專利名稱：借助于千兆赫或兆兆赫頻譜分析進(jìn)行實(shí)時(shí)pcr的制作方法
借助于千兆赫或兆兆赫頻譜分析進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR本發(fā)明涉及在PCR擴(kuò)增中對核酸分子，特別是多核苷酸序列進(jìn)行頻譜分析實(shí)時(shí)檢測用的方法，以及相應(yīng)的PCR裝置(PCR =聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。通常，這樣的方法以及PCR裝置用于特定基因序列的表達(dá)的定量分析。一般地說， PCR擴(kuò)增在DNS或RNS序列的復(fù)制和研究中，正如它們在許多生物學(xué)系統(tǒng)中那樣被頻繁地應(yīng)用，然而在原則上還可以用于人工制造的多核苷酸序列。在此描述的方法涉及PCR-擴(kuò)增中的頻譜分析實(shí)時(shí)檢測。借此不僅涉及PCR擴(kuò)增所有反應(yīng)步驟進(jìn)行期間的檢測，而且涉及此前和此后的有目的的檢測。因此例如，這可以在實(shí)施多核苷酸序列復(fù)制的實(shí)際PCR反應(yīng)步驟之前的開始步驟中借助于頻譜分析檢測，對所采用的物質(zhì)進(jìn)行定性的以及定量的研究。此外，還可以在PCR擴(kuò)增期間以及甚至在PCR擴(kuò)增已經(jīng)結(jié)束時(shí)進(jìn)行頻譜研究步驟。一般地，PCR擴(kuò)增用于與人類基因組比較相對較短的并在其構(gòu)建上清晰定義的多核苷酸序列的復(fù)制。與活的生物體相反，PCR擴(kuò)增只保證每個(gè)序列幾千堿基對的多核苷酸序列的復(fù)制。為了進(jìn)行PCR擴(kuò)增首先要求制備PCR溶液，它除了緩沖溶液作為適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)環(huán)境以外，還要具有進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需要的若干其它起始物質(zhì)。這些起始物質(zhì)一般包括原來的待復(fù)制的多核苷酸序列、確定待復(fù)制的多核苷酸序列的起始段及末段用的引物、相應(yīng)的聚合酶，以便通過該引物來復(fù)制確定的段，以及作為所復(fù)制的多核苷酸序列的構(gòu)件的脫氧核苷三磷酸。除了這些起始物質(zhì)以外，PCR溶液還可以含有若干其它功能組分，它們也許在效率方面允許提高或優(yōu)化PCR擴(kuò)增的進(jìn)程。PCR擴(kuò)增由重復(fù)地進(jìn)行的PCR反應(yīng)步驟組成，正如它們可以大致在實(shí)驗(yàn)室常見的熱循環(huán)儀中進(jìn)行的。在此，每次重復(fù)都包括變性、引物雜交和延伸三個(gè)PCR反應(yīng)步驟。變性時(shí)，首先為了解除將兩個(gè)單鏈多核苷酸序列結(jié)合在一起的氫鍵，在加熱PCR溶液至約95°C 的溫度的情況下使雙鏈多核苷酸序列解鏈。該溫度水平一致保持到保證在PCR溶液中只存在單鏈多核苷酸序列為止。在引物雜交的PCR反應(yīng)步驟中，溫度一般在一個(gè)水平上維持幾秒，以允許引物特異性附著在多核苷酸序列上。在此，所述溫度水平一般處于在通過特異性附著而產(chǎn)生的引物序列的解鏈點(diǎn)以下幾度(°C)，并通常相應(yīng)于55°C至65°C之間的溫度。 若引物在多核苷酸序列預(yù)先確定的位點(diǎn)上的附著結(jié)束，則在延伸的PCR反應(yīng)步驟中在聚合酶的作用下通過所缺的鏈或基件在自由的核苷酸上填充進(jìn)行。在此，引物形成逐段復(fù)制的新單鏈的起點(diǎn)。在PCR反應(yīng)步驟期間，所調(diào)整的溫度取決于各自使用的聚合酶的工作最優(yōu)值，然而一般處于引物雜交溫度水平以上約10°C至15°C。延伸的PCR反應(yīng)步驟結(jié)束之后， 重復(fù)該反應(yīng)順序，所要求的多核苷酸序列在最優(yōu)反應(yīng)情況下呈指數(shù)繁殖，因?yàn)樵诿肯乱粋€(gè)反應(yīng)步驟中之前合成的多核苷酸序列都可以用作下一次鏈合成的模板。在實(shí)時(shí)定量PCR中，先有技術(shù)已知的PCR擴(kuò)增的進(jìn)一步發(fā)展，復(fù)制多核苷酸序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并同時(shí)提供對這樣取得的多核苷酸序列進(jìn)行量化的可能性。在此，該量化以實(shí)施在PCR擴(kuò)增期間進(jìn)行的熒光測量為依據(jù)。在此，所檢測的熒光信號與所復(fù)制的多核苷酸序列數(shù)量成正比。與此相應(yīng)地，與大多數(shù)只能在PCR擴(kuò)增之后應(yīng)用的傳統(tǒng)的定量檢測方法相反，實(shí)時(shí)定量的PCR允許在PCR擴(kuò)增中復(fù)制的多核苷酸序列尚在其復(fù)制期間就進(jìn)行定量數(shù)據(jù)處理。在此應(yīng)該指出，在此和在下文中，定量檢測應(yīng)理解為在量化的意義上與實(shí)時(shí)定量 PCR相結(jié)合。這可以基于不同的已知的量化模型。在一種簡單的情況下，大致可以利用這樣的事實(shí)，即在所采用的復(fù)制的多核苷酸序列數(shù)量的對數(shù)和CT(閾值周期="Threshold Cycle”，即檢測到的熒光第一次顯著地高于背景熒光的時(shí)刻)之間存在線性的反比關(guān)系。 若首先大致已知所采用的數(shù)量，則可以產(chǎn)生一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，多核苷酸序列的每個(gè)未知數(shù)量與其斜率進(jìn)行比較，便能進(jìn)行定量。另一方面，若原始量未知，則可以通過測定CT反推原始量。其他計(jì)算方法是專業(yè)人員已知的。