專利名稱：鐵皮石斛原球莖的間歇式發(fā)酵培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專利申請涉及一種中藥材的組織培養(yǎng)技術(shù)，尤其涉及中藥材鐵皮石斛組織
培養(yǎng)中的中間產(chǎn)物原球莖的培養(yǎng)技術(shù)。
背景技術(shù)：
鐵皮石斛為中華十大仙草之首，國家三級重點(diǎn)保中藥材，為歷代中國藥典收錄，由 于自然繁殖率低下，隨著市場需要量的增加，其野生資源由于過度采集，已接近絕跡。為了 發(fā)展這一名貴的中藥材，近年來許多廠家都采用現(xiàn)代生物技術(shù)對其進(jìn)行了快速繁殖研究， 縱觀這些研究機(jī)構(gòu)，多數(shù)以原球莖的方式進(jìn)行擴(kuò)繁，并且培養(yǎng)中多用固態(tài)或液態(tài)搖床的方 式進(jìn)行培養(yǎng)，并且培養(yǎng)的目的一般是為了生產(chǎn)鐵皮石斛種苗。 為了更好的發(fā)展這一名貴中藥材，本公司在長期的鐵皮石斛組織培養(yǎng)過程中總結(jié) 出一套適合鐵皮石斛發(fā)展潮流的培養(yǎng)技術(shù)。 本發(fā)明專利是本公司在長期的鐵皮石斛組織培養(yǎng)過程中總結(jié)出來的，在這個過程 中，首先對現(xiàn)有的鐵皮石斛種內(nèi)群體進(jìn)行了初步調(diào)查，選擇品質(zhì)好的鐵皮石斛為外植體，然 后通過多次誘導(dǎo)與培養(yǎng)形成，選擇不容易產(chǎn)生芽，但生長速度快，多糖含量高度鐵皮石斛原 球莖進(jìn)行培養(yǎng)，并對最佳培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，最后實(shí)現(xiàn)鐵皮石斛原球莖的間歇式發(fā)酵罐大規(guī) 模培養(yǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
鐵皮石斛石斛原球莖的誘導(dǎo)，本發(fā)明中所用到的培養(yǎng)物的誘導(dǎo)材料為鐵皮石斛莖 段或種子，誘導(dǎo)時(shí)采用固態(tài)培養(yǎng)基，進(jìn)行誘導(dǎo)所用的培養(yǎng)基為間歇式發(fā)酵培養(yǎng)基(4. 0 8. 0) g/L的瓊脂間歇式發(fā)酵培養(yǎng)用的培養(yǎng)基為大量減半的基本MS液體培養(yǎng)基加入0 1. 0 的生長素并加入100g/L的香蕉汁，其中蔗糖的濃度為20 40g/L ;配置好的培養(yǎng)基密封好 后，采用高壓蒸汽的方式進(jìn)行滅菌，滅菌時(shí)間為15-30min;培養(yǎng)用的反應(yīng)器為間歇式生物 反應(yīng)器，其特征為培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中不是一直浸泡在液體培養(yǎng)基中，而是浸泡與非浸泡 過程交替進(jìn)行，這種交替的實(shí)現(xiàn)是通過每天向培養(yǎng)容器中通入液體培養(yǎng)基3 24次，每次 1 10min的方式實(shí)現(xiàn)的；用于間歇式發(fā)酵培養(yǎng)的原球莖為固態(tài)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)得到的培養(yǎng) 物中生長速度快，芽點(diǎn)較大，芽數(shù)較少的鐵皮石斛原球莖；原球莖的培養(yǎng)方式為間歇式發(fā)酵 培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為23 17°C 。光照時(shí)間為6 18h/d ;每隔20 60天更換培養(yǎng)基一次；對 培養(yǎng)好的培養(yǎng)物進(jìn)行收集時(shí)直接從反應(yīng)器中倒出，收集得到的鐵皮石斛原球莖可以作為野 生或人工種植的鐵皮石斛藥材的替代品使用。
實(shí)施實(shí)例一
1.培養(yǎng)物的誘導(dǎo) 選擇近成熟但為開裂的果實(shí)采用常規(guī)方法消毒后，拋開接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行 誘導(dǎo)，用于原球莖誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為大量減半的MS培養(yǎng)基加入0. 2mg/L的NAA和100g/L的 香蕉汁，每個果實(shí)接種1瓶，45天后進(jìn)行轉(zhuǎn)接，此時(shí)使用的培養(yǎng)基為生長素濃度升高的培養(yǎng)基，即大量減半的MS培養(yǎng)基加入0. 4mg/L的NAA和100g/L的香蕉汁，以后每隔45天繼代 一次，培養(yǎng)基不變，繼代中選擇芽數(shù)比較少生長速度比較快的原球莖進(jìn)行繼代。經(jīng)過三次以 上的繼代以后，生長穩(wěn)定的原球莖即可用于間歇式發(fā)酵培養(yǎng)。
2.間歇式發(fā)酵培養(yǎng) 選擇生長速度快，芽點(diǎn)少，生長穩(wěn)定的原球莖進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)容器容積為 250ml加入培養(yǎng)物lOg，培養(yǎng)基儲存瓶溶劑為250ml，加入培養(yǎng)基的量為100ml，培養(yǎng)條件為 每光照14小時(shí)，溫度為25士rC，培養(yǎng)時(shí)間為45天，45天后即可對培養(yǎng)物進(jìn)行收集。收集 時(shí)每個反應(yīng)器可得細(xì)胞培養(yǎng)物約90g。
