阻止結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸及其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了包含能抑制結(jié)締組織生長因子表達(dá)的修飾核苷酸的化合物以及含有同樣的修飾核苷酸的組合物，還提供了利用這樣的化合物治療過度增殖病癥和纖維變性病的方法，以及減少因傷口愈合引起的瘢痕的方法。
【專利說明】阻止結(jié)締組織生長因子的反義核苷酸及其用途
[0001 ] 在本申請中參考了某些專利和出版物，后者還注明作者，雜志出處和出版日期。這些專利和出版物所披露的內(nèi)容被全文納入本申請作為參考以便更加全面地描述與本發(fā)明有關(guān)的技術(shù)的目前動(dòng)態(tài)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及用于治療過度增殖(hyperprolific)病癥和纖維變性病，以及減少因傷口愈合引起的瘢痕的新穎反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides, ASOs)。
【背景技術(shù)】
[0003]反義技術(shù)正在顯露出作為一種有效降低特定基因產(chǎn)物的表達(dá)的手段，因此，在若干調(diào)整結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)的表達(dá)方面的治療，診斷和研究應(yīng)用上可 能證明是異常有用的。(見頒發(fā)給Gaarde等人的美國專利U.S.PatentN0.6，965，025B2)
[0004]反義化合物是一種寡聚化合物，能與靶核酸(例如，一種靶標(biāo)mRNA分子)發(fā)生雜交(hybridization)。
[0005]反義化合物，組合物以及調(diào)整CTGF的表達(dá)和治療與CTGF表達(dá)有關(guān)的疾病的方法被披露在上述的美國專利U.S.Patent N0.6，965，025B2中，在此被納入作為參考。但是，還是需要另外的此類化合物，其能增強(qiáng)對(duì)CTGF表達(dá)的抑制，提供功能和其他有助的性能。
[0006]在一實(shí)施例中，本發(fā)明特別地提供了優(yōu)選的用于抑制CTGF表達(dá)的修飾的反義寡核苷酸。業(yè)已證實(shí)這些修飾的寡核苷酸比先前描述的靶向CTGF的ASOs更具顯著的、出乎意料的潛力。
[0007]結(jié)締組織生長因子(CTGF ;也稱之為ctgrofact，可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的分泌蛋白(fibroblast inducible secreted protein), fisp-12, N0V2,類似膜島素生長因子-結(jié)合蛋白有關(guān)的蛋白質(zhì) 2，IGFBP-rP2, IGFBP-8，HBGF-0.8，Hcs24，和 ecogenin)是模塊蛋白質(zhì)CCN(CTGF/CYR61/N0V)家族的一員，被提名為經(jīng)識(shí)別的第一家族成員，結(jié)締細(xì)胞生長因子，富半胱氨酸(cysteine-rich, CYR61),超量表達(dá)的腎母細(xì)胞瘤(nephroblastomaoverexpressed, NOV),但是，該家族還包括蛋白質(zhì)ELM-1 (在低轉(zhuǎn)移性的細(xì)胞中表達(dá))，WISP-3 (Wnt-1-誘導(dǎo)的分泌蛋白)，和C0P-1 (WISP-2)。業(yè)已發(fā)現(xiàn)CCN蛋白質(zhì)為分泌的，與細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)的蛋白質(zhì)，它調(diào)控細(xì)胞的過程，像粘附，移動(dòng)，有絲分裂發(fā)生，分化，存活，血管生成，動(dòng)脈粥樣壞死，軟骨形成，傷口愈合，腫瘤發(fā)生，以及血管和纖維變性的疾病，像硬皮病(scleroderma) (Lau and Lam, Exp.Cell Res.，1999，248，44-57)。結(jié)締組織生長因子蛋白顯示出激發(fā)DNA的合成和促進(jìn)成纖維細(xì)胞的趨化性(Bradham et al., J.Cell Biol.,1991，114，1285-1294)。
[0008]大多數(shù)情況下，在表達(dá)的研究中已報(bào)導(dǎo)了一種單2.4-千堿基CTGF的轉(zhuǎn)錄物，盡管報(bào)導(dǎo)了在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中3.5-和7-千堿基的轉(zhuǎn)錄物。在正常的分化過程中，結(jié)締組織生長因子在成纖維細(xì)胞中表達(dá)，分化過程涉及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的生成和重建，像植入后的胚胎發(fā)生和子宮蛻膜。結(jié)締組織生長因子頻繁地在纖維變性的皮膚病中超量表達(dá)，像全身硬化，局部皮膚硬化，瘢痕疙瘩，瘢痕組織，嗜酸性筋膜炎(eosinophilic fasciitis),結(jié)節(jié)性筋膜炎(nodular fasciitis),和掌攣縮病(Dupuytren; s contracture)。結(jié)締組織生長因子mRNA或者蛋白水平在包括肝，腎,肺,心血管系統(tǒng)，胰，腸，眼和牙齦的主要器官和組織的纖維變性損害中會(huì)升高。在乳房，胰腺和纖維組織細(xì)胞的腫瘤中，特征明顯地累及結(jié)締組織，結(jié)締組織生長因子在基質(zhì)區(qū)室中超量表達(dá)。在許多情況下，結(jié)締組織生長因子的表達(dá)空間地和時(shí)間地與致纖維化因子轉(zhuǎn)化生長因子 _β (transforming growth factor-beta)聯(lián)系在一起(Moussad and Brigstock, Mol.Genet.Metab.，2000, 71, 276-292)。
[0009]結(jié)締組織生長因子已經(jīng)被定位到人類染色體區(qū)域6q23.1，鄰近C_myb基因，涉及該區(qū)域的染色體異常已經(jīng)與人類的腫瘤有關(guān)，像腎母細(xì)胞瘤(Wilms' tumor) (Martinerieet al.，Oncogene,1992,7,2529-2534)。
[0010]帶有顯著纖維變性和血管成分的腫瘤呈現(xiàn)出CTGF表達(dá)升高，CTGF可能涉及到兒科成肌纖維母細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制。在考察過的12個(gè)兒科腫瘤中，在腫瘤細(xì)胞和/或相關(guān)脈管系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞中都顯示出中等至強(qiáng)烈的CTGF表達(dá)(Kasaragod et al.,Pediatr.Dev.Pathol.，2001，4，37-45)。
[0011]結(jié)締組織生長因子mRNA在兒童急性淋巴母細(xì)胞白血病(acute lymphoblasticleukemia, ALL)的惡性人類白血病淋巴母細(xì)胞中也特別地被調(diào)高(Vorwerk et al.,Br.J.Cance·r，2000,83, 756-760)，在Hs578T人類乳腺癌細(xì)胞中mRNA和蛋白質(zhì)水平都以一種劑量依賴性的方式被TGF-β調(diào)高，它表明CTGF是一個(gè)重要的神經(jīng)內(nèi)分泌因子以及TGF- β 是一個(gè)關(guān)鍵性的下游效應(yīng)子(Yang et al.，].Clin.Endocrinol.Metab.,1998,83,2593-2596)。