在此，實(shí)時(shí)定量PCR要求熒光顏料或者所謂熒光標(biāo)記，它在化學(xué)或在物理上與所復(fù)制的多核苷酸序列出現(xiàn)相互作用，并因此改變本身的熒光行為。與此相應(yīng)地，在重復(fù)PCR 反應(yīng)步驟之后用所復(fù)制的多核苷酸序列的相應(yīng)增長校準(zhǔn)所檢測的熒光信號的強(qiáng)度增長。通過實(shí)測的熒光信號對PCR擴(kuò)增變化過程的檢測，例如可以依靠對所復(fù)制的多核苷酸序列相對非特異的簡單熒光顏料的應(yīng)用。這樣的熒光顏料大致為SybrGreen，它是一種不對稱的花菁染料顏料分子，而且與待復(fù)制的DNA分子形成一種DNA-熒光顏料復(fù)合物，在波長λ max = 494nm時(shí)吸收藍(lán)光，在波長為λ max = 521nm時(shí)發(fā)射綠光。另一種經(jīng)常使用的熒光顏料是溴化乙錠。作為這些熒光顏料的補(bǔ)充還加入熒光標(biāo)記，諸如FRET-SonderuLightcycler-Sonden
TaqMan-Sonden . 、Molecular—beacons、Scorpionprimer 5 Luxprimer ，它H雖然允許在多核苷酸序列各個(gè)位點(diǎn)上特異性結(jié)合，并因而具有狹義的熒光性能，但價(jià)格比較昂貴。所以這樣的熒光標(biāo)記不像熒光顏料那樣典型地被廣泛的應(yīng)用。此外，分子信號燈 (Molecular-beacons)呈現(xiàn)相對復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，需要額外地優(yōu)化的并由此比較昂貴的引物來實(shí)行PCR擴(kuò)增。此外，這類復(fù)雜的結(jié)構(gòu)妨礙PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化調(diào)整，并導(dǎo)致效率相對較低的多核苷酸序列復(fù)制，而且出現(xiàn)許多不希望有的副產(chǎn)物。為了避免以熒光信號檢測為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)定量PCR出現(xiàn)這種缺點(diǎn)，由現(xiàn)有技術(shù)已知的TO 03/102238 A2建議一種檢測PCR溶液中連續(xù)核酸分子的方法以及進(jìn)行該方法的裝置。該方法包括在一個(gè)小室(Kammer)中提供PCR起始物質(zhì)，并重復(fù)執(zhí)行變性、引物雜交和延伸的PCR反應(yīng)步驟。在實(shí)施這種PCR反應(yīng)步驟期間，通過用紫外光照射PCR溶液和隨后進(jìn)行的所吸收的光強(qiáng)度檢測，使連續(xù)核酸分子顯現(xiàn)(Darstellimg)。在此，PCR溶液由一個(gè)適宜于執(zhí)行PCR擴(kuò)增的小室收納，其中用來自UV光源的光能照射。盡管在WO 03/102238 A2中描述的方法可以不必采用熒光標(biāo)記，但是該方法在 PCR溶液各組分方面或者在從在前的分離反應(yīng)的反應(yīng)步驟產(chǎn)生留下的殘留物例如苯酚方面非常易受干擾。借助于紫外吸收的定量測定的另一個(gè)缺點(diǎn)是，單鏈與雙鏈核酸分子的差別有限，并因此僅提供用于多核苷酸序列的高度非特異檢測可能性。WO 2008/109706 Al描述了各種類型的兆兆赫光譜學(xué)的應(yīng)用。其中描述了雙鏈和單鏈DNA的檢測。在該出版物中完全沒有描述PCR產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測方法。WO 2006/064192 Al描述了一種兆兆赫范圍的帶狀濾光片。該出版物沒有描述在檢測核酸分子方面的方法。US 2006/0216742描述了應(yīng)用千兆赫或兆兆赫輻射檢測生物分子結(jié)合事件的方法和系統(tǒng)。WO 03/100396 Al公開了一種檢測配體對生物探針的特異性的方法。
DE 100 54 476 Al描述了一種檢測多核苷酸序列用的方法，其中通過與入射電磁輻射的相互作用，測定與測試介質(zhì)接觸的探針的折射率或一個(gè)等效的量。WO 2004/024949 A2描述了一種應(yīng)用頻譜數(shù)據(jù)迅速檢測突變和核苷酸多態(tài)現(xiàn)象。US 2006/0216742 Al提出一種檢測兩個(gè)分子之間生物分子結(jié)合的存在的專用方法，它涉及檢測方法以及相應(yīng)的裝置。按照該公開文獻(xiàn)，通過兆兆赫輻射檢測兩個(gè)分子生物分子結(jié)合的存在，其中從輻射源發(fā)射兆兆赫輻射，并在透射包括該分子的探針之后用檢測器檢測。在此，所公開的方法不能對所采用的分子數(shù)量進(jìn)行量化，所以不適宜用來對PCR擴(kuò)增進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測。據(jù)此，任務(wù)是，提出一種在PCR擴(kuò)增中實(shí)時(shí)檢測多核苷酸序列的無標(biāo)記方法，它使多核苷酸序列特定的和定量的檢測，特別是使區(qū)分單鏈和雙鏈多核苷酸序列成為可能，而且在很大程度上不受溶液純度或質(zhì)量的影響。該任務(wù)用按照專利權(quán)利要求1和15的方法以及按照專利權(quán)利要求14的PCR裝置解決。具體地說，該任務(wù)通過一種在PCR擴(kuò)增中對核酸分子，特別是對多核苷酸序列進(jìn)行定量頻譜分析實(shí)時(shí)檢測用的方法，其中PCR擴(kuò)增包括提供在緩沖溶液中的對于制備PCR 溶液所必需的起始物質(zhì)以及重復(fù)進(jìn)行變性、引物雜交和延伸的PCR反應(yīng)步驟，并且其中在 PCR擴(kuò)增期間在確定的時(shí)刻用來自輻射源的在千兆赫或兆兆赫范圍內(nèi)的電磁輻射照射PCR 溶液，以便借助于檢測器在定量實(shí)時(shí)檢測中至少檢測多核苷酸序列是否存在。