專利名稱：防治番茄青枯病的真菌菌劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蔬菜病害生物防治技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種防治番茄青枯病的真菌菌 劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
番爺青枯病是由爺青枯拉爾氏菌[Ralatonia solanacearum(smith) Yabuuchi et al]引起的，在世界范圍內(nèi)廣泛傳播的毀滅性土傳病害，熱帶、亞熱帶的國家和地區(qū)，如南 美洲、日本、印度、菲律賓，我國臺灣、廣東、浙江、福建、江蘇、湖北、四川、重慶等地區(qū)嚴(yán)重發(fā) 生。該病可造成植株大面積萎蔫死亡，一般田塊發(fā)病率為10% 15%，重病田發(fā)病率高達(dá) 80% 98. 5%，導(dǎo)致番茄產(chǎn)量嚴(yán)重下降，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。R. solanacearum是一種土壤習(xí)居菌，能夠在無寄主情況下的土壤中存活很長時 間。R. solanacearum主要從根系侵入植株，也可從莖部傷口侵入并直接進(jìn)入導(dǎo)管系統(tǒng)，在其 中大量繁殖并產(chǎn)生代謝物質(zhì)，阻礙植物體內(nèi)水分運(yùn)輸，造成植株萎蔫。目前，針對番茄青枯 病還缺少有效的化學(xué)藥劑，加之青枯菌對化學(xué)農(nóng)藥易產(chǎn)生抗藥性，而且大量使用化學(xué)農(nóng)藥 會造成環(huán)境污染和生產(chǎn)成本上升。休耕期撒施石灰可減輕病害發(fā)生，但易造成土壤板結(jié)?？?病育種工作，由于缺乏理想的抗源材料，進(jìn)展緩慢。水早輪作要求輪作年限較長，且只有在 附近無其它宿主存在的情況下方可起到良好的效果，因而實(shí)施起來較困難。土壤滅菌后形 成了土壤生物真空，一旦土壤受到病原菌侵染，會導(dǎo)致病原菌的大爆發(fā)而造成更為嚴(yán)重的 后果。生物防治作物病害具有可利用資源豐富、成本低廉、能夠避免環(huán)境二次污染等優(yōu)點(diǎn)， 被認(rèn)為是解決土傳病害的一條有希望的技術(shù)途徑。其中，利用拮抗微生物進(jìn)行病害防治是 生物防治中的一個重要發(fā)展方向。市場上已有一些利用病原菌拮抗菌防治植物病害的微生 物菌劑、菌肥等產(chǎn)品，也有一些番茄青枯病生物防治的報(bào)導(dǎo)，但是目前還未見一家產(chǎn)品田間 應(yīng)用效果好、防效穩(wěn)定的報(bào)導(dǎo)。而且微生物菌劑、菌肥使用效果受環(huán)境條件影響較大，不同 環(huán)境條件來源的菌種適應(yīng)范圍有限。本發(fā)明菌劑中應(yīng)用的菌株從浙江麗水地區(qū)番茄種植地 分離而得，對浙江省及氣候環(huán)境條件相近的省份可能具較強(qiáng)的適應(yīng)性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于，針對番茄青枯病缺少有效的化學(xué)藥劑，加之青枯菌對化學(xué)農(nóng)藥 易產(chǎn)生抗藥性的缺陷，提出一種能有效防治番茄青枯病的真菌菌劑；本發(fā)明的另一目的是 提出該菌劑簡易、低成本的制備方法；本發(fā)明的再一目的是提出該菌劑簡單、有效的應(yīng)用方法。本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。一種 Trichoderma gamsii 菌株 6-18 的篩選與鑒定一、2008年，從浙江嘉善、麗水、杭州等番茄種植基地采集到21個土樣，利用馬丁 氏培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)、分離，共分離到真菌270余株；然后進(jìn)行平板拮抗試驗(yàn)，從中篩選到對 番茄青枯病茄青枯拉爾氏菌有較好拮抗效果的初篩真菌15株；通過盆栽試驗(yàn)，從浙江麗水采集的土樣中進(jìn)一步篩選得到對番茄青枯病茄青枯拉爾氏菌具有穩(wěn)定拮抗效果的復(fù)篩菌 株6-18 ；二、菌株6-18的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及基因測序1.