[0012]在一個(gè)鼠的肺纖維化模型中，結(jié)締組織生長因子mRNA表達(dá)的升高也是被爭光霉素(bleomycin),—個(gè)已知的肺纖維發(fā)生劑所誘導(dǎo)(Lasky et al., Am.J.Physiol., 1998,275，L365-371 ;與健康的不吸煙對(duì)照試驗(yàn)人群相比較，在先天性肺纖維化和肺肉狀瘤病(pulmonary sarcoidosis)患者的支氣管肺泡灌洗細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了同樣的mRNA表達(dá)的升高，它表明結(jié)締組織生長因子被涉及到針對(duì)損傷的纖維增生應(yīng)答反應(yīng)中(Allen et al.，Am.J.Respir.Cell Moll.Biol.，1999，21，693-700)。同樣，在一個(gè)增生的腎小球腎炎的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校Y(jié)締組織生長因子mRNA的表達(dá)在毛細(xì)管外和腎小球膜增生損害以及腎小球外周纖維化(periglomerular fibrosis)區(qū)域中強(qiáng)烈地升高。早期腎小球結(jié)締組織生長因子的超量表達(dá)與TGF-β蛋白質(zhì)的明顯向上調(diào)控一致，以及結(jié)締組織生長因子的動(dòng)力學(xué)有力地暗示了在該短暫的腎損傷模型中TGF-β在腎小球的修復(fù)，有可能在下游的修復(fù)中的角色(Ito et al., J.Am.Soc.Nephrol., 2001,12,472-484)。
[0013]美國專利U.S.Pat.N0.5，876，730所披露和要求權(quán)利的是一種實(shí)質(zhì)上純的或者分離的多肽，它具有與結(jié)締組織生長因子(CTGF)蛋白的羧基末端氨基酸相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列這樣的特征，其特征在于該多肽具有一氨基酸序列，其由結(jié)締組織生長因子的N端的氨基酸殘基247或248開始，一分離的多聚核苷酸序列編碼結(jié)締組織生長因子多肽，一重組表達(dá)載體含有所述的多肽，一宿主細(xì)胞含有所述的表達(dá)載體，一種藥用組合物，其在藥用可接受的載體中包含有效治療量的結(jié)締組織生長因子多肽。反義寡核苷酸被一般地披露了(Brigstock and Harding,1999)。
[0014]美國專利U.S.Pat.N0.5，783，187 ；5, 585，270 ；6, 232，064 ；6, 150，101 ；6, 069，006和PCT出版物WO 00/35936所披露和要求權(quán)利的是一種分離的多聚核苷酸其編碼結(jié)締組織生長因子多肽，表達(dá)載體，宿主細(xì)胞其被所述載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染；分離的多聚核苷酸包含從結(jié)締組織生長因子的上游分離出來的5’未翻譯的調(diào)控核苷酸序列，其特征在于，所述的未翻譯的調(diào)控核苷酸序列包含轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)域，其特征還在于，所述序列是一TGF-β應(yīng)答成分；分離的核酸結(jié)構(gòu)包含從結(jié)締組織生長因子(CTGF)基因的上游分離出來的非編碼調(diào)控序列，其特征在于，所述非編碼調(diào)控序列與表達(dá)所關(guān)心的蛋白質(zhì)或者反義RNA的核酸序列可操作地結(jié)合，其特征在于，所述核酸相對(duì)于所述非編碼序列是異源的；以及具有誘導(dǎo)ECM合成，膠原合成和/或成肌纖維細(xì)胞分化能力的結(jié)締組織生長因子(CTGF)的多肽片段，包含由所述多肽的至少外顯子2或外顯子3編碼的氨基酸序列。進(jìn)一步要求權(quán)利的是一種識(shí)別組合物的方法，該組合物影響TGF-β誘導(dǎo)的結(jié)締組織生長因子的表達(dá)，一種診斷選自由纖維變性疾病和動(dòng)脈粥樣硬化癥小組的懷疑有病理學(xué)的受試者的病理狀況的方法，該方法包含獲取懷疑含有結(jié)締組織生長因子的樣本，通過檢測受試者樣本中結(jié)締組織生長因子的水平與正常的標(biāo)準(zhǔn)樣本中結(jié)締組織生長因子水平的差異診斷受試者的病理學(xué)特征為與結(jié)締組織生長因子細(xì)胞相關(guān)的增生病癥。進(jìn)一步要求權(quán)利的是一種改善與結(jié)締組織生長因子有關(guān)的細(xì)胞增生病癥的方法，它包含在病癥部位對(duì)患有所述病癥的受試者給予一種組合物，該組合物包含藥用有效量的抗體或片段，與結(jié)締組織生長因子結(jié)合，其特征在于組合物中的抗體或片段不與F1DGF結(jié)合。反義寡核苷酸被一般地披露了(Grotendorst,2000 ；Grotendorst and Bradham,2001 ；Grotendorst and Bradham,2000 ；Grotendorstand Bradham, 1996 ；Grotendorst and Bradham, 1998 ；Grotendorst and Bradham,2000)。
[0015]PCT出版物WO 00/27868所披露和要求權(quán)利的是一種實(shí)質(zhì)上純的結(jié)締組織生長因子多肽或者其中的功能片段，一種編碼所述多肽的分離的多聚核苷酸序列，所述多聚核苷酸序列中的T也可以是U，一種與所述多聚核苷酸序列互補(bǔ)的核酸序列，以及所述序列的片段，它們的長度至少為15個(gè)堿基，會(huì)與對(duì)編碼結(jié)締組織生長因子蛋白的氨基酸序列的DNA在適度的直至非常嚴(yán)格的條件下雜交。進(jìn)一步要求權(quán)利的是一種包括所述多聚核苷酸的表達(dá)載體，一種與所述載體一 起 穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，一種與所述多肽結(jié)合的抗體，以及一種制備所述多肽的方法。還進(jìn)一步要求權(quán)利的是一種抑制結(jié)締組織生長因子在細(xì)胞中表達(dá)的方法，它包含使該細(xì)胞與結(jié)合了該細(xì)胞中的靶核酸的多聚核苷酸接觸，其特征在于，該多聚核苷酸抑制了結(jié)締組織生長因子在細(xì)胞中的表達(dá)，并且，該多聚核苷酸是一種反義寡核苷酸，以及檢測結(jié)締組織生長因子表達(dá)的測試盒，該測試盒包含分成多個(gè)格子的置物架子來承放一個(gè)或多個(gè)容器，至少一個(gè)容器中含有至少一種與結(jié)締組織生長因子結(jié)合的反義寡核苷酸(Schmidt et al.,2000)。
[0016]PCT出版物WO 00/13706所披露和要求權(quán)利的是一種治療或防止纖維變性的方法，該方法包含對(duì)需要的受試者給予有效量的一種試劑，它調(diào)整，調(diào)控或者抑制結(jié)締組織生長因子或其片段的表達(dá)或活性，其特征在于該試劑是一種抗體，一種反義寡核苷酸，或者是一種小分子。該方法直接用于腎纖維化和相關(guān)的腎病的治療，特別是與糖尿病和高血壓有關(guān)的并發(fā)癥的治療(Riser and Denichili，2000)。
[0017]PCT出版物WO 01/29217所披露和要求權(quán)利的是一種分離的核酸分子，它包含對(duì)編碼一多肽的核酸分子，該多肽包含一個(gè)氨基酸序列，其選自包括NOVl，N0V2 (結(jié)締組織生長因子)，和N0V3這樣一組的氨基酸序列，選自所述組的氨基酸序列的成熟形態(tài)或變異體，以及一種核酸分子，它包含編碼一多肽的核酸序列，該多肽包含一個(gè)氨基酸序列，它選自所述的一組，和所述多肽的成熟和變異體形態(tài)或片段，和所述核酸分子的補(bǔ)體。反義寡核苷酸被一般地披露過(Prayaga et al.,2001)。