此外，該任務(wù)通過一種在PCR擴(kuò)增中對核酸分子，特別是對多核苷酸序列進(jìn)行定量頻譜分析實(shí)時(shí)檢測用的方法解決，其中該P(yáng)CR擴(kuò)增包括提供在緩沖溶液中的對于制備 PCR溶液所必需的起始物質(zhì)以及重復(fù)進(jìn)行變性、引物雜交和延伸的PCR反應(yīng)步驟，并且其中在PCR擴(kuò)增期間在確定的時(shí)刻用來自輻射源的在千兆赫或兆兆赫范圍內(nèi)的電磁輻射照射 PCR溶液，以便借助于檢測器在實(shí)時(shí)檢測中至少檢測多核苷酸序列是否存在，而且其中變性反應(yīng)步驟通過來自輻射源的兆兆赫輻射進(jìn)行。此外，該任務(wù)還通過在PCR擴(kuò)增中對多核苷酸序列進(jìn)行定量頻譜分析實(shí)時(shí)檢測用的PCR裝置解決，其中它包括具有由所必需的起始物質(zhì)和緩沖溶液組成的PCR溶液的接收區(qū)域的基片；溫度改變裝置，借此可以把PCR溶液加熱和/或冷卻至預(yù)先給定的溫度，以便使變性、引物雜交或延伸的PCR反應(yīng)步驟的重復(fù)成為可能；輻射源，用以千兆赫或兆兆赫范圍的電磁輻射照射PCR溶液；和檢測器，用以對透射PCR溶液的輻射進(jìn)行定量頻譜分析檢測。本方法以及按照本發(fā)明的PCR裝置的核心思想在于，PCR擴(kuò)增以及頻譜分析實(shí)時(shí)檢測以電磁頻譜的千兆赫或兆兆赫范圍實(shí)施。一般地，在這個(gè)頻率范圍內(nèi)所使用的輻射處于IOOGHz (千兆赫)和20THz (兆兆赫)之間，特別是在300GHz和IOTHz之間。這個(gè)照射頻率適宜于激勵(lì)單鏈和雙鏈多核苷酸序列的特定激活狀態(tài)(一般地，采用振蕩的 (vibratorische)振動(dòng)模式)。這種多核苷酸序列的各功能基團(tuán)的激活狀態(tài)就此用預(yù)先確定的電磁輻射頻率校準(zhǔn)并可以在消光測量中檢測。下文中消光測量一般地指所有頻譜分析檢測，包括定量檢測，它把照射PCR溶液的光強(qiáng)度的部分與從其中射出并用檢測器檢測的光強(qiáng)度部分聯(lián)系起來，以便允許推斷PCR溶液中所檢測的物質(zhì)和結(jié)構(gòu)。此外，該激勵(lì)模式(激活頻率)對這些功能基團(tuán)的化學(xué)結(jié)合狀態(tài)是特征性的，而且可以因結(jié)合狀態(tài)的改變伴隨電磁激活頻率的改變。激勵(lì)模式檢測尤其允許表明，它的出現(xiàn)表明在一個(gè)雙鏈多核苷酸序列中兩個(gè)單鏈多核苷酸序列之間氫鍵的存在。此外，與此相應(yīng)地，可以通過在上述這個(gè)頻率范圍內(nèi)的消光測量獲得結(jié)論，在PCR溶液中是否存在單鏈或者雙鏈多核苷酸序列混合物。PCR溶液中借助于頻譜分析消光測量檢測多核苷酸序列的預(yù)先確定的激活狀態(tài)， 與至今借助于熒光測量的傳統(tǒng)檢測方法相比，完全不要求給PCR溶液添加熒光標(biāo)記。以此一方面使制備PCR溶液的復(fù)雜性降低，而且成本較低。另一方面，可以省去有時(shí)對于PCR溶液有害的紫外線的采用。正是通過紫外光，電子激勵(lì)作用在生物學(xué)大分子上，通過紫外光照射有時(shí)引發(fā)的化學(xué)副反應(yīng)而產(chǎn)生的可能的誤差來源是非常成問題的。然而，千兆赫以及兆兆赫范圍的電磁輻射一般只會引起振蕩激勵(lì)，并且因此實(shí)際上幾乎不干擾PCR溶液中的化學(xué)反應(yīng)環(huán)境。此外，千兆赫和兆兆赫輻射的照射頻率適宜于檢測連接在一起的核酸分子或多核苷酸序列的雜交狀態(tài)。所以，與借助于紫外范圍的熒光測量的實(shí)時(shí)定量PCR方法不同，與按照本發(fā)明的方法相應(yīng)的檢測可以檢測各種雜交狀態(tài)的存在，特別是單鏈和雙鏈多核苷酸序列的存在。這對于PCR擴(kuò)增的進(jìn)行有時(shí)是決定性的，定量檢測還允許對在PCR溶液出現(xiàn)的反應(yīng)步驟的進(jìn)展以及質(zhì)量作出結(jié)論，并以此一般地提高PCR擴(kuò)增的效率。此外，按照本發(fā)明的方法的另一個(gè)核心思想還在于，頻譜分析實(shí)時(shí)檢測所采用的輻射源還可以用來在PCR擴(kuò)增中通過電磁輻射導(dǎo)致變性反應(yīng)步驟。所照射的頻率范圍完全適于把雙鏈多核苷酸序列中兩個(gè)單鏈之間的氫鍵解開，而不須給PCR溶液的整個(gè)系統(tǒng)直接添加熱能。所以，在變性反應(yīng)步驟中不需要為了多核苷酸序列的各鏈之間化學(xué)鍵的解開而使PCR溶液升溫。該輻射源以千兆赫以及兆兆赫范圍通過預(yù)先確定的頻率的電磁輻射照射PCR溶液，更多的是使雙鏈多核苷酸序列解鏈而無需PCR溶液本身經(jīng)歷劇烈的溫度變化。 因此，這種方法縮短了重復(fù)PCR反應(yīng)步驟所必要的PCR溶液的加熱和冷卻階段，并使時(shí)間上較快地出現(xiàn)待復(fù)制的多核苷酸序列的所希望量成為可能。在按照本發(fā)明的方法的第一實(shí)施例中規(guī)定，在緩沖溶液中制備PCR溶液所必需的起始物質(zhì)不包括化學(xué)的或物理的檢測標(biāo)記，特別是不包括熒光標(biāo)記。在此，標(biāo)記是指制備上述PCR溶液作為非必需的起始物質(zhì)加入的物質(zhì)，以便在一個(gè)先有技術(shù)已知的測量方法中可以檢測多核苷酸序列的出現(xiàn)。所以，為按照該實(shí)施例的方法制備的PCR溶液，可以只限于所必需的起始物質(zhì)，正如它們對于通常無實(shí)時(shí)檢測的PCR擴(kuò)增所必需的。一方面，以此減小對 PCR擴(kuò)增方法中化學(xué)以及物理性質(zhì)可能的干狀影響，而同時(shí)提高反應(yīng)條件的可控性。在另一個(gè)實(shí)施例中可以規(guī)定，所照射千兆赫或者兆兆赫范圍的電磁輻射的強(qiáng)度這樣選定，使得它們穿透PCR溶液預(yù)先確定的層厚。