次PCR擴(kuò)增；(4)擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆及測(cè)序；(5)序列分析及微衛(wèi)星特異引物設(shè)計(jì)；(6)使用引物對(duì)擬穴青蟹不同地理群體或群體內(nèi)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(7)使用6％的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；(8)根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的不同遷移距離確定每個(gè)個(gè)體的基因型，共獲得20個(gè)多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記，從而獲得擬穴青蟹遺傳變異的多態(tài)性圖譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種擬穴青蟹微衛(wèi)星分子標(biāo)記的構(gòu)建方法，其特征在于所 述步驟(1)中的擬穴青蟹基因組DNA的提取并稀釋?zhuān)ㄒ韵虏襟E剪取擬穴青蟹少量肌肉 組織100-15011^，置于50(^1組織提取液的中剪碎，加入終濃度為20mg/ml的蛋白酶K和終 濃度為100yg/ml的RNaseA，55°C消化2-3個(gè)小時(shí)；用酚氯仿異戊醇混合液按體積比 為25 24 1混合，抽提兩次；然后用2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀DNA，經(jīng)70%乙醇洗滌和 自然干燥后，溶解于TE中；最后將DNA濃度稀釋為IOOng/ μ 1，于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種擬穴青蟹微衛(wèi)星分子標(biāo)記的構(gòu)建方法，其特征在于所 述步驟(2)中的基因組DNA的酶切是利用限制性?xún)?nèi)切酶MseI消化DNA，于37°C酶切3個(gè)小 時(shí)；之后于70°C保溫15分鐘使內(nèi)切酶失活；所述的連接街頭是在酶切片斷兩端連接上序列特異的接頭，其序列為oligo A 5，-CTACTCAGGACTCAT-3，；oligo B :5，-GAGTCCTGAGTAGCA-3，，連接反應(yīng)在 16°C進(jìn)行 10 個(gè) 小時(shí)，之后將連接產(chǎn)物稀釋10倍待用；所述的預(yù)擴(kuò)增是利用接頭特異性引物通過(guò)PCR擴(kuò)增，達(dá)到富集連接產(chǎn)物的目的，預(yù)擴(kuò) 增引物MseI-N的序列為5’ -GATGAGTCCTGAGTAA-3’ ；用1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)預(yù)擴(kuò) 增產(chǎn)物，并回收大小在250-800bp之間的擴(kuò)增產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種擬穴青蟹微衛(wèi)星分子標(biāo)記的構(gòu)建方法，其特征在于所 述步驟(3)中的擴(kuò)增產(chǎn)物與探針和磁珠雜交及再次PCR擴(kuò)增，包括以下步驟將步驟(2)回 收的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物與生物素標(biāo)記的微衛(wèi)星重復(fù)探針((CAA)ltl和(GATA)8)進(jìn)行雜交，再利用該 雜交產(chǎn)物與磁珠雜交，然后將非目的片斷洗脫，從而獲得微衛(wèi)星重復(fù)片斷，最后利用PCR擴(kuò) 增法富集微衛(wèi)星重復(fù)片斷。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種擬穴青蟹微衛(wèi)星分子標(biāo)記的構(gòu)建方法，其特征在于所 述步驟(4)中的克隆及測(cè)序，包括以下步驟首先是將PCR富集片段連接到pMD19-T載體 中，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞ToplO中，接種到LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，再利用載體通用弓I 物和PCR擴(kuò)增法鑒定陽(yáng)性克隆，挑取插入片段大小在250-800bp的陽(yáng)性克隆并進(jìn)行測(cè)序。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種擬穴青蟹微衛(wèi)星分子標(biāo)記的構(gòu)建方法，其特征在于 所述步驟(5)中的序列分析及微衛(wèi)星特異引物設(shè)計(jì)，包含以下步驟首先利用生物學(xué) 軟件DNAMAN 4.0對(duì)所獲得的所有序列進(jìn)行比對(duì)分析，去掉相同的序列；然后使用軟件 SSRHUNTER 1. 3查找含有微衛(wèi)星核心重復(fù)的序列，查找標(biāo)準(zhǔn)為2_5個(gè)堿基重復(fù)單元、重復(fù) 次數(shù)> 4次；再利用BLAST方法搜索這些微衛(wèi)星序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中是否存在相同的序列，并去掉那些相同的序列；最后利用生物學(xué)軟件Primer Premier 5. 