[0018]肥大性瘢痕的形成，尤其是在臨床上消散嚴(yán)重?zé)齻莻€(gè)重點(diǎn)難題，它能引起高度增生的瘢痕，造成永久性的功能喪失和外貌損傷的標(biāo)志特征。每年在美國有超過一百萬的人需要治療燒傷。燒傷后肥大性瘢痕的發(fā)病率是個(gè)普通的后果，它產(chǎn)生了非常大的問題。因此，像反義寡核苷酸(AOS)那樣的CTGF抑制劑應(yīng)該在防止燒傷后嚴(yán)重的肥大性瘢痕上非常有效。通過局部施涂按預(yù)先規(guī)定的方法制備的AS0，并且監(jiān)測燒傷發(fā)生后瘢痕發(fā)展的嚴(yán)重程度可以來評(píng)價(jià)它的功效。
[0019]有若干理由或許讓CTGF成為調(diào)控肥大性瘢痕成為有吸引力的目標(biāo)。作為TGF-β I或TCD-β 2的輔因子和下游介質(zhì)(downstream mediator),對(duì)于針對(duì)瘢痕的基因定向分子療法而言，CTGF可能比TGF- β I或TCD- β 2代表更加特效的目標(biāo)，尤其是因?yàn)門GF- β I或TCD-β 2具有與瘢痕形成無關(guān)的多能的效果的緣故。另外，CTGF可能具有與TGF-β I或TCD- β 2無關(guān)的保持纖維變性表型的功能，而TGF- β I或TCD- β 2的策略可能會(huì)忽視纖維變性表型。盡管對(duì)CTGF在多重器官系統(tǒng)中和在像硬皮病那樣的慢性皮膚病中擴(kuò)大纖維化的作用的了解在深入，但是，CTGF在急性瘢痕和傷口愈合中的作用仍然待大量觀察的。
[0020]目前還沒有已知的有效抑制結(jié)締組織生長因子合成的治療劑，至今針對(duì)調(diào)控結(jié)締組織生長因子功能的研究策略已經(jīng)涉及到采用丁酸鈉(sodium butyrate, NaB),功能阻滯抗體和反義寡核苷酸。
[0021]飲食因素被認(rèn)為在人類癌癥，包括乳腺癌的發(fā)展和防止上起了重要作用。飲食的微量營養(yǎng)素NaB是飲食淀粉和纖維消化的主要最終產(chǎn)物，它是一種強(qiáng)有力的增長抑制劑，它啟動(dòng)許多類型細(xì)胞在體外的細(xì)胞分化。NaB，部 分地，作為乳腺上皮細(xì)胞中的組蛋白脫乙酰酶的抑制劑發(fā)揮著它的生物學(xué)作用，誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞在Hs578T雌激素-無應(yīng)答的人類乳腺癌細(xì)胞中的死亡，它能根據(jù)不同的細(xì)胞類型激活在細(xì)胞周期阻滯(cell cycle arrest)中涉及到的不同基因。NaB以劑量依賴的方式特別地上調(diào)結(jié)締組織生長因子的表達(dá)，在癌性和非癌性的乳房細(xì)胞中促進(jìn)mRNA和蛋白水平的升高(Tsubaki et al., J.Endocrinol., 2001,169,97-110)。
[0022]TGF-β具有獨(dú)特的能力來刺激正常的成纖維細(xì)胞在軟瓊脂中的生長，是轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞的一種性質(zhì)。結(jié)締組織生長因子不能誘導(dǎo)這些錨地非依賴的(anchorage-1ndependent)增長的正常鼠腎(normal rat kidney, NRK)的成纖維細(xì)胞，但是，結(jié)締組織生長因子的合成和作用對(duì)于TGF-β誘導(dǎo)的錨地非依賴的性是必不可少的。結(jié)締組織生長因子的抗體特定地阻斷TGF-β誘導(dǎo)的錨地非依賴的增長，通過在反義取向中一種表達(dá)結(jié)締組織生長因子基因的結(jié)構(gòu)被轉(zhuǎn)化的NRK成纖維細(xì)胞不應(yīng)答在錨地非依賴的增長試驗(yàn)中的TGF-β (替換為:被構(gòu)建的表達(dá)結(jié)締組織生長因子基因通過反義定向轉(zhuǎn)化過的NRK成纖維細(xì)胞在錨地非依賴的的生長分析中不響應(yīng)TGF-β) (Kothapalli et al.,CellGrowth.Differ.，1997，8，61-68)。這些CTGF-反義表達(dá)NRK細(xì)胞也被用于顯示TGF-β -刺激的膠原合成是通過結(jié)締組織生長因子介導(dǎo)的，這表明結(jié)締組織生長因子可能是抗纖維化療法有用的靶(Duncan et al.，F(xiàn)aseb J.，1999，13，1774-1786)。
[0023]人類結(jié)締組織生長因子cDNA的3’ -未翻譯的區(qū)域(untranslated region, UTR)為調(diào)控要素承載了若干個(gè)共有序列。當(dāng)3’ -UTR在一個(gè)報(bào)道基因下游被融合時(shí)，發(fā)現(xiàn)它作為一個(gè)有力的順式作用阻遏要素在發(fā)揮作用，反義3’ -UTR具有相同的，但更強(qiáng)有力的效果(Kubota et al.,FEBS Lett.，1999，450，84-88)。對(duì)人類和鼠的結(jié)締組織生長因子 3’_UTR的比較揭示出保留了一個(gè)長91個(gè)堿基的小片段。該區(qū)域被來自NIH3T3鼠成纖維細(xì)胞的RT-PCR放大，并被用于形成一個(gè)嵌合的融合結(jié)構(gòu)以分析它的阻遏效果。，鼠結(jié)締組織生長因子3’ -UTR無論是在正向還是反義定向中都有強(qiáng)力的報(bào)道基因轉(zhuǎn)錄阻遏效果，這表明該調(diào)控要素是非定向依賴性的(Kondo et al., Biochem.Biophys.Res.Commun., 2000, 278,119-124)。
[0024]長度為16個(gè)核苷酸，靶向翻譯啟動(dòng)的起始位點(diǎn)的一種硫代磷酸酯(phosphorothioate)反義寡核苷酸被用于抑制結(jié)締組織生長因子的表達(dá)，以及抑制牛主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)的增生和移動(dòng)(Shimo et al.，J.Biochem.(Tokyo)，1998，124，130-140)。該反義寡核苷酸也被用于顯示結(jié)締組織生長因子誘導(dǎo)在MCF-7人類乳腺癌細(xì)胞中的凋亡，TGF-β-誘導(dǎo)的凋亡部分地是由結(jié)締組織生長因子介導(dǎo)的(Hishikawa et al.，J.Biol.Chem.，1999，274，37461-37466)。還發(fā)現(xiàn)同樣的反義寡核苷酸抑制TGF- β -介導(dǎo)的凋亡蛋白酶3(caspase 3)的激活，因而抑制在人類主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(human aorticsmooth muscle cells, HASC)中 TGF-β -介導(dǎo)的凋亡誘導(dǎo)(Hishikawa et al., Eur.J.Pharmacol.，1999，385，287-290)。該反義寡核苷酸還被用于阻斷結(jié)締組織生長因子的表達(dá)，并且證實(shí)了高血壓上調(diào)結(jié)締組織生長因子在腎小球系膜細(xì)胞(mesangial cells)中的表達(dá)，這就轉(zhuǎn)而增強(qiáng)了 ECM蛋白的產(chǎn)生并誘導(dǎo)凋亡，有助于腎小球膜的重塑和最終的腎小球硬化(Hishikawa et al.，J.Biol.Chem.，2001，276，16797-16803)。
[0025]因此，感到還有長期 的需要有另外的能有效抑制結(jié)締組織生長因子功能的試劑。
[0026]發(fā)明綜沭
[0027]本發(fā)明提供了包含修飾的寡核苷酸的化合物，該寡核苷酸包含12-30個(gè)連接的核苷，優(yōu)選包含20個(gè)或者至少12個(gè)連接的核苷，更為理想的是包含至少14個(gè)核苷，化合物能抑制結(jié)締組織因子的表達(dá)。還提供了包含本發(fā)明的反義化合物的藥用組合物和其他組合物。