菌落形態(tài)、顯微形態(tài)及培養(yǎng)特征菌株6-18在PDA培養(yǎng)基上菌落生長較快，黑暗條件下，25°C培養(yǎng)3天菌落直徑為 40-50mm ；菌落呈白色，平鋪，絮狀；背面無色素，有明顯泥土氣味；菌絲有隔膜，直徑2_10微 米，形成球形厚垣孢子(見圖1)，壁光滑，直徑6-14微米，未觀察到分生孢子。2、菌株6-18的rRNA基因序列測定包括18S rRNA片段，ITSU5. 8S rRNA、ITS2的全序列及28S區(qū)序列片斷(測序引 物:ITS4)5’ -TCAACATTTCAGAAGTTGGGTGTTTTACGGACGTGGACGCGCCGCGCTCCCGGTGCGAGTTGTGCA AACTACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTCGGGGCCGGGATCCCGTCTTAGGGGTTCCCGAT CCCCAACGCCGACCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGG GCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCT TCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTTGAATTTTTGCTCAGAGCTGTAAGAAA TAACGTCCGCGAGGGGACTACAGAAAAGAGTTTGGTTGGTCCCTCCGGCGGGCGCCTGGTTCCGGGGCTGCGACGCA CCCGGGGCGTGACCCCGCCGAGGCAACAGTTTGGTATGGTTCACATTGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGAT CCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTAC 3’三、菌株6-18的鑒定與保藏上述資料寄中國科學(xué)院微生物研究所，根據(jù)該菌株6-18的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征和 基因測序進(jìn)行分類，鑒定為Trichoderma gamsii (該菌種尚未定中文名稱)。Trichoderma gamsii菌株6-18已于2009年10月9日在北京由中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號=CGMCC No. 3335。一種防治番茄青枯病的真菌菌劑，該菌劑以保藏編號CGMCC No. 3335的 Trichoderma gamsii菌株6_18為菌種，馬丁氏固體培養(yǎng)基為斜面培養(yǎng)基，馬鈴薯蔗糖液體 培養(yǎng)基為搖瓶菌種培養(yǎng)基和發(fā)酵罐培養(yǎng)基；經(jīng)各級發(fā)酵、制備成液體真菌菌劑，或以滅菌麩 皮或滅菌草炭為吸附劑進(jìn)一步制備成固體真菌菌劑而獲得。一種防治番茄青枯病真菌菌劑的制備方法，該方法按以下步驟進(jìn)行(1)各級培養(yǎng)基的配制與吸附載體的準(zhǔn)備，其中a)斜面培養(yǎng)基馬丁氏固體培養(yǎng)基，備用；b)搖瓶菌種培養(yǎng)基馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基，備用；c)生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)基同搖瓶菌種培養(yǎng)基，備用；(2)斜面菌種培養(yǎng)將CGMCC No. 3335菌株6_18接種于步驟(1)斜面培養(yǎng)基上， 