一種提高鐵皮石斛莖段繁殖系數(shù)的培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體而言，涉及一種提高鐵皮石斛莖段繁殖系數(shù)的培養(yǎng)基?！颈尘凹夹g(shù)】:
[0002]鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)，又名黑節(jié)草(《中國高等植物圖鑒》)，為蘭科石斛屬多年生附生草本植物。鐵皮石斛產(chǎn)安徽西南部、云南東南部、福建西寧、浙江東部、廣西西北部和四川。生于海拔高達(dá)1600米的山地半陰濕的巖石上。鐵皮石斛的藥用部分主要是新鮮或干燥的莖，2010版藥典中記載:鐵皮石斛具有益胃生津，滋陰清熱的功效。鐵皮石斛的藥用成分主要有多糖、生物堿、聯(lián)芐類物質(zhì)及菲類物質(zhì)等，多糖類物質(zhì)可提高人體免疫力，菲類物質(zhì)和聯(lián)芐類物質(zhì)等具有抑制多種腫瘤細(xì)胞的作用，其中多糖是目前公認(rèn)的最主要的藥效成分。
[0003]近年來人為的肆意采掘，加上鐵皮石斛自然繁殖速率很低，鐵皮石斛野生資源瀕臨滅絕。目前，人工繁殖鐵皮石斛的方法主要有分株、扦插和組培快繁。在組培時，能作為外植體的主要有種子、莖段、葉片及幼根等。其中，種子作為外植體時，所得到愈傷組織和原球莖的分生能力和質(zhì)量較好，但鐵皮石斛的接種率低，不易獲得。所以利用莖段作為外植體進(jìn)行快繁可以作為滿足市場需求的一種補(bǔ)充，故找到一種能提高鐵皮石斛莖段的繁殖系數(shù)和縮短培養(yǎng)周期的培養(yǎng)基，可更好的利用鐵皮石斛這一資源。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0004]本發(fā)明的目的是提供一種提高鐵皮石斛莖段繁殖系數(shù)的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的組成包括:基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物。
[0005]所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組分及含量為:
[0006]KNO3 75-2950mg/L, NH4NO3 103-1522mg/L,KH2PO4 18-41 Omg/L, MgSO4.7H20 240-750mg/L,CaCl2.2H20 144_462mg/L，KCl 0_68mg/L，KI 0.7-1.7mg/L，H3BO3 0.6_6.4mg/L，MnSO4.4H20 3-26mg/L,ZnSO4.7H20 1.4-8.7mg/L,Na2MoO4.2H20 0-0.3mg/L,CuSO4.5H200-0.35mg/L,CoCl2.6H20 0-0.03mg/L,Na2-EDTA 0-37mg/L,FeSO4.7H20 24_29mg/L，肌醇0-105mg/L，甘氨酸0-2.8mg/L,Vbi 0.2-12.0mg/L，VB6 0.3-1.2mg/L，煙酸0.4-1.4mg/L，6-芐基腺嘌呤1.0-3.0mg/L，萘乙酸0.05-0.5mg/L，蔗糖20_30g/L，瓊脂4.0-7.0g/L。
[0007]所述的添加物為土豆汁、香蕉汁和椰子汁的混合物，前二者的總濃度為20-300g/L，椰子汁的加入體積為l_255mL/L，混合物的比例M(土豆):M(香蕉):V(椰子汁)=5-100:2-l50:l-50o
[0008]本發(fā)明一種提高鐵皮石斛莖段繁殖系數(shù)的培養(yǎng)基定為A培養(yǎng)基，其配制為現(xiàn)有配制方法，區(qū)別是用所提取的汁液代替蒸餾水進(jìn)行配制，其中添加物的獲取方式如下:
[0009]①土豆汁獲取方法:稱取所需要克數(shù)的土豆，切成綠豆大小，放入鍋中，加入配制體積70%左右的水，煮沸30分鐘，然后用8層紗布過濾即得。
[0010]②香蕉汁獲取方法:稱取所需要克數(shù)的香蕉，把香蕉壓成糊狀，放入鍋中，加入配制體積70%左右的水，煮沸30分鐘，然后用2層紗布過濾即得。
[0011 ]③椰子汁獲取方法:直接從椰子中量取所需體積。
[0012]本發(fā)明的有益之處:采用此培養(yǎng)基能提高鐵皮石斛莖段繁殖系數(shù)，并且縮短繼代周期，可為緩解鐵皮石斛的供需矛盾和保護(hù)鐵皮石斛野生資源提供一條思路。
【具體實施方式】
[0013]實施例1
[0014]取野生鐵皮石斛莖段，用0.1%洗衣粉溶液浸泡5分鐘，流水沖I小時，于無菌超凈工作臺上用75%酒精消毒30秒，無菌水洗3次，再于0.10%氯化汞中消毒8分鐘，無菌水洗6次，用解剖刀將已消毒后的莖段切成每個腋芽一段，接種于MS培養(yǎng)基中，另含6-BA 1.0mg/L，NAA 0.2mg/L，20天后待腋芽伸長，莖段恢復(fù)生長后，接種于A培養(yǎng)基中生長，A培養(yǎng)基的組成為:
[0015]KNO3 75mg/L,NH4NO3 103mg/L,KH2PO4 18mg/L,MgS04.7H20 240mg/L，CaCl2.2H20144mg/L，KCl lmg/L，KI 0.7mg/L,H3BO3 0.6mg/L,MnSO4.4H20 3mg/L,ZnSO4.7H20 1.4mg/L,Na2MoO4.2H20 0.lmg/L,CuSO4.5H20 0.15mg/L，CoCl2.6H2O 0.01mg/L，Na2-EDTA 1mg/L,FeSO4.7H20 24mg/L，肌醇 12mg/L，甘氨酸 1.2mg/L，VB1 0.2mg/L，VB6 0.3mg/L，煙酸
0.4mg/L，6-芐基腺嘌呤1.01^/1，萘乙酸0.0511^/1，鹿糖2(^/1，瓊脂4.(^/1。所加土豆和香蕉提取混合物總濃度為2(^/1，添加物比例1(土豆):1(香蕉)1(椰子汁)=5:2:1。培養(yǎng)溫度25±1°C，每天光照12小時，光照強(qiáng)度1000-30001ux，培養(yǎng)周期為50天。50天后統(tǒng)計鐵皮石斛叢生芽情況，增殖系數(shù)達(dá)到6-9，較未加入添加物的培養(yǎng)基提高了 3-5倍。
[0016]實施例2
[0017]取野生鐵皮石斛莖段，用0.1 %洗衣粉溶液浸泡5分鐘，流水沖I小時，于無菌超凈工作臺上用75%酒精消毒30秒，無菌水洗3次，再于0.10%氯化汞中消毒8分鐘，無菌水洗6次，用解剖刀將已消毒后的莖段切成每個腋芽一段，接種于MS培養(yǎng)基中，另含6-BA 1.0mg/L，NAA 0.2mg/L，20天后待腋芽伸長，莖段恢復(fù)生長后，接種于A培養(yǎng)基中生長，A培養(yǎng)基的組成為:
[0018]KNO3 80mg/L,NH4NO3 113mg/L，KH2P04 19mg/L,MgS04.7H20 250mg/L，CaCl2.2H20154mg/L，KCl 23mg/L，KI 0.9mg/L,H3BO3 0.76mg/L,MnSO4.4H20 5mg/L,ZnSO4.7H201.6mg/L, Na2MoO4.2H20 0.lmg/L, CuSO4.5H20 0.25mg/L, CoCl2.6H2O 0.01mg/L,Na2-EDTA12mg/L，F(xiàn)eS04.7H2O 25mg/L，肌醇 15mg/L，甘氨酸1.4mg/L，VBi 0.3mg/L，VB6 0.4mg/L，煙酸0.511^/1，6-芐基腺嘌呤1.21^/1，萘乙酸0.151^/1，蔗糖258/1，瓊脂4.(^/1。所加土豆和香蕉提取混合物總濃度為5(^/1，添加物比例姒土豆):1(香蕉):￥(椰子汁)=15:42:19。培養(yǎng)溫度25±1°C，每天光照12小時，光照強(qiáng)度1000-30001ux，培養(yǎng)周期為50天。50天后統(tǒng)計鐵皮石斛叢生芽情況，增殖系數(shù)達(dá)到6-9，較未加入添加物的培養(yǎng)基提高了 3-5倍。