[0028]進(jìn)一步提供了治療患有與CTGF有關(guān)疾病或癥狀的動(dòng)物.特別是人類的方法，該方法是通過給予一定量的這樣的化合物來有效地抑制CTGF的表達(dá)，其特征在于，該疾病或癥狀是一種過度增殖病癥，像癌癥和纖維變性的疾病。進(jìn)一步還提供了減少傷口愈合所造成的瘢痕的方法，該方法是通過給予一定量的這樣的化合物來有效地抑制CTGF的表達(dá)。
[0029]附圖的簡要i兌明
[0030]圖1顯示CTGF基因組序列上的靶片段或區(qū)域，主要是外顯子靶片段，以其為對(duì)照制備靶向CTGF的反義寡核苷酸
[0031]圖2顯示CTGF mRNA序列上的靶片段或區(qū)域，以其為對(duì)照制備靶向CTGF的反義寡
核苷酸。
[0032]圖3提供了試驗(yàn)在CTGF mRNA序列上的反義寡核苷酸靶向外顯子序列用以抑制CTGF表達(dá)的圖解表示。[0033]圖4顯示CTGF基因組序列上的靶片段或區(qū)域，主要是內(nèi)含子靶片段，以其為對(duì)照制備靶向CTGF的反義寡核苷酸。
[0034]圖5顯示CTGF mRNA序列上的靶片段或區(qū)域，以其為對(duì)照制備靶向CTGF的反義寡
核苷酸。
[0035]圖6提供了在CTGF mRNA序列上的反義寡核苷酸靶向內(nèi)含子序列用以抑制CTGF表達(dá)試驗(yàn)結(jié)果的圖解表不。
[0036]圖7顯示抑制CTGF的高度靈敏的反義寡核苷酸，以及它們與兩種以前設(shè)計(jì)的反義寡核苷酸(ISIS 124238和ISIS 124212)活性的比較，披露于美國專利U.S.PatentN0.6，965，025B2中。圖7A識(shí)別了 8種外顯子靶向反義寡核苷酸，圖7B提供了反義寡核苷酸的優(yōu)選序列。
[0037]圖8提供了由9種高度活性的新穎的人類CTGF的反義寡核苷酸先導(dǎo)序列用以在培養(yǎng)的人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中抑制CTGF所獲得的劑量應(yīng)答的圖解表示。序列141923為陰性對(duì)照，序列124238和124212為兩種以前設(shè)計(jì)的序列。
[0038]圖9提供了鼠在接受了四星期的25mg/kg或50mg/kg劑量的反義寡核苷酸ISIS412294(SEQ ID NO:39)，ISIS 412295(SEQ ID NO:40)或 ISIS 418899(SEQ ID NO:166)后的血衆(zhòng)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotranferease, ALT)(圖9A)和血衆(zhòng)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)(圖9B)水平的圖解表示。結(jié)果表明鼠在接受了25mg/kg 或 50mg/kg 劑量的反義寡核苷酸 ISIS 412294 (SEQ ID NO:39), ISIS 412295 (SEQID NO:40)或 25mg/kg 劑量的 ISIS 418899 (SEQ ID NO:166)后的 ALT 和 AST 水平與鹽水(載體)對(duì)照組中的水平相似；鼠在接受了 50mg/kg劑量的ISIS 418899 (SEQ ID NO:166)后的ALT和AST水平明顯升高，高于對(duì)照組的觀測值。
[0039]圖10提供了 接受四星期的反義寡核苷酸治療后，顯示50mg/kg劑量的ISIS412295治療組的體重增加明顯低于對(duì)照組體重增加的圖解表示
[0040]圖11顯示鼠的皮膚傷口真皮內(nèi)用3.0，1.0，0.3或0.1mg的CTGF反義寡核苷酸治療結(jié)果，對(duì)所有的劑量，CTGF和CollA2 mRNA的表達(dá)都有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的明顯降低。這些結(jié)果清楚地證實(shí)了利用2’ MOE修飾的反義寡核苷酸來抑制CTGF的表達(dá)會(huì)減少膠原在皮膚上的沉積。
[0041]圖12提供的圖解表示說明兔在接受了 50mg/mL(總劑量5mg)的真皮內(nèi)給藥至少達(dá)14天后存在的CTGF反義寡核苷酸顯著的水平。
[0042]發(fā)明的i羊細(xì)i兌明
[0043]在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種化合物，它包含由12-30個(gè)連接的核苷所組成的修飾的寡核苷酸，在選自SEQ ID NO:9的核苷酸718-751，1388-1423，1457-1689，2040-2069，2120-2147，2728-2797，2267-2301，553-611，1394-1423，1469-1508，1559-1605，1659-1689，2100-2129及1399-1423的區(qū)域內(nèi)至少存在它的一個(gè)12個(gè)核堿基序列的部分。
[0044]在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種化合物，它包含由12-30個(gè)連接的核苷所組成的修飾寡核苷酸，在選自SEQ ID NO: 10的核苷酸2540-2559，2568-2587，2623-2647和2623-2642的區(qū)域內(nèi)至少存在它的一個(gè)12個(gè)核堿基序列的部分。
[0045]在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種化合物，它包含由12-30個(gè)連接的核苷所組成的修飾寡核苷酸，在 SEQ ID NO:28，30，39，40，43，44，45，50，51，52，56，78，125 和 166 中提出的核堿基序列中至少存在它的一個(gè)12個(gè)核堿基序列的部分。
[0046]在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該化合物包含20個(gè)或者至少12個(gè)連接的核苷，更優(yōu)選地，包含至少14個(gè)連接的核苷，它存在于SEQ ID NO:28，30，39，40，43，44，45，50，51，52，56，78，125和166中提出的核堿基序列中。
[0047]這些序列的選擇是通過篩選在圖1至圖7中呈現(xiàn)出的結(jié)果以及在人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HuVEC)中劑量應(yīng)答研究的結(jié)果所決定的。詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)見下面的實(shí)施例部分中的實(shí)施例8。
[0048]在圖1-6中呈現(xiàn)的靶序列包括內(nèi)含子和外顯子靶向序列。靶區(qū)域是核酸結(jié)構(gòu)上定義的一個(gè)區(qū)域。例如，一個(gè)靶區(qū)域可以包含一個(gè)3’ UTR, 一個(gè)5’ UTR, 一個(gè)外顯子，一個(gè)內(nèi)含子，一個(gè)編碼區(qū)域，一個(gè)翻譯起始區(qū)域，一個(gè)翻譯終止區(qū)域，或者其他的被定義的核酸區(qū)域。靶標(biāo)包括確定至少一個(gè)與反義化合物雜交的靶片段，這樣能產(chǎn)生合乎理想的效果。在該實(shí)施例中，該合乎理想的效果是減低mRNA靶核酸的水平。
[0049]在外顯子和內(nèi)含子序列中都識(shí)別出多個(gè)序列的活性明顯高于以前設(shè)計(jì)的序列，像SEQIDN0:15 (ISIS 124238)。若干個(gè)新的內(nèi)含子(SEQ NO:125)和外顯子(SEQ NOs.28，30，40，45，52，50和78)寡核苷酸表現(xiàn)出的活性顯著高于其他序列。