在28-32°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4天，取出后直接應(yīng)用或放入冰箱中冷藏，保存；(3)搖瓶菌種擴(kuò)繁在無菌操作下，取一鏟斜而菌種接入60ml步驟(1)馬鈴薯蔗 糖液體培養(yǎng)基中，于28-32°C，120-220轉(zhuǎn)/分的搖床中，培養(yǎng)40-64小時，取出直接應(yīng)用或 放入冰箱中冷藏，保存；(4)生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)將步驟(1)生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)基放入發(fā)酵罐中，在該罐內(nèi) 溫度121 V，進(jìn)行30分鐘蒸汽高溫滅菌后，在保持罐體壓力0. 02-0. 04MPa條件下，冷卻步驟(3)搖瓶菌種按3-10%的接種量迅速 接入發(fā)酵罐內(nèi)；在攪拌機(jī)轉(zhuǎn)速120-220轉(zhuǎn)/分，溫度28-32 °C，通氣量4m3/h，罐壓保持 0. 02-0. 04MPa,pH自然，培養(yǎng)40-64小時，至發(fā)酵液菌絲體鮮重為0. 5g/ml以上，裝瓶，即為 液體真菌菌劑；(5)固體菌劑的制備先將吸附載體麩皮或草炭進(jìn)行高溫滅菌后冷卻至室溫；再 將步驟(4)液體真菌菌劑與滅菌后吸附載體按重量1 5比例拌勻，吸附，檢測其活菌量為 0. 2億cfu/g以上、含水率控制在30%以下，裝袋、封口，即為固體真菌菌劑。上述防治番茄青枯病真菌菌劑的應(yīng)用方法是(1)液體菌劑番茄育苗至移栽前1星期，在育苗盤中按每株l_5ml菌劑量稀釋至 1-10倍后灌根；番茄苗盆栽或地栽后，按每株I-IOml菌劑量稀釋至10-100倍后灌根一次， 10天后再以相同菌劑量補(bǔ)灌一次；(2)固體菌劑番茄育苗至移栽前1星期，在育苗盤中按每株5_25g菌劑量撒在根 部，并灑適量水以使生防菌能滲入土中；番茄苗盆栽或地栽后，按每株5-50g菌劑量撒根， 并澆灌適量水；10天后再按相同菌劑量補(bǔ)用一次；(3)無論液體或固體真菌菌劑均應(yīng)選擇在晴天使用； (4)在使用菌劑期間均應(yīng)避免在植株根部使用消毒劑、殺菌劑及抗生素類藥物。本發(fā)明的有益效果是一、本發(fā)明首次采用Trichoderma gamsii菌為菌種，經(jīng)發(fā)酵制備成液體或固體菌 劑后，為番茄青枯病的防治提供了一種新的有效途徑；二、本菌劑通過防治番茄青枯病的盆栽試驗(yàn)后表明，能使番茄青枯病發(fā)病率明顯 下降，在移栽后15天，本菌劑防病效果達(dá)50%以上，至試驗(yàn)結(jié)束時(移栽后37天)，本菌劑 仍能保持有一定的防病效果(見實(shí)施例6)。三、使用本菌劑后可以推遲番茄青枯病的發(fā)病時間，降低發(fā)病程度，可減少農(nóng)藥的 使用量，既減輕經(jīng)濟(jì)損失，又可減少農(nóng)藥對環(huán)境的污染；四、本發(fā)明制備菌劑所采用的土豆、麩皮和草炭等原料來源豐富，發(fā)酵工藝較簡 單，生產(chǎn)成本較低廉，該菌劑有效保質(zhì)期在半年以上。


圖1菌株6-18的菌絲體及厚垣孢子顯微攝影圖；圖2菌株6-18對番茄青枯病菌平板拮抗試驗(yàn)效果攝影圖；圖3菌株6-18液體菌劑對番茄青枯病的盆栽生防對比效果曲線圖。其中，圖3為摘要附圖。
具體實(shí)施例方式通過以下實(shí)施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但以下實(shí)施例僅是說 明性的，本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的內(nèi)容所限制。對所涉材料的說明番茄青枯病茄青枯拉爾氏菌浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所分離、保存；蛋白胨生化制劑，國產(chǎn)；