在此，所述層厚可以涉及所照射的電磁輻射透射的整個(gè)樣品橫截面，或者只涉及樣品橫截面的部分區(qū)域。所述層厚適于在以預(yù)先給定的輻射強(qiáng)度照射時(shí)和在多核苷酸序列以一個(gè)超過確定的監(jiān)測閾值的數(shù)量存在時(shí)，檢測出消光信號。從電磁輻射強(qiáng)度減弱引起的該消光信號，大致可能是吸收、散射、衍射以及反射造成的。若透射的層厚恒定，而且所照射的電磁輻射的強(qiáng)度不變，則在多核苷酸序列的消光截面積已知的情況下，可以反推所出現(xiàn)的多核苷酸序列數(shù)量。在該方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，在千兆赫或者兆兆赫范圍內(nèi)照射的電磁輻射的頻率在IOOGHz和20THz之間，特別是在300GHz和IOTHz之間。這個(gè)頻率范圍覆蓋大多數(shù)多核苷酸序列的頻譜分析易于檢測的激活頻率，并因此，允許對激活振動(dòng)進(jìn)行頻譜檢測，特別是定量頻譜檢測。在本發(fā)明另一個(gè)有利的實(shí)施例中規(guī)定，PCR溶液的緩沖溶液在千兆赫或兆兆赫范圍內(nèi)照射的電磁輻射的頻率方面這樣選定，使得在透射PCR溶液的預(yù)先確定的層厚之后用檢測器可以在很大程度上不衰減地檢測出照射強(qiáng)度。因此，該緩沖溶液本身在所采用的電磁照射頻率方面這樣選定，使得預(yù)先確定的頻率范圍的所照射的電磁輻射經(jīng)歷盡可能大的透射。若保證這個(gè)頻率范圍與多核苷酸序列所檢測的激活狀態(tài)重疊，則與PCR溶液相互作用之后電磁輻射強(qiáng)度的降低并非因?yàn)榫彌_溶液本身的消光特性，而只是因?yàn)槠鹗嘉镔|(zhì)以及所出現(xiàn)的分子的消光特性。此外，若能進(jìn)一步排除PCR擴(kuò)增副產(chǎn)物的消光，則多核苷酸序列激活狀態(tài)區(qū)域中電磁輻射強(qiáng)度的減弱，在很大程度上只是因?yàn)殡姶泡椛渑c多核苷酸序列的相互作用。因此，提高了有用信號和不希望有的電磁輻射減弱的比率，還改善了定量頻譜分析實(shí)時(shí)檢測的質(zhì)量。在本方法另一個(gè)實(shí)施例中，其特征在于，PCR溶液涂抹在基片上，特別是涂抹在對于所照射千兆赫或兆兆赫范圍的電磁輻射在很大程度上透明的基片預(yù)先確定的接收區(qū)域上。這樣一個(gè)接收區(qū)域可以通過有限的容積形成，但或者還可以只把PCR溶液涂抹成平面。 該基片本身可以是礦物基片，例如玻璃，但或者還可以是塑料基片。若該基片本身對于所照射的電磁輻射在很大程度上是透明的，則它只在用頻譜分析實(shí)時(shí)檢測方法所檢測到的消光信號上引起一個(gè)很小的比例。若PCR溶液的緩沖溶液本身在所照射的電磁輻射的頻率范圍內(nèi)同樣不引起或只有引起小的輻射強(qiáng)度減弱，則所檢測到的消光度在很大程度上以電磁輻射和PCR溶液，或其中所包含的材料的相互作用為依據(jù)。此外，該基片若為塑料，則可以通過選擇適當(dāng)?shù)乃芰?，適應(yīng)所照射的電磁輻射的有用頻率范圍，以便導(dǎo)致盡可能小的輻射強(qiáng)度減弱。在本方法的另一個(gè)實(shí)施例中，該基片至少包括一個(gè)千兆赫或者兆兆赫范圍內(nèi)電磁輻射用的波導(dǎo)管。這種波導(dǎo)管一方面可以用作射線引導(dǎo)介質(zhì)，同時(shí)還用作帶有PCR溶液可能的接收區(qū)域的基片。與此相應(yīng)地，可以以良好的可控性用電磁輻射局部照射PCR溶液。此外，像一般在準(zhǔn)直和聚焦方法的情況那樣，可以縮小散射或損失輻射，并改善頻譜分析實(shí)時(shí)檢測。如果預(yù)先確定的PCR溶液接收區(qū)域處于這樣的范圍內(nèi)，其穿過射波導(dǎo)管衰逝的(evaneszenten)輻射場，則應(yīng)用波導(dǎo)管特別有利。所以，多核苷酸序列的檢測用這樣的電磁輻射進(jìn)行，使之一方面受波導(dǎo)管引導(dǎo)，而另一方面與波導(dǎo)管外表面的區(qū)域通信 (kommuniziert)。此外，在頻譜分析實(shí)時(shí)檢測方法的另一個(gè)實(shí)施例中還設(shè)置溫度改變裝置，可以借此把PCR溶液加熱和/或冷卻到預(yù)先給定的溫度。這樣的溫度改變裝置可以直接或間接地加熱或冷卻PCR溶液。例如，直接升溫可以基于直接輻射加熱或電阻加熱。冷卻可以通過適當(dāng)安置的珀耳帖元件或冷卻介質(zhì)，例如空氣進(jìn)行，后者與熱交換器連接。在此，溫度改變裝置保證使盡可能快速和準(zhǔn)確地更換各PCR反應(yīng)步驟所需要的溫度成為可能。在該方法的另一個(gè)實(shí)施例中規(guī)定，所述溫度改變裝置加熱和/或冷卻熱介質(zhì)，該熱介質(zhì)通過基片間接加熱和/或冷卻PCR溶液。另外要考慮的是，基片本身的熱容量要小， 而導(dǎo)熱性盡可能大。按照實(shí)施例，該熱介質(zhì)可以平面地相互作用，但或者也可以穿過為其規(guī)定的傳輸介質(zhì)，例如，溝道。借助于基片的加熱或冷卻，在PCR溶液與基片適當(dāng)?shù)慕佑|下，相應(yīng)地改變PCR溶液的溫度。故可以保證進(jìn)行PCR反應(yīng)步驟所需要的溫度條件。