[0050]在最初的ASO活性篩選中SEQ ID NOs.39和40顯示出是高度有效的CTGF表達(dá)抑制劑(在此有數(shù)據(jù)顯示)。為了進(jìn)一步考察在CTGF mRNA上的這片區(qū)域是否代表一個(gè)以ASOs為目標(biāo)的“熱點(diǎn)”，又設(shè)計(jì)了另一個(gè)ASO序列(SEQ ID N0166)，它被設(shè)計(jì)成與被SEQNOs 39和40作為目標(biāo)的那些序列的上游序列雜交。也發(fā)現(xiàn)該AS0(SEQ ID N0166)是一個(gè)對(duì)CTGFmRNA表達(dá)的十分有效的抑制劑，表明CTGF mRNA的這一段對(duì)于以ASO抑制劑為目標(biāo)是個(gè)有吸引力的區(qū)域。
[0051]在某個(gè)實(shí)施例 中，反義化合物與一部分的CTGF區(qū)域互補(bǔ)，該區(qū)域?yàn)閷形稽c(diǎn)從1396伸展至1424的活性寡核苷酸的靶標(biāo)。這是一個(gè)作為ISIS 418899,412295,和412294(分別為SEQ ID NOs: 166，40和39)的靶標(biāo)的序列空間。
[0052]本發(fā)明還提供了一種化合物，它包含一種修飾的寡核苷酸，該寡核苷酸包含至少12個(gè)，優(yōu)選至少14個(gè)連接的核苷，它的核堿基序列是提出在SEQ ID NO:28，30，39，40，43，44，45，50，51，52，56，78，125 和 166 之一種中的一部分。
[0053]在此描述的反義化合物可以包含一個(gè)具有12至30，12至20，優(yōu)選14至20個(gè)連接
的核苷的寡核苷酸。
[0054]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，該修飾的寡核苷酸是單鏈或雙鏈的寡核苷酸。
[0055]本發(fā)明采用寡聚化合物，特別是反義寡核苷酸，用以調(diào)節(jié)核酸分子編碼結(jié)締組織生長因子的功能，最終調(diào)節(jié)結(jié)締組織生長因子產(chǎn)生的數(shù)量。這是通過提供專一地與一個(gè)或多個(gè)編碼結(jié)締組織生長因子的核酸雜交的反義化合物來實(shí)現(xiàn)的。在此所使用的術(shù)語“靶核酸”和“編碼結(jié)締組織生長因子的核酸”包含編碼結(jié)締組織生長因子的DNA，由這樣的DNA轉(zhuǎn)錄的RNA(包括pre-mRNA和mRNA)，以及從這樣的RNA中衍生出來的cDNA。一種寡聚化合物與其靶核酸特定的雜交干擾了該核酸的正常功能。這種通過化合物專一地與靶核酸雜交來調(diào)節(jié)靶核酸功能的方法通常稱之為“反義”。被干擾的DNA功能包括復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。被干擾的RNA功能包括所有維持生命所必需的功能,像,例如,RNA移位到蛋白質(zhì)翻譯的位點(diǎn)上，由RNA翻譯蛋白質(zhì)，剪接RNA以生成一個(gè)或多個(gè)mRNA種類，以及可能是RNA參與的或促進(jìn)的催化活性。這種干擾靶核酸功能的總效果是調(diào)節(jié)結(jié)締組織生長因子的表達(dá)。在本發(fā)明的內(nèi)容中，“調(diào)節(jié)”意味著基因表達(dá)的升高(促進(jìn))或者降低(抑制)。在本發(fā)明的內(nèi)容中，抑制是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的優(yōu)選方式，mRNA是優(yōu)選的靶標(biāo)。
[0056]靶核酸，靶區(qū)域和核苷酸序列
[0057]優(yōu)選將特定的核酸作為反義的目標(biāo)。在本發(fā)明的內(nèi)容中，將反義化合物“靶向”到一種特定的核酸上是一個(gè)具有多步的過程。
[0058]可以理解的是，包含在實(shí)施例中的每個(gè)SEQ ID NO中提出出來的序列與對(duì)糖組成部分，核苷間的連接，或者核堿基的任何修飾無關(guān)。同樣地，由一個(gè)SEQ ID NO確定的反義化合物可以獨(dú)立地包含一處或多處對(duì)糖組成部分，核苷間的連接，或者核堿基的修飾。由Isis號(hào)碼(Isis No)描述的反義化合物表示了核堿基和模體(motif)的一種結(jié)合。
[0059]在一個(gè)實(shí)施例中，靶區(qū)域是核酸結(jié)構(gòu)上定義出來的。例如，一個(gè)靶區(qū)域可以包含一個(gè)3’ UTR, 一個(gè)5’ UTR, 一個(gè)外顯子，一個(gè)內(nèi)含子，一個(gè)編碼區(qū)域，一個(gè)翻譯起始區(qū)域，一個(gè)翻譯終止區(qū)域，或者其他的被定義的核酸區(qū)域。核酸結(jié)構(gòu)上定義出的區(qū)域通過由序列數(shù)據(jù)庫如NGBI給出的登錄編號(hào)獲得，那些信息在此被引為參考納入。在一個(gè)實(shí)施例中，靶區(qū)域可包含這樣的序列，該序列從靶區(qū)域內(nèi)的一個(gè)靶片段的5’靶點(diǎn)至靶區(qū)域內(nèi)的另一個(gè)靶片段的3，靶點(diǎn)。
[0060]靶標(biāo)包括確定至少一個(gè)與反應(yīng)化合物雜交的靶片段，這樣能產(chǎn)生合乎理想的效果。在特定的實(shí)施例中，·該合乎理想的效果是減低mRNA靶核酸的水平。在其他的實(shí)施例中，該合乎理想的效果是由靶核酸編碼的蛋白質(zhì)的水平或者是與靶核酸相關(guān)聯(lián)的表型變化。
[0061]靶區(qū)域可包含一個(gè)或者多個(gè)靶片段。靶區(qū)域內(nèi)的多個(gè)靶片段可以是重疊的?；蛘撸鼈円部梢允遣恢丿B的。在一個(gè)實(shí)施例中，在一個(gè)靶區(qū)域中的靶片段被不超過約300個(gè)核苷隔開。在另外的實(shí)施例中，在一個(gè)靶區(qū)域中的靶片段被靶核酸上的不多于約250，200，150，100，90，80，70，60，50，40，30，20或10個(gè)核苷隔開。在另一個(gè)實(shí)施例中，在一個(gè)靶區(qū)域中的靶片段被靶核酸上的不多于約5個(gè)核苷隔開。在別的實(shí)施硫中，靶片段是鄰接的。
[0062]合適的靶片段可以在一個(gè)5’ UTR, 一個(gè)編碼區(qū)，一個(gè)3’ UTR, 一個(gè)內(nèi)含子，或者一個(gè)外顯子內(nèi)發(fā)現(xiàn)。包含一個(gè)開始密碼子或者一個(gè)終止密碼子的靶片段也是合適的靶片段。合適的靶片段可以特異地排除某些結(jié)構(gòu)上定義的區(qū)域，像開始密碼子或者終止密碼子。
[0063]合適靶片段的確定可以包括將靶核酸的序列在整個(gè)基因組中與其他序列相比較。例如，BLAST算法可以用于識(shí)別在不同核酸中具有相似性的區(qū)域。這種比較能防止選擇的反義化合物序列會(huì)以非特異的方式與一個(gè)不是選出來的靶核酸(即，非靶序列或偏離的靶序列)雜交。
[0064]在一個(gè)活性的靶區(qū)域內(nèi)，反義化合物的活性(例如被定義為靶核酸水平降低的百分?jǐn)?shù))可以是有變化的。在一個(gè)實(shí)施例中，CTGF mRNA水平的下降表現(xiàn)出對(duì)CTGF表達(dá)的抑制。CTGF蛋白水平的下降也表現(xiàn)出對(duì)靶mRNA表達(dá)的抑制。還有，表型變化是抑制CTGF表達(dá)的征兆。例如，CTGF測量值的增加是抑制CTGF表達(dá)的征兆。