Yeast extract (酵母浸膏)生化試劑，國產(chǎn)；Casein hydrolysate (洛蛋白水解物)生化試劑，國產(chǎn)；瓊脂生化試劑，國產(chǎn)；K2HPO4 分析純，國產(chǎn)；葡萄糖分析純，國產(chǎn)；MgS047H20 分析純，國產(chǎn)；孟加拉紅(Rose Bengal)分析純，國產(chǎn)；鏈霉素分析純，國產(chǎn)。實(shí)施例1 (真菌分離純化)1培養(yǎng)基馬丁氏(Martin)培養(yǎng)基=KH2PO4LOg,葡萄糖 10. 0g, MgSO4 · 7H20 0. 5g，蛋白胨 5. 0g，瓊脂15-20g，水1000ml ；此培養(yǎng)液IOOOml加孟加拉紅水溶液3. 3ml ；112. 6°C滅菌 30分鐘；臨用時每IOOml培養(yǎng)基中加鏈霉素液0. 3ml (30ppm)；2試驗(yàn)步驟2. 1培養(yǎng)基制備配制馬丁氏培養(yǎng)基，制備真菌斜面；2. 2 土壤稀釋液的制備(1)稱取IOg 土壤，加入IOOml帶有玻璃珠的無菌水于500ml三角瓶中，振蕩15分 鐘，即10-1 ；(2)吸取土懸液10ml，加入90ml無菌水于500ml三角瓶中，S卩1(Γ2 ；(3)從(2)中吸取10ml，加入90ml無菌水于500ml三角瓶中，即10_3 ；2. 3真菌分離(4)從(1) (2) (3)中分別吸取0. 1ml，加入到馬丁氏(Martin)培養(yǎng)基平板中進(jìn)行 涂布培養(yǎng)(28-30 °C、3-5天)，各3個重復(fù)；(5)選擇20-200菌落數(shù)的培養(yǎng)皿，挑取菌落進(jìn)行斜面培養(yǎng)(28_30°C，3_5天)；2. 4 多個土樣(6)共21個土樣，每個土樣重復(fù)上述2. 1 2. 3步驟；2. 5結(jié)果分離到真菌270多株。實(shí)施例2 (分離真菌對番茄青枯病茄青枯拉爾氏菌平板拮抗試驗(yàn))1.培養(yǎng)基1. 1固體培養(yǎng)基青枯病菌培養(yǎng)基配制MgS047H200. 3g，K2HP042. 0g，酵母浸膏4. 0g，洛蛋白水解物 8. 0g，蔗糖 10. 0g，瓊脂 18g，蒸餾水 1000ml ；馬丁氏培養(yǎng)基配制同實(shí)施例1中2. 11. 2液體培養(yǎng)基
0074]番茄青枯病菌液體搖瓶培養(yǎng)基；青枯病菌培養(yǎng)基不加瓊脂即可；2、試驗(yàn)步驟2. 1培養(yǎng)基制備配制青枯病菌培養(yǎng)基(固體、液體)，制備病原菌茄青枯拉爾氏菌斜面；配制馬丁氏培養(yǎng)基(固體)，制備真菌斜面；
2. 2平板拮抗試驗(yàn)2. 2. 1菌種活化將番茄青枯病菌和真菌(實(shí)施例1的分離菌)進(jìn)行菌種活化；2. 2. 2制備青枯病菌平板活化青枯病菌接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)， 28-30200轉(zhuǎn)/分，隔天以青枯病菌培養(yǎng)基倒平板，凝固后每個平板中加入0. Iml青枯病 菌發(fā)酵液(發(fā)酵約40小時)，涂布，28-30°C培養(yǎng)過夜，備用；2. 2. 3準(zhǔn)備分離真菌斜面活化分離真菌接入斜面進(jìn)行培養(yǎng)，28-30°C，培養(yǎng)3-5天，備用；2. 2. 4平板拮抗試驗(yàn)用滅菌接種鏟挖一塊帶分離真菌的瓊脂塊放入青枯病菌平 板，每個平板放5株不同拮抗真菌，3個重復(fù)；24h左右觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，主要考察抑菌圈有無 及大??；3、結(jié)果通過平板拮抗試驗(yàn)得到拮抗效果較好的真菌共15株，其中，菌株6-18的 拮抗效果最優(yōu)(圖2菌株6-18拮抗效果)，故選菌株6-18作為制備菌劑的出發(fā)菌株。