在本方法一個(gè)有利的實(shí)施例中規(guī)定，來自輻射源的在千兆赫或兆兆赫范圍內(nèi)的電磁輻射，在變性和/或引物雜交和/或延伸步驟之前和/或之后照射PCR溶液。與此相應(yīng)地，在每次PCR擴(kuò)增中出現(xiàn)的反應(yīng)步驟之后借助于頻譜分析檢測初始條件以及反應(yīng)結(jié)果。 若檢測證實(shí)，后續(xù)的PCR反應(yīng)步驟的初始前提條件不利，則可以相應(yīng)地改變反應(yīng)條件，例如為改善結(jié)果而進(jìn)行的溫度選擇。在一個(gè)替代的配置中，還可以在PCR擴(kuò)增期間出現(xiàn)的變性、 引物雜交或延伸的反應(yīng)步驟中照射千兆赫或兆兆赫范圍的電磁輻射，例如，以便得到在時(shí)間上各個(gè)分子構(gòu)件的結(jié)合特性的推斷。在該方法一個(gè)特別有利的實(shí)施例中，選定電磁輻射頻率，以便激勵(lì)單鏈和/或雙鏈多核苷酸序列所定義的振蕩激勵(lì)模式，以便檢測該模式，特別是檢測表征雙鏈多核苷酸序列雜交狀態(tài)的存在的模式。故可以在PCR擴(kuò)增期間檢測多核苷酸序列特定的分子結(jié)構(gòu)的存在，借此可以測試和檢測PCR擴(kuò)增的進(jìn)行質(zhì)量。此外，還可以在檢測多核苷酸序列之后中斷PCR擴(kuò)增。特別是還可以通過對確定激勵(lì)模式激活頻率偏移的檢測，獲取多核苷酸序列結(jié)構(gòu)，特別是其雜交狀態(tài)的結(jié)論。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，考慮在檢測分析中在PCR擴(kuò)增期間將借助于在千兆赫或兆兆赫范圍內(nèi)的電磁輻射進(jìn)行的在前時(shí)間進(jìn)行的檢測面作為在后時(shí)間進(jìn)行的檢測的背景。在前時(shí)間進(jìn)行的檢測可以用于在消光測量中或者以直接地、經(jīng)過平均地或者以經(jīng)過濾的方式從在后的檢測中去除的絕對必要的背景減除。因此，這對于獲得定量結(jié)果所必要的背景減除步驟由此不再要求預(yù)知PCR裝置具體的消光特性，而是允許以時(shí)間接近的方式獲得一種良好的背景測定。在多核苷酸序列頻譜分析實(shí)時(shí)檢測方法的另一個(gè)實(shí)施例中，來自輻射源的千兆赫或者兆兆赫范圍內(nèi)的電磁輻射，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增之前照射PCR擴(kuò)增用的起始物質(zhì)的溶液， 以便借助于頻譜分析檢測確定各起始物質(zhì)的化學(xué)或物理特性，特別是其質(zhì)量、特異性及其結(jié)合特性。在此說明，一般在進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR之前，由于成本的原因，大部分PCR擴(kuò)增用戶都在采用熒光測量沒有進(jìn)行頻譜分析實(shí)時(shí)檢測可能性的PCR裝置中，檢測質(zhì)量或特異性及其結(jié)合特性(多核苷酸序列的質(zhì)量、引物結(jié)合、引物特異性、擴(kuò)增數(shù)量)。所以按照實(shí)施例方法的執(zhí)行，可以取消這個(gè)單獨(dú)的檢測，而借助于按照本發(fā)明的PCR裝置直接測定各起始物質(zhì)的物理和化學(xué)特性。此外，在PCR擴(kuò)增中一般使用的引物是針對在不帶頻譜分析實(shí)時(shí)檢測的常規(guī)PCR裝置中的應(yīng)用設(shè)計(jì)的，因而在帶有頻譜分析實(shí)時(shí)檢測的PCR裝置中的應(yīng)用中，由于熒光標(biāo)記的使用，需要再次優(yōu)化對于含有引物帶有熒光標(biāo)記的PCR溶液的反應(yīng)條件。這個(gè)再次優(yōu)化主要由于如下原因是必要的，因?yàn)閾饺霟晒鈽?biāo)記影響多核苷酸序列的解鏈點(diǎn)，并因此影響引物結(jié)合。因?yàn)槟苁孪仍赑CR裝置中測定引物結(jié)合或引物的特異性，其中在較晚的時(shí)刻還用千兆赫或者兆兆赫輻射進(jìn)行多核苷酸序列的頻譜分析實(shí)時(shí)檢測，故取消成本過高的優(yōu)化工作。此外，還要指出，在UV范圍的熒光測量中所采用的反應(yīng)容器由于污染，正如例如， 指紋，很容易引起錯(cuò)誤的測量，并因此有時(shí)可能得出錯(cuò)誤的吸收值。千兆赫或者兆兆赫范圍的電磁輻射由于波長較大，針對反應(yīng)容器以及還有緩沖液組分的這種污染物很不敏感。此外，本方法相應(yīng)地省去對于頻譜分析檢測可能成為誤差來源的劣質(zhì)的(verdorbenen)或不準(zhǔn)確應(yīng)用的熒光顏料的使用。本發(fā)明的其他實(shí)施例在從屬權(quán)項(xiàng)中給出。
下面參照根據(jù)附圖較詳細(xì)地說明的實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明。在此展示

圖1是一個(gè)流程圖，闡明在按照本發(fā)明的第一實(shí)施例的PCR擴(kuò)增中多核苷酸序列頻譜分析實(shí)時(shí)檢測方法中，各個(gè)步驟在時(shí)間上的次序；圖2是一個(gè)示意圖，表示在與PCR溶液中預(yù)先確定的多核苷酸序列的激活狀態(tài)一致的照射頻率下，在PCR擴(kuò)增過程中PCR溶液的消光特性；圖3按照本發(fā)明的PCR裝置第二實(shí)施例示意圖的一個(gè)部分視圖；圖4是按照本發(fā)明的PCR裝置第三實(shí)施例的部分視圖；圖5是按照本發(fā)明的PCR裝置第四實(shí)施例的部分視圖；圖6是按照本發(fā)明的PCR裝置第五實(shí)施例的部分視圖；圖7是按照本發(fā)明PCR裝置的第六實(shí)施例，其基于圖5所示第四實(shí)施例的部分視圖；圖8是在千兆赫頻率范圍和/或兆兆赫范圍內(nèi)制備PCR溶液所使用的緩沖溶液以及多核苷酸序列的消光特性。圖1表示按照本發(fā)明的方法在PCR擴(kuò)增中多核苷酸序列10的頻譜分析實(shí)時(shí)檢測的實(shí)施例的典型流程的示意流程圖。在這樣一個(gè)方法中首先要制備緩沖溶液13，其中收納或溶解制備PCR溶液所必需的起始物質(zhì)。所必需的起始物質(zhì)12是待復(fù)制的多核苷酸序列 10、適當(dāng)?shù)囊?、聚合酶以及合成多核苷酸序列用的三磷酸脫氧核苷。在制備PCR溶液11 之前可以已經(jīng)在頻譜分析實(shí)時(shí)檢測中測定各起始物質(zhì)12的質(zhì)量、特異性(Spezifit3t) 和形成特性。