0對(duì)含有完整側(cè)翼 序列的微衛(wèi)星序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；引物應(yīng)符合以下標(biāo)準(zhǔn)(1)引物長(zhǎng)度在18-25bp之間；(2)GC含量在40-60%之間；(3) 退火溫度在48-60°0之間；(4斤0 產(chǎn)物的預(yù)期長(zhǎng)度在130-350bp之間；其中，所述的擬穴青 蟹微衛(wèi)星分子標(biāo)記及其對(duì)應(yīng)的特異引物序列，如下所示=ScpOl 長(zhǎng)度 337bpstaaccacatc cacccgtcca ctcaaccact caaccatatc cactcactca cctacttacc cacactcata acgccatcct tctatccact aactcacact cacccgacca cccacctccg ttagcccacc catccactca ctcaaccaca accacccatc cacccaccgc acactaccta caggctcatc cacctatcta tccatccatc cgctcatcta cctgtaaacc acccacccac actcacacat tcatcatccc acccacatcc accaaaccag ccaccccacc atccagtaca cattggccta tccatccaca actacaacct cccatta ScpOl標(biāo)記的特異引物序列 F :tcataacgccatccttctat R :tgggaggttgtagttgtgga ； Scp02 長(zhǎng)度 243bpsaacaacgcag cgcaacacaa tataatgcaa tgtaacaaca caacacaaca caacacaaca caacaccgca acgcaacacc ggcttagggt gacagcacgt aacacctcgc agcgtgcatg aagccaaaac agcaacactg aatgggaaga catacaagag caatccaatg ttggcgcagc aggaatcctg tgtccctatc agcaggtcac gcttgcctcc atttcaaatc cactcgcaca ttaScp02標(biāo)記的特異引物序列 F :gcaacacaatataatgcaatgtaa R :agcgtgacctgctgatagg ； Scp03 長(zhǎng)度 298bpstaataataac aataacagaa acaatgactc taccttctaa cacaggaatg gtcctcaaca acctcattgg caagaagggg tcactgtcat cactgcaaga ctactgggac gtggccacct tctttgagat cagcgtgttg gcagaggatt atggaaaggc ggtgcaggca gctgagtgca tgtttagatt gaagcctcct aattggtgag tggtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtaagggt ggtgcattgt gggagtgtgt ttagtgttgg tgagagaatg gtaggtggta cgtcatta Scp03標(biāo)記的特異引物序列 F:tggtcctcaacaacctcatt R:atgacgtaccacctaccattct ； Scp04 長(zhǎng)度 509bpstaatgtcaga cgcagtgatg taggcagaaa tgttaagaat aaagcaacac catcaccaac attaccatta tcatcaccag C3-CC3-CC3-3-CaattaCCatCactatatcta caactcatca caacctctaa tcaccaccac caccatcatc accagtcaac accagtgcac cacaggaacg aaaacaccac cccactcatc tccctcctca tctcctgctc ctgtttcgtc tattccagtt tcccctcgtg taccaatttc ctggacttgc ttgcgtaaac gtcactccat tttctgtcat tcgtttttct ctcatgcatc cctcggcctc gtgtgtgtgtgtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtggtgac agcgggtgtg gactcctgtg acacacaagg agtagcgagg cgcgagtta Scp04標(biāo)記的特異引物序列 F :ttcctggacttgcttgcgtaaa R :gcgcctcgctactccttgtg ； Scp05 長(zhǎng)度 334bps taaccactca accaccccca atccacttac ccatccattc aaccacccgt ccactcacac catccatcta tccacacaac tattcacact catccaccca tctaacaaca cacctaccta aaccatccac ttactcttcc atccacattt atgaatgcag ctacccattc acacacccct Scp05標(biāo)記的特異引物序列 F :cagccattgactcctatcga R:tgcattcatgtacggctaaa ； Scp06 長(zhǎng)度 237bpsC3.3.C3.3.C3.3.C Q.Q.CQ.Q.CQ.Q.CQ. Q.CQ.Q.CQ.Q.CQ.Q.tccctccttg ttttccttcc ttcatctctt tggtggtgga ggacgatatt acaaacaagc actaacaaag gaacaaacaa ataatgacta Scp06標(biāo)記的特異引物序列 