實(shí)施例3 (菌株6-18發(fā)酵固體菌劑制備1)按以下步驟進(jìn)行(1)各級培養(yǎng)基的配制，其中a)斜面培養(yǎng)基馬丁氏固體培養(yǎng)基(同實(shí)施例1)，備用；b)搖瓶菌種培養(yǎng)基馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基，備用；c)生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)基同搖瓶菌種培養(yǎng)基，備用；馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基20%馬鈴薯浸出液IOOOml+蔗糖20g ；其中，20%馬鈴薯 浸出液的制備稱取去皮馬鈴薯塊200g，加水IOOOml煮至馬鈴薯塊能被玻棒戳破為止，過 濾，補(bǔ)足原來的水量。(2)斜面菌種培養(yǎng)將CGMCC No. 3335菌株6_18接種于步驟(1)斜面培養(yǎng)基上， 在28-32°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4天，取出后直接應(yīng)用或放入4-7°C冰箱中冷藏，保存；(3)搖瓶菌種擴(kuò)繁在無菌操作下，取一鏟斜面菌種接入60ml步驟(1)馬鈴薯蔗 糖液體培養(yǎng)基中，于28-32 °C，120轉(zhuǎn)/分的搖床中，培養(yǎng)40小時，取出直接應(yīng)用或放入冰箱 中冷藏，保存；(4)生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)將步驟(1)生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)基放入發(fā)酵罐中，在罐內(nèi)溫度 121°C，進(jìn)行30分鐘蒸汽高溫滅菌后，在保壓0. 02-0. 04MPa下冷卻至28_32°C ；在火焰保護(hù) 下通過接種閥門將步驟(3)搖瓶菌種按3%的接種量迅速接入發(fā)酵罐內(nèi)；在攪拌機(jī)轉(zhuǎn)速220 轉(zhuǎn)/分，溫度28-32°C，通氣量4m3/h，罐壓0. 02-0. 04MPa, pH自然下，培養(yǎng)64小時，發(fā)酵液 菌絲體鮮重為O. 5g/ml以上，裝瓶，即為液體真菌菌劑；(5)固體菌劑的制備先將吸附載體麩皮在121°C、0. IMPa，滅菌30分鐘后冷卻至 室溫；再將步驟(4)液體真菌菌劑與滅菌后麩皮按重量1 5比例拌勻，吸附，檢測其活菌 量為0. 2億cfu/g以上、含水率控制在30%以下，裝袋、封口，即為固體真菌菌劑。實(shí)施例4 (菌株6-18發(fā)酵液體菌劑制備2)本例中，步驟(3)搖瓶菌種擴(kuò)繁中于28_32°C，170轉(zhuǎn)/分的搖床中，培養(yǎng)52小 時；步驟(4)生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)中在保壓0. 02-0. 04MPa下冷卻至28_32°C ；按6%的接種量 迅速接入發(fā)酵罐內(nèi)；在轉(zhuǎn)速170轉(zhuǎn)/分，溫度28-32 °C，通氣量4m3/h，罐壓0. 02-0. 04MPa,培養(yǎng)52小時，發(fā)酵液菌絲體鮮重為0. 5g/ml以上，裝瓶，即為本例的最終產(chǎn)品-液體真菌菌 劑；其余步驟、工藝同實(shí)施例1。實(shí)施例5 (菌株6-18發(fā)酵固體菌劑制備3)本例中，步驟(3)搖瓶菌種擴(kuò)繁中于28_32°C，220轉(zhuǎn)/分的搖床中，培養(yǎng)64小時； 步驟(4)生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)中在保壓0. 02-0. 04MPa下冷卻至28_32°C ；按10%的接種量迅 速接入發(fā)酵罐內(nèi)；在轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分，溫度28-32°C，通氣量4m3/h，罐壓0. 02-0. 04MPa,培養(yǎng) 40小時，發(fā)酵液菌絲體鮮重為0. 5g/ml以上；步驟(5)固體菌劑的制備將步驟(4)液體真 菌菌劑與滅菌后草炭按重量1 5比例拌勻，吸附，即為固體真菌菌劑；其余步驟、工藝同實(shí) 施例1。實(shí)施例6 (菌株6-18液體菌劑對番茄青枯病的盆栽生防效果對比試驗(yàn))1、育苗1. 