這種檢測在圖1中用1表示的時(shí)刻發(fā)生。制備PCR溶液11之后可以重新對 PCR溶液11 (時(shí)刻2)進(jìn)行進(jìn)一步的頻譜分析實(shí)時(shí)檢測。只有當(dāng)通過變性、引物雜交和延伸的PCR反應(yīng)步驟的重復(fù)發(fā)生待復(fù)制的多核苷酸序列的復(fù)制時(shí)，在每次成功的PCR反應(yīng)步驟之后都可以進(jìn)行頻譜分析實(shí)時(shí)檢測(時(shí)刻3，4和5)。在此，在變性的PCR反應(yīng)步驟之后測量單鏈多核苷酸序列優(yōu)選的激活狀態(tài)(時(shí)刻3)，其中在延伸的PCR反應(yīng)步驟之后(時(shí)刻5) 測量雙鏈多核苷酸序列的激活狀態(tài)。因此，借助于按照該實(shí)施例的方法，頻譜分析實(shí)時(shí)檢測可以在PCR擴(kuò)增的整個(gè)過程期間進(jìn)行，而且還可以定量表征在PCR擴(kuò)增中出現(xiàn)的多核苷酸序列在時(shí)間上的變化過程。另外，自然可以在PCR擴(kuò)增結(jié)束之后進(jìn)行頻譜分析檢測。若按照本發(fā)明方法的一個(gè)方面，變性的PCR反應(yīng)步驟通過照射兆兆赫范圍的電磁輻射的進(jìn)行，則本方法相應(yīng)電磁輻射的照射在變性進(jìn)行的時(shí)刻進(jìn)行。圖2表示PCR溶液中消光變化過程的示意圖，按照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，該P(yáng)CR溶液可以用千兆赫或兆兆赫范圍的電磁輻射進(jìn)行頻譜分析測定。這時(shí)，所照射的電磁輻射的頻率這樣選擇，使之與各多核苷酸序列預(yù)先確定的激活狀態(tài)的頻率一致，并在相應(yīng)的照射之后在其PCR溶液中被它減弱。因?yàn)椋赑CR擴(kuò)增中復(fù)制的多核苷酸序列的數(shù)目典型地在時(shí)間上按指數(shù)曲線增大，頻譜分析實(shí)時(shí)檢測的消光測量點(diǎn)處于按指數(shù)曲線變化過程的曲線上?，F(xiàn)將用交叉標(biāo)出PCR溶液各消光檢測值。這時(shí)，按照可能影響PCR擴(kuò)增的效率或速度的物理量以及化學(xué)量測定該時(shí)間變化過程。隨后可以借助于計(jì)算方法從消光測量計(jì)算特定多核苷酸序列的數(shù)量。在PCR擴(kuò)增期間，在多核苷酸序列頻譜分析實(shí)時(shí)檢測的實(shí)際執(zhí)行中人們發(fā)現(xiàn)，只有在預(yù)先確定的監(jiān)測閾值D1以上，這樣的檢測才能提供可以在進(jìn)一步數(shù)據(jù)處理中使用的明確的檢測結(jié)果。低于該監(jiān)測閾值D1的監(jiān)測值只具有理論性質(zhì)，因?yàn)樾旁瓯炔辉试S進(jìn)行明確的消光測量。所以，明確的頻譜分析實(shí)時(shí)檢測最早的時(shí)刻T1在實(shí)測的消光處于監(jiān)測閾值D1 以上時(shí)才出現(xiàn)。通過電磁輻射照射頻率的相應(yīng)選擇，可以達(dá)到盡可能小的監(jiān)測閾值D2，而且在此閾值下電磁輻射的監(jiān)測閾值D1處于其他頻率下。所以，必需進(jìn)行的PCR反應(yīng)步驟比傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)定量PCR方法少。另外，最早時(shí)刻T2也盡可能小，特別是比其他頻率的電磁輻射的T1更短。圖3表示PCR擴(kuò)增中多核苷酸序列頻譜分析實(shí)時(shí)檢測用的按照本發(fā)明的PCR裝置一個(gè)實(shí)施例示意圖的部分視圖。按照該實(shí)施例，輻射源20向PCR溶液11發(fā)射千兆赫和/ 或兆兆赫范圍的電磁輻射。PCR溶液11處于基片M的接收區(qū)域23，后者用所形成的PCR 溶液層厚S定義，電磁輻射21通過它進(jìn)行透過照射。這樣一個(gè)接收區(qū)域23目前由至少部分地受限的容積，諸如容器形成。這時(shí)，輻射頻率這樣調(diào)節(jié)，使之與處于該P(yáng)CR溶液11中的多核苷酸序列10的預(yù)先確定的激活狀態(tài)的頻率一致。所照射的電磁輻射21通過接收區(qū)域 23截面透射之后，用檢測器22檢測電磁輻射21強(qiáng)度相應(yīng)的減弱。此處沒有使用在光學(xué)結(jié)構(gòu)中一般使用的其它光學(xué)元件，諸如聚焦元件、準(zhǔn)直元件、 射線引導(dǎo)元件和濾光片。附加設(shè)置這樣傳統(tǒng)的光學(xué)部件來調(diào)制射線，對于專業(yè)人員來說是顯而易見的。圖4表示PCR擴(kuò)增中多核苷酸序列頻譜分析實(shí)時(shí)檢測用的PCR裝置一個(gè)實(shí)施例的另一個(gè)部分視圖。與圖3第一實(shí)施例的接收區(qū)域23相反，按照圖4的第二實(shí)施例不存在雙壁接收區(qū)域23，而只有單壁，其上接納PCR溶液11。例如，在此可以指把PCR溶液在基片的接收區(qū)域23上涂成薄膜。此外，該P(yáng)CR溶液11在基片M的接收區(qū)域23上的布置在地心引力場上這樣取向，使得在頻譜分析實(shí)時(shí)檢測期間可以保證層厚S保持恒定。此外，基片M 的接收區(qū)域23還可以包含這樣的結(jié)構(gòu)安排，使PCR溶液11和基片M的接收區(qū)域23之間的附著力提高。例如，這樣的安排是薄的表面結(jié)構(gòu)，支持PCR溶液11附著在基片M上。圖5表示按照本發(fā)明的PCR擴(kuò)增中多核苷酸序列頻譜分析實(shí)時(shí)檢測用的PCR裝置第四實(shí)施例的部分視圖。其中，從輻射源20發(fā)射的電磁輻射21的方向和被檢測器22檢測的輻射的方向不安排在彼此的延長線上。不如說，來自PCR溶液11的電磁輻射21和/或接收區(qū)域23基片這樣地偏轉(zhuǎn)，使得不進(jìn)行直線射線行程。