實(shí)施實(shí)例二
1.培養(yǎng)物的誘導(dǎo) 選擇鐵皮石斛幼嫩莖段常規(guī)方法消毒后，拋開接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)，用 于原球莖誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為大量減半的MS培養(yǎng)基加入1. Omg/L的NAA，0. 1/L的6-BA和100g/ L的香蕉汁，每個瓶接種外植體5段，45天后進(jìn)行轉(zhuǎn)接，此時(shí)使用的培養(yǎng)基為生長素濃度升 高的培養(yǎng)基，即大量減半的MS培養(yǎng)基加入2. Omg/L的NAA和100g/L的香蕉汁，以后每隔45 天繼代一次，培養(yǎng)基不變，繼代中選擇芽數(shù)比較少生長速度比較快的原球莖進(jìn)行繼代。經(jīng)過 三次以上的繼代以后，生長穩(wěn)定的原球莖即可用于間歇式發(fā)酵培養(yǎng)。
2.間歇式發(fā)酵培養(yǎng) 選擇生長速度快，芽點(diǎn)少，生長穩(wěn)定的原球莖進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)容器容積為 250ml加入培養(yǎng)物10g，培養(yǎng)基儲存瓶溶劑為250ml，加入培養(yǎng)基的量為lOOml，培養(yǎng)時(shí)間為 45天，45天后即可對培養(yǎng)物進(jìn)行收集。
權(quán)利要求
鐵皮石斛原球莖間歇式發(fā)酵培養(yǎng)研究，其特征包括培養(yǎng)基的配置，培養(yǎng)容器的選擇，培養(yǎng)基的滅菌，培養(yǎng)物的誘導(dǎo)，培養(yǎng)物的篩選，培養(yǎng)物的培養(yǎng)，培養(yǎng)物的繼代，培養(yǎng)物的收集。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的所述的鐵皮石斛原球莖的間歇式發(fā)酵培養(yǎng)研究過程主要包括以下幾個特征(1) :培養(yǎng)基的配置，所用培養(yǎng)基為大量減半的基本MS液體培養(yǎng)基加入0 1.0的生長素并加入100g/L的香蕉汁，其中蔗糖的濃度為20 40g/L ;(2) :培養(yǎng)用的反應(yīng)器為間歇式生物反應(yīng)器，其特征為培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中不是一直浸泡在液體培養(yǎng)基中，而是浸泡與非浸泡過程交替進(jìn)行，這種交替的實(shí)現(xiàn)是通過每天向培養(yǎng)容器中通入液體培養(yǎng)基3 24次，每次1 10min的方式實(shí)現(xiàn)的。(3) 配置好的培養(yǎng)基密封好后，采用高壓蒸汽的方式進(jìn)行滅菌，滅菌時(shí)間為15-30min;(4) 培養(yǎng)物的誘導(dǎo)材料為鐵皮石斛莖段或種子，誘導(dǎo)時(shí)采用固態(tài)培養(yǎng)基，進(jìn)行誘導(dǎo)所用 的培養(yǎng)基為大量減半的基本MS培養(yǎng)基加入0 1. 0的生長素，100g/L的香蕉汁，20 40g/ L的蔗糖，(4.0 8.0)g/L的瓊脂；(5) 用于間歇式發(fā)酵培養(yǎng)的原球莖為固態(tài)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)得到的培養(yǎng)物中生長速度快， 芽點(diǎn)較大，芽數(shù)較少的鐵皮石斛原球莖。(6) 原球莖的培養(yǎng)方式為間歇式發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為23 17°C。光照時(shí)間為6 18h/d ;每隔20 60天更換培養(yǎng)基一次。(7) 培養(yǎng)物的收集，培養(yǎng)好的培養(yǎng)物即可進(jìn)行收集，收集時(shí)直接從反應(yīng)器中倒出即可。(8) 收集得到的鐵皮石斛原球莖可以作為野生或人工種植的鐵皮石斛藥材的替代品使用。
全文摘要
本發(fā)明申請涉及一種中藥材的組織培養(yǎng)技術(shù)，尤其涉及中藥材鐵皮石斛組織培養(yǎng)中的中間產(chǎn)物原球莖的培養(yǎng)技術(shù)。本發(fā)明，首先對現(xiàn)有的鐵皮石斛種內(nèi)群體進(jìn)行了初步調(diào)查，選擇品質(zhì)好的鐵皮石斛為外植體，然后通過多次誘導(dǎo)與培養(yǎng)形成，選擇不容易產(chǎn)生芽，但生長速度快，多糖含量高度鐵皮石斛原球莖進(jìn)行培養(yǎng)，并對最佳培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，最后實(shí)現(xiàn)鐵皮石斛原球莖的間歇式發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)。采用該方法可以減少對鐵皮石斛的采挖，縮短鐵皮石斛的生長周期。
文檔編號C12N5/04GK101768566SQ20101010037
公開日2010年7月7日 申請日期2010年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月25日
發(fā)明者劉漢石 申請人:大連普瑞康生物技術(shù)有限公司;金銀兵