1育苗基質(zhì)、馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基和青枯病原菌液體培養(yǎng)基準(zhǔn)備育苗基質(zhì)草炭蛭石珍珠巖=7 1 0.5，然后用自來水調(diào)節(jié)含水率至 60% 70%，備用；馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基同實(shí)施例3青枯病原菌液體培養(yǎng)基同實(shí)施例2中的1. 2，備用；1.2播種在育苗穴盤(規(guī)格90 X 60)中裝入四分之三高左右的1. 1制備基質(zhì)，用 手輕壓，然后每穴中均勻撒入50顆蕃茄種子，再鋪上一層薄薄的基質(zhì)，并用塑料膜蓋住穴 盤，防止水分蒸發(fā)，備用；1. 3出苗把1. 2準(zhǔn)備好的播種穴盤放入人工氣候箱培養(yǎng)，溫度25°C，放入大盆水 保濕，打開日光燈，18點(diǎn)以后關(guān)掉，并保證日夜溫差在10°C以上；4 5天后出苗，掀掉塑料 膜，培養(yǎng)至兩子葉平展，備用；2、苗移入穴盤中培養(yǎng)2.1苗移栽在穴盤(規(guī)格45X45)每穴中裝滿按1. 1制備基質(zhì)(略壓緊)，然后每穴中移入 1株1. 3準(zhǔn)備好的兩子葉平展苗，兩指在根部略壓緊，在大棚中培養(yǎng)；培養(yǎng)至3 4片真葉 (大約3 4周)；2. 2番茄青枯病菌和菌株6-18發(fā)酵液的準(zhǔn)備番茄青枯病菌和菌株6-18的活化，然后每株接液體搖瓶培養(yǎng)，28 30°C，200轉(zhuǎn)/ 分鐘，約培養(yǎng)40小時后，備用；2. 3預(yù)用菌株6-18發(fā)酵液苗移栽入盆前1個禮拜，每穴中加入5ml菌株6-18發(fā)酵液；3、盆栽3.1盆栽土準(zhǔn)備年前從浙江麗水番茄種植基地青枯病發(fā)病嚴(yán)重的地塊挖2 4噸土，備用；3. 2 土裝盆稱取適量的3. 1準(zhǔn)備土，混入2%有機(jī)肥，每盆(規(guī)格280X220)中裝入4. 5公斤 混土，備用；3. 3 移栽每盆中移栽5株番茄苗，根據(jù)需要補(bǔ)充水分；本試驗(yàn)設(shè)3個處理，即CKl和CK2及
8處理1，每個處理6盆，每盆5株苗，均勻分布；其中，CKl 移栽時不加任何菌；CK2 移栽時每株只澆50ml番茄青枯病菌稀釋發(fā)酵液 (稀釋1000倍)；處理1 移栽時每株根部先澆50ml番茄青枯病菌稀釋發(fā)酵液(稀釋1000 倍)，然后再澆50ml拮抗菌-菌株6-18稀釋發(fā)酵液(稀釋10倍)；3. 4記錄每天記錄每盆發(fā)病株數(shù)；4、結(jié)果由表1與圖3可以看出，CKl自始至終無發(fā)病株；CK2從2009年5月21日開始發(fā) 病，到2009年5月21日發(fā)病株數(shù)達(dá)到24株；處理1從2009年5月21日開始發(fā)病，到2009 年5月31日發(fā)病株數(shù)只有11株，說明菌株6-18對番茄青枯病具一定防效，雖然到觀察結(jié) 束，處理1仍比CK2發(fā)病株少，但到后期其防效已不明顯，可能隨著番茄青枯病菌的大量繁 殖，菌株6-18的拮抗效果已逐步轉(zhuǎn)弱，無法防控。因此使用本菌株6-18進(jìn)行青枯病防治時， 后期應(yīng)補(bǔ)用菌株6-18制品效果會更好。表1番茄青枯病菌拮抗效果試驗(yàn)記錄(發(fā)病株數(shù))(試驗(yàn)時間2009年5月17日至2009年6月22日) 注CK1_不加任何菌，CK2-只加青枯病原菌，處理1-加青枯病原菌及6-18菌。
權(quán)利要求
一種Trichoderma gamsii菌株6 18，其菌株保藏號為CGMCC NO.3335。
2.一種防治番茄青枯病的真菌菌劑，其特征在于該菌劑以保藏編號為CGMCCNo. 3335 的Trichoderma gamsii菌株6_18為菌種，馬丁氏固體培養(yǎng)基為斜面培養(yǎng)基，馬鈴薯蔗糖液 體培養(yǎng)基為搖瓶菌種培養(yǎng)基和發(fā)酵罐培養(yǎng)基；經(jīng)各級發(fā)酵、制備成液體真菌菌劑，或以滅菌 麩皮或滅菌草炭為吸附劑進(jìn)一步制備成固體真菌菌劑而獲得。