這種射線行程大致在散射測量時(shí)是有利的。輻射源20和檢測器22這樣的相對安排還可以有助于改善不同的組件的空間安排，這有助于減小按照實(shí)施例的PCR裝置的整體尺寸。與按照圖3至圖5所示的電磁輻射21射線自由行程的實(shí)施例相比，在按照圖6的實(shí)施例的部分視圖中在一個(gè)適宜于輻射頻率范圍的波導(dǎo)管W中引導(dǎo)該電磁輻射21。在此， 該電磁輻射21可以在波導(dǎo)管W中直接耦合到輻射源20，但或者只有經(jīng)過適當(dāng)調(diào)制之后才耦合。相應(yīng)地，該波導(dǎo)管W可以直接與檢測器22結(jié)合，或者該輻射僅為借助檢測器22的檢測而進(jìn)行調(diào)制。該波導(dǎo)管W為此這樣地構(gòu)造，其中在接收區(qū)域23中作為漸弱的輻射場給出電磁輻射21，所以它通過與涂在波導(dǎo)管W外面的PCR溶液的相互作用可以導(dǎo)致對電磁輻射 21消光。波導(dǎo)管W的實(shí)施方式可以包括絕緣波導(dǎo)結(jié)構(gòu)，或者還包括集成了其他接收裝置的波導(dǎo)段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，波導(dǎo)管W集成在芯片構(gòu)造中。圖7表示以一個(gè)基于圖5第四實(shí)施例的在PCR擴(kuò)增中對多核苷酸序列進(jìn)行頻譜分析實(shí)時(shí)檢測用的PCR裝置實(shí)施例的部分視圖，其作為另一元件示出與接收區(qū)域23的基片M相互作用的溫度改變裝置25。溫度改變裝置25這樣地構(gòu)造，即在與接納PCR溶液11的接收區(qū)域23的一側(cè)相反的一側(cè)加熱和/或冷卻基片M。通過相應(yīng)的熱傳導(dǎo)改變基片M的溫度，使PCR溶液11的溫度發(fā)生變化。若基片M的熱阻小，以及溫度改變裝置25的加熱和 /或冷卻功率比所涂抹的PCR溶液11的熱容量大，則PCR溶液11溫度變化相對迅速，并可以保征快速跟隨重復(fù)的PCR反應(yīng)步驟。為了改善熱傳導(dǎo)，在溫度改變裝置25和基片M之間可以設(shè)置支持導(dǎo)熱的介質(zhì)。在按照本發(fā)明的PCR裝置的一個(gè)實(shí)施例中，該溫度改變裝置 25可以加熱和/或冷卻直接引導(dǎo)到基片M上的氣流，并在通過基片M相應(yīng)的導(dǎo)熱之后相應(yīng)地改變PCR溶液11的溫度。 圖8表示制備PCR溶液11所必需的緩沖溶液13的消光特性13’以及待檢測的多核苷酸序列10在千兆赫或兆兆赫頻率范圍內(nèi)預(yù)先確定的激活狀態(tài)下的消光特性10'。由于其折射特性，緩沖溶液13的消光在預(yù)先確定的頻率范圍內(nèi)是可檢測的變化。實(shí)驗(yàn)室一般用的多種緩沖溶液13都具有這種消光特性。為了盡可能降低多核苷酸序列10的激活狀態(tài)的檢測噪音，可能需要選擇這樣一種緩沖溶液13，它在多核苷酸序列10的上述激活狀態(tài)的頻率范圍內(nèi)，具有其最小的消光特性。與此相應(yīng)地，照射PCR溶液11的電磁輻射21通過該緩沖溶液13的消光，比通過PCR溶液11中多核苷酸序列10的消光小，而且多核苷酸序列10激活狀態(tài)的消光檢測，受到該緩沖溶液13的干擾小。通過根據(jù)待檢測的多核苷酸序列10及其激活頻率，相應(yīng)地選擇或調(diào)整緩沖溶液13，可以達(dá)到有利的信躁比。
在此要指出，所有上述部分本身都是單獨(dú)進(jìn)行并且在每個(gè)特別是以附圖所顯示的細(xì)節(jié)的組合是作為本發(fā)明本質(zhì)的要求提出的。專業(yè)人員很容易由此可以作出改變。
引用符號10多核苷酸序列10'多核苷酸序列激活狀態(tài)的消光11PCR溶液12起始物質(zhì)13緩沖溶液13'緩沖溶液的消光14標(biāo)記20輻射源21電磁輻射22檢測器23接收區(qū)域24基片25溫度改變裝置26熱介質(zhì)S層厚W波導(dǎo)管D1檢測閾值D2檢測閾值T檢測的最早時(shí)刻
權(quán)利要求
1.在PCR擴(kuò)增中對核酸分子進(jìn)行頻譜分析實(shí)時(shí)檢測用的方法，其中PCR擴(kuò)增包括提供在緩沖溶液(1 中的對于制備PCR溶液(11)所必需的起始物質(zhì)(12)以及重復(fù)進(jìn)行變性、引物雜交和延伸的PCR反應(yīng)步驟，并且在PCR擴(kuò)增期間在經(jīng)確定的時(shí)刻用來自輻射源00)的在千兆赫或兆兆赫范圍內(nèi)的電磁輻射照射PCR溶液(11)，以便借助于檢測器02)至少實(shí)時(shí)檢測多核苷酸序列 (10)是否存在。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于，核酸分子指的是多核苷酸序列。
3.按照權(quán)利要求1或2的在PCR擴(kuò)增中對核酸分子進(jìn)行頻譜分析實(shí)時(shí)檢測用的方法， 其特征在于，在緩沖溶液(13)中制備PCR溶液(11)所必需的起始物質(zhì)(12)中不包含化學(xué)的或物理的檢測標(biāo)記(14)，特別是不包含熒光標(biāo)記。
4.按照上列權(quán)項(xiàng)中一項(xiàng)的在PCR擴(kuò)增中對核酸分子進(jìn)行頻譜分析實(shí)時(shí)檢測用的方法， 其特征在于，選定所照射的在千兆赫或兆兆赫范圍內(nèi)的電磁輻射的強(qiáng)度，使得它們穿透PCR溶液(11)的預(yù)先確定的層厚(S)。
5.按照上列權(quán)項(xiàng)中一項(xiàng)的在PCR擴(kuò)增中對核酸分子進(jìn)行頻譜分析實(shí)時(shí)檢測用的方法， 其特征在于，所照射的在千兆赫或兆兆赫范圍內(nèi)的電磁輻射的頻率在IOOGHz和20THz 之間，特別是在300GHz和IOTHz之間。