[0065]詳細(xì)地說，靶標(biāo)過程通常從識(shí)別一個(gè)其功能要被調(diào)節(jié)的核酸序列開始。例如，這可以是一個(gè)細(xì)胞基因(或者從該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA)，它的表達(dá)與一種特殊的失調(diào)或病癥相聯(lián)系，或者可以是來自傳染試劑(infectious agent)的一個(gè)核酸分子。在本發(fā)明中，祀是一種編碼結(jié)締組織生長因子的核酸。靶標(biāo)過程還包括確定該基因內(nèi)發(fā)生反義相互作用的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)，這樣來得到理想的結(jié)果，例如，蛋白質(zhì)表達(dá)的識(shí)別和調(diào)節(jié)。在本發(fā)明的內(nèi)容之中，優(yōu)選的基因內(nèi)的位點(diǎn)是包含該基因的開放閱讀框架(open reading frame, ORF)的翻譯起始密碼子或翻譯終止密碼子的區(qū)域。如業(yè)內(nèi)所知曉的那樣，因?yàn)榈湫偷姆g起始密碼子是5’ -AUG(在轉(zhuǎn)錄的mRNA分子中；5’ -ATG在相應(yīng)的DNA分子中)，所以，翻譯起始密碼子也稱之為“AUG密碼子”，“開始密碼子”或者“AUG開始密碼子”。少數(shù)的基因的翻譯起始密碼子具有 RNA 序列 5 ‘-GUG，5’ -UUG 或 5’ -CUG,而且 5’ -AUA，5’ -ACG,和 5’ -CUG,已顯示出在體內(nèi)起作用。因而，術(shù)語“翻譯起始密碼子”和“開始密碼子”可包含許多的密碼子序列，盡管在每種情況下的啟動(dòng)氨基酸典型地是蛋氨酸(在真核生物中)或者甲酰蛋氨酸(formylmethionine)(在原核生物中)。業(yè)內(nèi)也熟知真核生物和原核生物的基因可以具有兩種或更多的可選的開始密碼子，它們的任何一種可以優(yōu)先用于在特定細(xì)胞類型或組織中，或者在一組特定的條件下的翻譯起始。在本發(fā)明的內(nèi)容中，“開始密碼子”和“翻譯起始密碼子”指的是用在體內(nèi)的，啟動(dòng)由編碼結(jié)締組織生長因子基因轉(zhuǎn)錄的mRNA分子的翻譯，而不論這些密碼子的序列。
[0066]業(yè)內(nèi)也知曉基因的翻譯終止密碼子(或“終止密碼子”)可以具有三種序列之中的一種，即 5’ -UAA ，5’ -UAG 和 5’ -UGA (相應(yīng)的 DNA 序列分別為 5’ -TAA，5’ -TAG 和 5’ -TGA)。術(shù)語“開始密碼子區(qū)域”和“翻譯起始密碼子區(qū)域”指的是這樣的mRNA或基因的一個(gè)部分，它包含從一個(gè)翻譯起始密碼子算起往任一方向(即，5’或3’)大約25個(gè)至大約50個(gè)連續(xù)的(contiguous)核苷酸。同樣，術(shù)語“終止密碼子區(qū)域”和“翻譯終止密碼子區(qū)域”指的是這樣的mRNA或基因的一個(gè)部分，它包含從一個(gè)翻譯終止密碼子算起往任一方向(即，5’或3’ )大約25個(gè)至大約50個(gè)連續(xù)的核苷酸。
[0067]業(yè)內(nèi)已知曉開放閱讀框架(ORF)或者“編碼區(qū)域”指的是翻譯起始密碼子與翻譯終止密碼子之間的區(qū)域，它也是個(gè)可以被有效定向的區(qū)域。其他的靶區(qū)域包括5’未翻譯的區(qū)域(5，-UTR)，業(yè)內(nèi)指的是從翻譯起始密碼子算起的mRNA沿著5’方向上的一個(gè)部分，因而，它包括一個(gè)mRNA或者基因上相應(yīng)核苷酸的5’-加帽位點(diǎn)(5' cap site)與翻譯起始密碼子之間的部分；以及3’未翻譯的區(qū)域(3’-UTR)，業(yè)內(nèi)指的是從翻譯終止密碼子算起的mRNA沿著3’方向上的一個(gè)部分，因而，它包括一個(gè)mRNA或者基因上相應(yīng)核苷酸的翻譯終止密碼子與3’末端之間的部分。mRNA的5’帽結(jié)構(gòu)包含一個(gè)N7-甲基化的鳥嘌呤核苷殘基，它通過一個(gè)5’ -5’的三磷酸鹽(triphosphate)連接與mRNA的5’ -most殘基結(jié)合在一起。mRNA的5’帽區(qū)域被認(rèn)為是包括5’帽結(jié)構(gòu)本身以及緊接著該帽的最初50個(gè)核苷酸。5’帽區(qū)域可能也是個(gè)優(yōu)選的靶區(qū)域。
[0068]雖然某些真核生物的mRNA轉(zhuǎn)錄物直接被翻譯，許多含有一個(gè)或多個(gè)稱之為“內(nèi)含子”的區(qū)域，它們在轉(zhuǎn)錄物被翻譯之前被切除。剩下的(因而被翻譯了)區(qū)域被稱之為“外顯子”，被剪接在一起形成一個(gè)連續(xù)的mRNA序列。mRNA剪接位點(diǎn)，即內(nèi)含子_外顯子的接頭也可能是優(yōu)選的靶區(qū)域，當(dāng)在與疾病相關(guān)的異常剪接或者一種特殊的mRNA剪接產(chǎn)物的生產(chǎn)過剩的情況下它們是特別有用處的。由于重排或缺失所造成的異常融合接頭也是優(yōu)選的靶。業(yè)已發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子也可能是有效的，因而是優(yōu)選的適合于反義化合物靶向DNA或pre-mRNA的祀?yún)^(qū)域。
[0069]業(yè)內(nèi)也知曉從DNA的同一個(gè)基因組區(qū)域里可以產(chǎn)生出可替代的RNA轉(zhuǎn)錄物。這些可替代的轉(zhuǎn)錄物統(tǒng)稱為“變異體”。更準(zhǔn)確地說，“pre-mRNA變異體”產(chǎn)自同一基因組DNA的轉(zhuǎn)錄物，它與產(chǎn)自同一基因組DNA的其他轉(zhuǎn)錄物的不同之處在于，或者是它們的開始位置或者是它們的終止位置，以及它們含有內(nèi)含子區(qū)域與外顯子區(qū)域。
[0070]剪接過程中去除一個(gè)或多個(gè)外顯子或內(nèi)含子區(qū)域或者它們的部分時(shí)，pre-mRNA變異體產(chǎn)生出較小的“mRNA變異體”。因此，mRNA變異體是被加工過的pre-mRNA變異體，作為剪接的結(jié)果，每個(gè)獨(dú)特的pre-mRNA變異體一定總是產(chǎn)生出一個(gè)獨(dú)特的mRNA變異體。這些mRNA變異體也稱之為“可替代剪接變異體”。如果不存在pre-mRNA變異體的剪接，則該pre-mRNA變異體與mRNA變異體一致。
[0071]業(yè)內(nèi)也知曉可以通過利用替代的信號(hào)來開始或終止轉(zhuǎn)錄以生產(chǎn)變異體，而且，pre-mRNA和mRNA可以具有多于一個(gè)的開始密碼子或終止密碼子。來自利用替代開始密碼子的pre-mRNA或mRNA的生產(chǎn)處的變異體被稱之為該pre-mRNA或mRNA的“替代開始變異體”。那些利用替代終止密碼子的轉(zhuǎn)錄物被稱之為該pre-mRNA或mRNA的“替代終止變異體”。替代終止變異體的一個(gè)特殊類型是“多聚腺苷酸變異體“(polyA variant)，其中的許多個(gè)所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物是由轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)替代選擇了 “polyA終止信號(hào)”的一個(gè)信號(hào)所引起的，從而生產(chǎn)出在獨(dú)特的polyA位點(diǎn)上終止的轉(zhuǎn)錄物。
[0072]反義化合物一般被用作研究試劑和診斷學(xué)。例如，反義寡核苷酸能以敏銳的特異性來抑制基因的表達(dá)，常被業(yè)內(nèi)人士用于解釋特殊基因的功能。反義化合物也被用于，例如區(qū)分生物途徑中各個(gè)成員的功能。因此，反義調(diào)整已經(jīng)被拿來作研究之用。
[0073]當(dāng)用于試驗(yàn)盒和診斷學(xué)時(shí)，本發(fā)明的反義化合物既可以單獨(dú)也可以結(jié)合其他的反義化合物或療法，用作差異和/或組合分析的工具來解釋在細(xì)胞和組織中表達(dá)的基因的一部分或整個(gè)補(bǔ)體的表達(dá)模式。
[0074]將在用一種或多種反義化合物處理過的細(xì)胞或組織內(nèi)的表達(dá)模式與未經(jīng)過反義化合物處理的對(duì)照的細(xì)胞或組織進(jìn)行比較，產(chǎn)生的模式被用于分析它們的基因表達(dá)的差異水平是屬于，例如，與疾病有關(guān)，信號(hào)傳輸途徑，細(xì)胞定位，表達(dá)水平，所檢驗(yàn)的基因的大小，結(jié)構(gòu)或功能。這些分析可以在受激的或未受激的細(xì)胞上進(jìn)行，可以有或者沒有影響表達(dá)模式的其他化合物存在下進(jìn)行。