F:ccttgttttccttccttcatct R:gagagaagcctgcagttagtcat ； Scp07 長(zhǎng)度 301bpsQ.Q.CQ.Q.CQ.Q.CQ. Q.CQ.Q.CQ.Q.CQ.Q. C3.3.C3.3.C3.3.Caggagaaaac aataataact actactacta ttaatatttc ttttactgga acaactgcca ccaccaccac caccagcaca taccaatacc atcactgcat tataaaaccc acgaactgtt aScp07標(biāo)記的特異引物序列F :agcaacagcaggagaaaacaat R cctattatgaacagttcgtggg ； Scp08 長(zhǎng)度 271bps taacccttcc tttgtaaagt tagcgcgtca attccatgta ttcttcttct tcttcttctt gttattatta tacttttgtt gtgttcggtt ttgttacact ttttcttttg ttgttgtggtgtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt tgcgtgattg ttgctgtgta cacacgccgccaatccatcc acactctaca ctcatccacc caactcattc caatccaccc ccatC 3.3. C 3.3. C 3.3. Cccactattat attcacacag actgcaggctagccattgac cacacattca tacccctcta atccatccat atccattcatQ.Q.CQ.Q.CQ.Q.CQ.ctactactac atactaccac agcagtagtg cataatagggttttaacagt cttcttgttc acttatgaaa ttagctcagttcctatcgat tccatccatc ctgaccagcc ccatctatcc ttagccgtactttcctgaca ttcccttata acagacagac tctctcactccatcttttcc gtagtggtgg agacagacaa aggcttaQ.CQ.Q.CQ.Q.CQ.Q.tattaaattt caccaccacc aagaggcacg gcaatcaattcagcaacagc attactacta accaccagca gttacataac agtgcatatttgtgcgctct ttgttcttgt agctctcgtt ttttactttcttgtattgtg tcttcttatt ttgtgtcttg gtttgtgtcttttgctttgg ttttgagtca taataagtgg t ScpOS標(biāo)記的特異引物序列 F:cgctctttgtattgtgattcc R :atgactcaaaaccaaagcaaa ； Scp09 長(zhǎng)度 315bpstaagccgcca gagcaaggcc agtattgaaa tgatagggta gatgacacct cgccaggatt ttctgtccgt ttgtctgtgt gtatgctgtt gcttgcctgt gtgtctgttt tcctttatat ttgtctgttt gtcagtgtct gtctgtttgt gtgtctgtcg taaagtctca ctcttctttt ctttgtctgt ctgtccttac ttctgactgt caatctctcc ctctctctct ctctctctct ctctctctct gcttgttctc gccgttgtta ccgtcgggag ttgcttttgt cgttgttgtt gttgttgttg ttgtt Scp09標(biāo)記的特異引物序列 F :cagtattgaaatgatagggtagatgac R:cggtaacaacggcgagaac ； ScplO 長(zhǎng)度 274bpstaacgaagct aacacaacta gcgccgcccc tcgtgcgtgt gtgtgtgtgg cgagacgagt gcaagcaaga gagtgtttat ctacttgtct tgacttgtct gcacctacaa gagcaatatt tgtcttgtac tgtgtttccc gggccgacag aaagcagcgg tgtgggtgag agggaatatg atacagtgcg gagataaggc cagtaatccc cgagtgtgta gggttgtgca gcgcgaggtc ttaaggctgg gtagtgatct agacgcgact taca ScplO標(biāo)記的特異引物序列 F:acaactagcgccgcccctcg R:acccagccttaagacctcgc ； Scpll 長(zhǎng)度 262bpstaacacacac tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctaagcttt tttcatttca tcttccatcc gatatttttt tttttcactt ttccttcctt ccctcgttcc ttcctgactt tctctcttcg tccctcttcc taaccttttt ctccggtctc ttcttttact cctttatctc ctttcatctc gctgttcttt tgcattattt tatctggttc ttttctctca acttgtatctta Scpll標(biāo)記的特異引物序列 F:ttcatcttccatccgatatt R :gaaccagataaaataatgcaaa ； Scpl2 長(zhǎng)度 294bpstaataatatc aacatggcgg tcacccatcc aagaactaac