6.按照上列權(quán)項(xiàng)中一項(xiàng)的在PCR擴(kuò)增中對核酸分子進(jìn)行頻譜分析實(shí)時(shí)檢測用的方法， 其特征在于，就所照射的在千兆赫或兆兆赫范圍內(nèi)電磁輻射的頻率而言，選定PCR溶液(11)的緩沖溶液(13)，使得透射過PCR溶液的預(yù)先確定的層厚(S)之后，輻射強(qiáng)度可以在很大程度上不衰減地被檢測器0 檢測出來。
7.按照上列權(quán)項(xiàng)中一項(xiàng)的在PCR擴(kuò)增中對核酸分子進(jìn)行頻譜分析實(shí)時(shí)檢測用的方法， 其特征在于，將PCR溶液(11)涂抹在對于所照射的在千兆赫或兆兆赫范圍內(nèi)的電磁輻射 (21)在很大程度上是透明的基片04)上，特別是涂抹在基片04)的預(yù)先確定的接收區(qū)域 (23)上。
8.按照權(quán)利要求7在PCR擴(kuò)增中對核酸分子進(jìn)行頻譜分析實(shí)時(shí)檢測用的方法，其特征在于，該基片04)包括至少一個(gè)用于在千兆赫或兆兆赫范圍內(nèi)電磁輻射的波導(dǎo)管(W)。
9.按照上列權(quán)項(xiàng)中一項(xiàng)的在PCR擴(kuò)增中對核酸分子進(jìn)行頻譜分析實(shí)時(shí)檢測用的方法， 其特征在于，提供額外的溫度改變裝置(M)，借此能夠把PCR溶液(11)加熱和/或冷卻至預(yù)先給定的溫度。
10.按照權(quán)利要求9在PCR擴(kuò)增中對核酸分子進(jìn)行頻譜分析實(shí)時(shí)檢測用的方法，其特征在于，該溫度改變裝置04)加熱和/或冷卻熱介質(zhì)( )，所述熱介質(zhì)通過基片直接或間接加熱和/或冷卻該P(yáng)CR溶液(11)。
11.按照上列權(quán)項(xiàng)中一項(xiàng)的在PCR擴(kuò)增中對核酸分子進(jìn)行頻譜分析實(shí)時(shí)檢測用的方法，其特征在于，在變性和/或引物雜交和/或延伸步驟之前和/或之后，從輻射源OO)用在千兆赫或兆兆赫范圍內(nèi)的電磁輻射照射PCR溶液(11)。
12.按照上列權(quán)項(xiàng)中一項(xiàng)的在PCR擴(kuò)增中對核酸分子進(jìn)行頻譜分析實(shí)時(shí)檢測用的方法，其特征在于，選定電磁輻射的頻率，以便把單鏈和/或雙鏈多核苷酸序列(10)激勵(lì)到確定的振動(dòng)激活狀態(tài)，以便檢測該激勵(lì)模式，特別是對于雙鏈多核苷酸序列(10)的雜交狀態(tài)的存在來說特征性的模式。
13.按照上列權(quán)項(xiàng)中一項(xiàng)的在PCR擴(kuò)增中對核酸分子進(jìn)行頻譜分析實(shí)時(shí)檢測用的方法，其特征在于，在檢測分析中考慮在PCR擴(kuò)增期間借助在千兆赫或兆兆赫范圍內(nèi)的電磁輻射的時(shí)間上在前的檢測作為時(shí)間上在后的檢測的背景。
14.按照上列權(quán)項(xiàng)中一項(xiàng)的在PCR擴(kuò)增中對核酸分子進(jìn)行頻譜分析實(shí)時(shí)檢測用的方法，其特征在于，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增之前用來自輻射源00)的在千兆赫或兆兆赫范圍內(nèi)的電磁輻射照射待在PCR擴(kuò)增中使用的起始物質(zhì)(1 的溶液，以便借助于頻譜分析檢測確定各起始物質(zhì)(1 的化學(xué)或物理性質(zhì)，特別是其質(zhì)量、特異性及其結(jié)合行為。
15.在PCR擴(kuò)增中對多核苷酸序列進(jìn)行頻譜分析實(shí)時(shí)檢測用的PCR裝置，其中包括 -基片(M)，帶有用于PCR溶液(11)的接收區(qū)域(23)，所述PCR溶液(11)由必需的起始物質(zhì)(12)和緩沖溶液(13)組成；-溫度改變裝置(M)，借此可以把PCR溶液(11)加熱和/或冷卻至預(yù)先給定的溫度， 以便使變性、引物雜交或延伸的重復(fù)性PCR反應(yīng)步驟成為可能；-輻射源(20)，以便以千兆赫或兆兆赫范圍內(nèi)的電磁輻射(13)照射PCR溶液(11)； -和檢測器(22)，以便對透射過PCR溶液(11)的輻射進(jìn)行頻譜分析檢測。
16.在PCR擴(kuò)增中對核酸分子進(jìn)行頻譜分析實(shí)時(shí)檢測用的方法，其中PCR擴(kuò)增包括提供在緩沖溶液(13)中的對于制備PCR溶液(11)所必需的起始物質(zhì)(12)，以及重復(fù)進(jìn)行變性、 引物雜交和延伸的PCR反應(yīng)步驟，并且在PCR擴(kuò)增期間在經(jīng)確定的時(shí)刻用來自輻射源OO) 的在千兆赫或兆兆赫范圍內(nèi)的電磁輻射照射PCR溶液(11)，以便借助于檢測器02) 在頻譜分析實(shí)時(shí)檢測中至少檢測多核苷酸序列(10)是否存在，并且變性的反應(yīng)步驟由來自輻射源OO)的兆兆赫輻射而引起。
17.按照權(quán)利要求16的方法，其中核酸分子指的是多核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及在PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增中對核酸分子，特別是多核苷酸序列進(jìn)行頻譜分析實(shí)時(shí)檢測用的方法，其中PCR擴(kuò)增包括提供在緩沖液中的對于制備PCR溶液所必需的起始物質(zhì)，以及重復(fù)進(jìn)行變性、引物雜交和延伸的PCR反應(yīng)步驟，而且在PCR擴(kuò)增期間在確定的時(shí)刻用來自輻射源的在千兆赫或兆兆赫范圍內(nèi)的電磁輻射照射PCR溶液，以便檢測器在實(shí)時(shí)檢測中至少檢測多核苷酸序列是否存在。
文檔編號C12Q1/68GK102301001SQ200980148566
公開日2011年12月28日 申請日期2009年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月2日
發(fā)明者T·丹克 申請人:第三專利投資有限兩合公司