[0075]業(yè)內(nèi)知曉的基因表達(dá)分析方法的例子包括DNA陣列或微陣列(Brazma and Vilo,FEDS Lett.，2000，480，17-24 ;Celis，et al.，F(xiàn)EBS Lett.,2000,480,2-16), SAGA (serialanalysis of gene expression)(基因表達(dá)的系列分析)(Madden, et al.， Drug Discov.Today,2000,5,415-425), READS(restriction enzyme amplification of digestedcDNAs)(消化的 cDNAs 的限制性酶擴(kuò)增)(Prashar and Weissman,Methods Enzymo1., 1999,303, 258-72), TOGA (total gene expression analysis)(全基因表達(dá)分析)(Sutcliffe, etal.，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.2000,97,1976-81)，蛋白質(zhì)陣列和蛋白質(zhì)組學(xué)(proteinarrays and proteomics)(Celis,et al.,FEBS Lett., 2000,480, 2-16 ； Jungblut,et al.,Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10),表達(dá)序列標(biāo)記物(expressed sequence tag) (EST)測序(Celis, et al., FEBS Lett., 2000,480, 2-16 ；Larsson, et al., J.Biotechnol.,2000,80,143-57),相減 RNA 指紋圖譜(subtractive RNA fingerprinting) (SuRF) (Fuchs,et al., Anal.Biochem.,2000, 286,91-98 ；Larson,et al., Cytometry,2000,41, 203-208),相減克隆(subtractive cloning),差異顯不(differential display) (DD) (Jurecic andBelmont, Curr.0pin.Microbiol., 2000, 3, 316-21),比較基因組雜交(Carrrrrrrulli,et al., J.Cel I Biochem.Supp1., 1998,31,286-96), FISH (fluorescent in situhybridization)(突光原位雜交)技術(shù)(Going and Gusterson, Eur.J.Cancer, 1999, 35,1895-904)以及質(zhì)譜方法(reviewed in (To, Comb.Chem.High Throughput Screen, 2000, 3,235-41)。
[0076]反義化合物
[0077]在本發(fā)明的內(nèi)容中，術(shù)語“寡核苷酸”指的是核糖核酸(RNA)或者脫氧核糖核酸(DNA)或者它們的模擬物的一種寡聚物或聚合物。該術(shù)語包括由天然存在的核堿基，糖類和共價(jià)核苷間(骨架)鍵合組成的寡核苷酸，以及具有非天然存在的但功能類似的部分的寡核苷酸。相對(duì)于天然形式，由于具有合乎理想的性質(zhì)，像增強(qiáng)的細(xì)胞攝入，與核酸靶之間增強(qiáng)的親和力，以及核酸酶的存在下的穩(wěn)定性提高，所以通常優(yōu)選這種修飾的或取代的寡核苷酸。
[0078]盡管反義寡核苷酸是反義化合物一種優(yōu)選的形式，本發(fā)明還是包含了其他寡聚反義化合物，包括但不限寡核苷酸模擬物。
[0079]反義化合物指的是一種能與靶核酸通過氫鍵雜交的寡聚化合物。反義化合物包括但不限于寡核苷酸類，寡核苷類，寡核苷酸類似物，寡核苷酸模擬物，反義寡核苷酸類，siRNA, RNAi,核糖酶類(ribozymes),外部指導(dǎo)序列(external guide sequence,EGS)寡核苷酸類(oligozymes),和其他與祀核酸雜交并調(diào)控其表達(dá)的寡核苷酸類。
[0080]在某些實(shí)施例中，反義化合物具有一種核堿基序列，當(dāng)在5’至3’的方向上書寫時(shí)，它包含它被祀向的祀核酸的祀片段的反向補(bǔ)體(reverse complement)。在某些這樣的實(shí)施例中，反義寡核苷酸具有一種核堿基序列，當(dāng)在5’至3’的方向上書寫時(shí)，它包含它被靶向的靶核酸的靶片段的反向補(bǔ)體。
[0081]在某些實(shí)施例中，靶向一種核酸的反義化合物的長度為12-30個(gè)亞單位。換言之，反義化合物是從12個(gè)至30個(gè)連接的亞單位。在其他的實(shí)施例中，反義化合物是8-80個(gè)，12-50個(gè)，15-30個(gè)，18-24個(gè)，19-22個(gè)，或者20個(gè)連接的亞單位。在某些這樣的實(shí)施例中，反義化合物的長度是 8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，或80個(gè)連接的亞單位，或者是由任何兩個(gè)上述數(shù)值定義的范圍。在某些實(shí)施例中，反義化合物是一種反義寡核苷酸，連接的亞單位是核苷酸。
[0082]在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該化合`物包含20個(gè)或者至少14個(gè)連接的核苷，其特征在于，修飾的寡核苷酸具有與SEQ ID NOs:28，30，39，40，45，52，56，78，125和166中的所提出的一個(gè)序列100%—致。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，感興趣的先導(dǎo)化合物具有SEQIDNO:39中提出的序列(ISIS 412294)。
[0083]在某些實(shí)施例中，一種靶向一種核酸的截短的(shortened)或缺失的(truncated)反義化合物具有一個(gè)亞單位從5’端缺失(5’ truncation),或者就是從3’端缺失(3’truncation)。一種祀向一種核酸的截短的或缺失的化合物可以有兩個(gè)亞單位從該反義化合物的5’端，或者有兩個(gè)亞單位從該反義化合物的從3’端缺失?；蛘撸撊笔У暮塑湛梢苑稚⒃谡麄€(gè)反義化合物中，例如，在一個(gè)反義化合物中，它有一個(gè)核苷從5’端缺失，一個(gè)核苷從3’端缺失。
[0084]當(dāng)一個(gè)伸長的反義化合物中存在有一個(gè)另外的亞單位時(shí)，該另外的亞單位可以位于該反義化合物的5’端或者3’端。當(dāng)有兩個(gè)或更多另外的亞單位存在時(shí)，增加的亞單位可以相互鄰接，例如，在一種有兩個(gè)加在該反義化合物的5’端上的亞單位(5，加成)，或者加在3’端上的亞單位(3’加成)的反義化合物中?；蛘?，該增加的亞單位可以分散在整個(gè)反義化合物中，例如，在一個(gè)反義化合物中，它有一個(gè)核苷加到5’端上，一個(gè)核苷加到3’端上。
[0085]有可能增加或減少像寡核苷酸那樣反義化合物的長度，和/或引入錯(cuò)配(mismatch)喊基而不消除活性。例如，Woolf 等(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:7305-7309,1992)測試了一系列長度為13-25個(gè)核堿基的反義寡核苷酸在注射卵母細(xì)胞的模式中誘導(dǎo)一種靶RNA切割的能力。長度為25個(gè)核堿基，且在靠近該反義寡核苷酸端點(diǎn)處有8或11個(gè)錯(cuò)配的反義寡核苷酸，其能夠引導(dǎo)靶mRNA的特異切割，雖然要比不含有錯(cuò)配的反義寡核苷酸的程度低。類似地，采用有13個(gè)核堿基的反義寡核苷酸，包括那些有I個(gè)或3個(gè)錯(cuò)配的反義寡核苷酸，實(shí)現(xiàn)了靶向特異切割。