cgaacccccc gttgcttaac ctcacttaca acacgaaaag ctgcgtattg aacatagtaa ggtcgttggc acacacacacacgcaatgat ctagagtaac atgcatccaa attacaagtt tttttttctc tctttctctc atagtaatta gcgtcattca attaacacct gctcgtgatt gatgagggga agttaatgac tgatgcattt gttgctaata attaggcgaa gate Scpl2標(biāo)記的特異引物序列F:cacccatccaagaactaacc R:caatcacgagcaggtgttaa ； Scpl3 長(zhǎng)度 273bpstaagcactat ttgtttggat tcttcttttc agtgtccaca ttcgttaatg agttgtttgt ggtgctggtg aatctgagct agaggattga gtagtggtag gtgattctga ttatgatagt gagtttgaat ttaggttaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca C3.C3.C3.C3.C3. ccttccgaag cttgctgcca gcgcccacat gccactctca caccctgtac tcctgtggta tagaagtctt aattatactg tta Scpl3標(biāo)記的特異引物序列 F :tgtttggattcttcttttcag R :taccacaggagtacagggtg ； Scpl4 長(zhǎng)度 359bpstaaacacaaa tacactgttg tgaaaacgta agacagaccg gtagacacaa agaccgaaag tttttatagt attgtagatt atatgacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cgtgtagagg aggacagcca aggccagaaa aacagagtga aaataatgaa cgttaaatta attgcggctc ccacattgac aactggagag tttccaaaac gctggccagt tcattttctg agatgtcttg atatttccct catgcaatag ttgtaattat aagaaggaga aaaagagaaa caagtaaagt gttttagagt ttgccactga aatgcatgaa agagtgaaaa ttgcggtta Scpl4標(biāo)記的特異引物序列 F :ttgtgaaaacgtaagacagac R :aattacaactattgcatgagg ； Scpl5 長(zhǎng)度 422bpstaacacagac tacgaatgta gactttttta tgcatgtgat atgggatatg cgtgtgtatt gtgtgctgga tgaatacgag taagaacgtt cagatgtgtg tatatgtgat ggcgtatgag atggtaaagt atgcgtgtag gatagcaaat gtataaactc gtgtttatga atatagtgtg tgtgtgtgtg tgtgttctaa tcaatcattg gctatgcctt ccctctagtc gctagcgagt gaagatgaca cgctgccatt gccttgtgct aaggaagcag acactaacgt cggccgtcgg cccttcaagc cagacagtat agttggcgga ggtgactgag acacgtatta caatgcagta ttacaatgac gtgagggtac gggatgagta C 3. C C 3. C 3.3. C 3. ttcataacca gctaattgat taScpl5標(biāo)記的特異引物序列 F taacacagactacgaatgtagactt R :gcatagccaatgattgattaga ； Scpl6 長(zhǎng)度 262bpstaactccaaa ggaatgtggt gagtgaaagc aaacccaagt aactgaggag tggtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtatgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtatgtgt gtgtgtgtgt gtgtattcaa ccctttgact gccacttggt acacctttcc ctacagccac attcgatctt tgaactggga agaaattgca aaatgtattc tatttcgtaa ctaactttct tgtagatgct taScpie標(biāo)記的特異引物序列 F :aaacccaagtaactgaggag R :gtagggaaaggtgtaccaag ； Scpl7 長(zhǎng)度 187bps agatagacag acacagaggc atactgaaac tgacatatat acataccttc tgacaaacac`3.C3.C3.C3.C3.C 3.C3.C3.C3.C3.C 3.C3.C3.C3.C3.C`3. C 3.3.3. 3.3. 