[0019]實施例3
[0020]取野生鐵皮石斛莖段，用0.1 %洗衣粉溶液浸泡5分鐘，流水沖I小時，于無菌超凈工作臺上用75%酒精消毒30秒，無菌水洗3次，再于0.10%氯化汞中消毒8分鐘，無菌水洗6次，用解剖刀將已消毒后的莖段切成每個腋芽一段，接種于MS培養(yǎng)基中，另含6-BA 1.0mg/L，NAA 0.2mg/L，20天后待腋芽伸長，莖段恢復(fù)生長后，接種于A培養(yǎng)基中生長，A培養(yǎng)基的組成為:
[0021]KNO3 1000mg/L,NH4NO3 1113mg/L，KH2P04 190mg/L,MgS04.7H20 550mg/L，CaCl2.2H20 254mg/L，KCl 43mg/L，KI 0.9mg/L，H3B03 3.6mg/L,MnS04.4H20 25mg/L,ZnSO4.7H208.6mg/L,Na2MoO4.2H20 0.3mg/L,CuS04.5H20 0.25mg/L，CoCl2.6H2O 0.03mg/L，Na2-EDTA32mg/L，F(xiàn)eS04.7H2O 26mg/L，肌醇95mg/L，甘氨酸2.4mg/L，VBi 10mg/L，VB6 0.9mg/L，煙酸0.711^/1，6-芐基腺嘌呤1.81^/1，萘乙酸0.251^/1，鹿糖258/1，瓊脂5.(^/1。所加土豆和香蕉提取混合物總濃度為10(^/1，添加物比例1(土豆):1(香蕉):￥(椰子汁)=25:65:34。培養(yǎng)溫度25±1°C，每天光照12小時，光照強(qiáng)度1000-30001ux，培養(yǎng)周期為50天。50天后統(tǒng)計鐵皮石斛叢生芽情況，增殖系數(shù)達(dá)到6-9，較未加入添加物的培養(yǎng)基提高了 3-5倍。
[0022]實施例4
[0023]取野生鐵皮石斛莖段，用0.1 %洗衣粉溶液浸泡5分鐘，流水沖I小時，于無菌超凈工作臺上用75%酒精消毒30秒，無菌水洗3次，再于0.10%氯化汞中消毒8分鐘，無菌水洗6次，用解剖刀將已消毒后的莖段切成每個腋芽一段，接種于MS培養(yǎng)基中，另含6-BA 1.0mg/L，NAA 0.2mg/L，20天后待腋芽伸長，莖段恢復(fù)生長后，接種于A培養(yǎng)基中生長，A培養(yǎng)基的組成為:
[0024]KNO3 2300mg/L,NH4NO3 1513mg/L，KH2P04 290mg/L,MgSO4.7H20 600mg/L，CaCl2.2H20 354mg/L，KCl 53mg/L，KI I.2mg/L，H3B03 4.6mg/L,MnS04.4H20 20mg/L,ZnSO4.7H207.6mg/L,Na2MoO4.2H20 0.2mg/L,CuSO4.5H20 0.35mg/L,CoCl2.6H2O 0.03mg/L，Na2-EDTA35mg/L，F(xiàn)eSCU.7H2O 28mg/L，肌醇 105mg/L，甘氨酸2.5mg/L，VBi llmg/L，VB6 0.7mg/L，煙酸
0.9mg/L，6-芐基腺嘌呤2.4mg/L，萘乙酸0.35mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂6.0g/L。所加土豆和香蕉提取混合物總濃度為200g/L，添加物比例M(土豆):M(香蕉):V(椰子汁)= 78:43: 5。培養(yǎng)溫度25±1