3.一種防治番茄青枯病真菌菌劑的制備方法，其特征在于該方法按以下步驟進(jìn)行(1)各級培養(yǎng)基的配制與吸附載體的準(zhǔn)備，其中a)斜面培養(yǎng)基馬丁氏固體培養(yǎng)基，備用；b)搖瓶菌種培養(yǎng)基馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基，備用；c)生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)基同搖瓶菌種培養(yǎng)基，備用；(2)斜面菌種培養(yǎng)將CGMCCNo. 3335菌株6_18接種于步驟(1)斜面培養(yǎng)基上，在 28-32°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4天，取出后直接應(yīng)用或放入冰箱中冷藏，保存；(3)搖瓶菌種擴(kuò)繁在無菌操作下，取一鏟斜面菌種接入60ml步驟(1)馬鈴薯蔗糖液 體培養(yǎng)基中，于28-32°C，120-220轉(zhuǎn)/分的搖床中，培養(yǎng)40-64小時，取出直接應(yīng)用或放入 冰箱中冷藏，保存；(4)生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)將步驟(1)生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)基放入發(fā)酵罐中，在該罐內(nèi)溫 度121 °C，進(jìn)行30分鐘蒸汽高溫滅菌后，在保持罐體壓力0. 02-0. 04MPa條件下，冷卻 至28-32°C ；在火焰保護(hù)下通過接種閥門將步驟(3)搖瓶菌種按3-10%的接種量迅速 接入發(fā)酵罐內(nèi)；在攪拌機(jī)轉(zhuǎn)速120-220轉(zhuǎn)/分，溫度28-32 °C，通氣量4m3/h，罐壓保持 0. 02-0. 04MPa,pH自然，培養(yǎng)40-64小時，至發(fā)酵液菌絲體鮮重為0. 5g/ml以上，裝瓶，即為 液體真菌菌劑；(5)固體菌劑的制備先將吸附載體麩皮或草炭進(jìn)行高溫滅菌并冷卻至室溫；再將步 驟(4)液體真菌菌劑與滅菌后吸附載體按重量1 5比例拌勻，吸附，檢測其活菌量為0.2 億cfu/g以上、含水率控制在30 %以下，裝袋、封口，即為固體真菌菌劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了防治番茄青枯病的真菌菌劑及其制備方法，屬于蔬菜病害生物防治技術(shù)領(lǐng)域。該菌劑以CGMCC No.3335的Trichoderma gamsii菌株6-18為菌種，馬丁氏固體培養(yǎng)基為斜面培養(yǎng)基，馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基為搖瓶菌種培養(yǎng)基和發(fā)酵罐培養(yǎng)基；經(jīng)各級發(fā)酵、制備成液體或固體真菌菌劑而獲得。本發(fā)明首次采用Trichoderma gamsii菌為菌種，經(jīng)發(fā)酵制備成菌劑后，為番茄青枯病的生物防治提供了一種新的有效途徑；其防病效果達(dá)50％以上，既可減少常規(guī)農(nóng)藥的使用量，又可減少對環(huán)境的污染，且其原料豐富，發(fā)酵工藝簡單，生產(chǎn)成本低廉。本發(fā)明可在番茄種植地區(qū)及農(nóng)藥制造企業(yè)推廣應(yīng)用。
文檔編號C12R1/885GK101914449SQ20101010707
公開日2010年12月15日 申請日期2010年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月8日
發(fā)明者吳傳珍, 奚輝, 朱鳳香, 楊友坤, 洪春來, 王衛(wèi)平, 薛智勇, 陳曉旸 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院