3.acagatgcag`3.C3.C3.C3.C3.Cggccattcag agagataact aactccggtatcagtccaat1`3.C3.C3.C3.C3.CtgcgaatgccgacgttaScpl7標(biāo)記的特異引物序列 F:agatagacagacacagaggcatact R:taacgtcggcattcgcatac ； Scpl8 長(zhǎng)度 307bpstaactgcagt cccttacctg aagatgctac aggtgtgctc aggtgtggct aatgagtccc cacacctgtc ccctcccaca cctggcaagg gaaaatggaa ggaggaggaa gaaagaggaa aagaaggagg aggaaaaaag tggaaaaatg agagaaggaa gtgatggagg gaagaagaaa aaaggaatag gagaaaagag aagaggtgaa gagaggaaag aggaaaaaaa gaagagaagg gatgaaggaa gaagggagag agagagagag agtcactcta gctttgcgtt ggggcaggcg ctttctcScplS標(biāo)記的特異引物序列 F:cccttacctgaagatgct R :caacgcaaagctagagtg ； Scpl9 長(zhǎng)度 179bpstaagggcgat gattattggt tggccagaac aagcggcccc tcccaggcgc tggaggaagg gaggtggaag gaaggaagga agaagaagaa gaaaagaaag agaaggaaag aaagctgcaa ataaaaaaaa ggacgaatcg ggtgaagtga gtcagtggat ggaggagaga gagagagag Scpl9標(biāo)記的特異引物序列 F :ggcgatgattattggttggc R :ttcacccgattcgtcctttt ； Scp20 長(zhǎng)度 155bpstaacccgcgt gcttgtgtat ttatttgtgt attggatata aagtggaact gatggcgact catgcattag gagggcgaag tagagtgaca gagatcaggg ctgtgtgagg ggcgtgtgag gggagagaga gagaaggggt atgggagcgg tgtgt Scp20標(biāo)記的特異引物序列 F:tggatataaagtggaactgatggcg R:cacaccgctcccataccccttο
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種擬穴青蟹微衛(wèi)星分子標(biāo)記的構(gòu)建方法，其特征在于所 述步驟(6)中的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系總體積為25μ1，包括基因組DNA模板Ιμ 、上下游 引物終濃度均為0. 4 μ mol/L、Mg2+終濃度為1. 5mmol/L、dNTP終濃度為0. 2mmol/L、TagDNA 聚合酶0. 75U、IXPCR buffer，最后補(bǔ)充滅菌雙蒸水至總體積為25 μ 1 ；反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒、引物特異的退火溫度退火50秒、72°C延伸50秒，30個(gè)循環(huán)； 最后于72°C延伸7分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種擬穴青蟹微衛(wèi)星分子標(biāo)記的構(gòu)建方法，其特征在于所 述步驟(7)中的檢測(cè)步驟包括將步驟(6)的PCR產(chǎn)物于95°C變性后，上樣3μ1于6%的 變性聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，再經(jīng)染色、顯色后獲得了擬穴青蟹的PCR產(chǎn)物電泳圖像。
9.一種擬穴青蟹微衛(wèi)星分子標(biāo)記應(yīng)用于擬穴青蟹遺傳變異分析、種質(zhì)資源保護(hù)與管 理、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及標(biāo)記輔助育種領(lǐng)域。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種擬穴青蟹微衛(wèi)星分子標(biāo)記的獲得方法，包括擬穴青蟹基因組DNA的提??；基因組DNA的酶切、連接接頭及預(yù)擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物與探針和磁珠雜交及再次PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆及測(cè)序；序列分析及微衛(wèi)星特異引物設(shè)計(jì)；不同地理群體或群體內(nèi)個(gè)體的基因組DNA的PCR擴(kuò)增；6％的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；擬穴青蟹遺傳變異的多態(tài)性圖譜的獲得。本發(fā)明在擬穴青蟹遺傳變異分析、種質(zhì)資源保護(hù)與管理、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及標(biāo)記輔助育種等領(lǐng)域中具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101886070SQ201010129629
公開(kāi)日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2010年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月19日
發(fā)明者馬凌波, 馬春艷, 馬洪雨 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所