[0086]Gautschi 等(J.Natl.Cancer Inst.93:463-471, March2001)證實(shí)了一種寡核苷酸在體外和體內(nèi)降低bcl-2和bcl-xL表達(dá)的的能力，該寡核苷酸100%與該bcl-2mRNA互補(bǔ)，并且對(duì)bcl-xL mRNA有3個(gè)錯(cuò)配。更進(jìn)一步，證實(shí)了這種寡核苷酸在體內(nèi)具有強(qiáng)有力的抗癌活性。
[0087]Maher 和Dolnick(Nuc.Acid.Res.16:3341-3358,1988)分別試驗(yàn)了一系列串聯(lián) 14個(gè)核堿基的反義寡核苷酸，以及有28個(gè)和42個(gè)核堿基的反義寡核苷酸，后兩種反義寡核苷酸由2個(gè)或3個(gè)該串聯(lián)反義寡核苷酸的序列組成，用以試驗(yàn)它們阻止人類DHPF在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞試驗(yàn)中轉(zhuǎn)錄的能·力。這三種14個(gè)核堿基反義寡核苷酸中的任意一種單獨(dú)就能抑制轉(zhuǎn)錄，雖然要比28個(gè)或42個(gè)核堿基的反義寡核苷酸的水平更加適度。
[0088]Bhanot等(PCT/US2007/068401)提供了短反義化合物，包括哪些包含化學(xué)修飾的高親和力單體，，其有8-16個(gè)單體的化合物。這些短反義化合物顯示出可用于減少細(xì)胞，組織和動(dòng)物的靶核酸和/或蛋白，提高了效力，改善了治療指數(shù)。短反義化合物在比上述的那些反義化合物劑量低時(shí)就有效果，可以降低毒性和治療成本。此外，所述的短反義化合物有更大的潛力作為口服藥劑。
[0089]雜交
[0090]一旦一個(gè)或多個(gè)靶位點(diǎn)被識(shí)別，就會(huì)選擇與靶足夠互補(bǔ)的寡核苷酸，即足夠好，足夠特異地與靶雜交，以獲得理想的效果。
[0091]在本發(fā)明的內(nèi)容中，“雜交”意指氫鍵，它們可以是互補(bǔ)核苷或核苷酸堿基之間的ffatson-Crick,Hoogsteen或者反向Hoogsteen氫鍵。例如，腺嘌呤與胸腺卩密唳是互補(bǔ)核堿基,它們通過形成氫鍵來配對(duì)。
[0092]在某些實(shí)施例中，雜交發(fā)生在此披露的一種反義化合物與一種核酸之間。雜交最常見的機(jī)理涉及核酸分子的互補(bǔ)核堿基之間的氫鍵。
[0093]雜交過程可以在各不相同的條件下發(fā)生。嚴(yán)格的條件是序列依賴性的，它們是由要雜交的核酸分子的性質(zhì)和組成來決定的。
[0094]確定一個(gè)序列對(duì)于一種靶核酸是否能特異地雜交的方法是業(yè)內(nèi)所熟知的。在一個(gè)實(shí)施例中，在此提供的一種反義化合物與一種核酸是能特異地雜交的。
[0095]互補(bǔ)
[0096]在此說的“互補(bǔ)”指的是兩個(gè)核苷酸之間精確配對(duì)的能力。例如，在寡核苷酸的某一個(gè)位置上的核苷酸能與一種DNA或RNA分子同樣位置上的核苷酸形成氫鍵,則該寡核苷酸與DNA或RNA被認(rèn)為在那個(gè)位置上是互補(bǔ)的。當(dāng)在每個(gè)分子中有足夠數(shù)量的位置被能相互形成氫鍵的核苷酸占據(jù)時(shí)，該寡核苷酸與DNA或者RNA是互補(bǔ)的。因而，“特異地可雜交的”和“互補(bǔ)”是用以表明互補(bǔ)性或者精確配對(duì)充分程度的術(shù)語，以致于在寡核苷酸與DNA或者RNA靶之間產(chǎn)生穩(wěn)定，特異的氫鍵。業(yè)內(nèi)懂得反義化合物的序列不必100%與其特異地可雜交的靶核酸的序列互補(bǔ)。當(dāng)該化合物結(jié)合到靶DNA或RNA分子上去時(shí)，干擾了該靶DNA或RNA分子的正常功能，造成失去了效用，并且有充分程度的互補(bǔ)以避免該反義化合物與非靶序列之間在希望有特異結(jié)合的條件下，即在體內(nèi)試驗(yàn)或者治療處理中的生理?xiàng)l件下，以及在體外的試驗(yàn)中的試驗(yàn)條件下有非特異的結(jié)合，則一種反義化合物是特異地可雜交的。
[0097]本發(fā)明的與靶雜交并抑制該靶表達(dá)的反義和其他化合物是通過實(shí)驗(yàn)來識(shí)別的，在下文中這些化合物的序列作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例被識(shí)別。與這些優(yōu)選的序列互補(bǔ)的靶位點(diǎn)在下文中被稱之為“活性位點(diǎn)”，因此，它們是優(yōu)選的靶向位點(diǎn)。所以，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例包含與這些活性位點(diǎn)雜交的化合物。
[0098]當(dāng)反義化合物有足夠數(shù)量的核堿基能與靶核酸相應(yīng)的核堿基形成氫鍵，這樣就產(chǎn)生了合乎理想的效果(例如，反義抑制一種像CTGF那樣的核酸的靶核酸)，則一種反義化合物與一種靶核酸是互補(bǔ)的。
[0099]在一種反義化合物與一種CTGF核酸之間的非互補(bǔ)的核堿基可以被容許，只要該反義化合物保持能與靶核酸特異地雜交。另外，反義化合物可以越過CTGF核酸的一個(gè)或多個(gè)片段來進(jìn)行雜交，這樣一來，介于中間的或鄰接的片段就不會(huì)參與到雜交過程中(例如，一種環(huán)結(jié)構(gòu)，錯(cuò)配或者發(fā)夾結(jié)構(gòu))。
[0100]在一個(gè)實(shí)施例中，在此提供的反義化合物至少70%，至少75%，至少80%，至少85 %，至少90 %，至少95 %，至少96 %，至少97 %，至少98 %，或至少99 %與一種CTGF核酸互補(bǔ)。可以采用常規(guī)方法來確定一種反義化合物與一種靶核酸互補(bǔ)的百分程度。
[0101]例如，一種反義化合物有20個(gè)核堿基，其中的18個(gè)與一種靶核酸互補(bǔ)，因而，它將會(huì)特異地雜交，將會(huì)代表了 90%的互補(bǔ)度。在該實(shí)施例中，剩下的非互補(bǔ)的堿基可以被群集成簇或者與互補(bǔ)的核堿基散布開來，不必相互鄰接或者與互補(bǔ)的核堿基鄰接。同樣地，一種其長度為18個(gè)核堿基的反義化合物有4個(gè)非互補(bǔ)的核堿基，這4個(gè)非互補(bǔ)的核堿基與兩個(gè)完全與靶核酸互補(bǔ)的區(qū)域側(cè)面相接，該反義化合物應(yīng)當(dāng)會(huì)有77.8%總的互補(bǔ)度，因而位于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。一種反義化合物與靶核酸的一個(gè)區(qū)域的百分互補(bǔ)度的確定可以例行米用業(yè)內(nèi)知曉的 BLAST 程序(basic local alignment search tools)和 PowerBLAST 程序(Altschul et al., J.Mol.Biol.1990,215,403-410 ；Zhang and Madden, Genome Res.,1997,7,649-656)。百分同源性,序列一致性或互補(bǔ)度可以通過例如，Gap程序(Wisconsin序列分析軟件包，Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University ResearchPark,Madison Wis.),采用默認(rèn)設(shè)置來確定，它是利用Smith和Waterman算法(Adv.Appl.Maath.,1981,2,482-489)。
[0102]在其他的實(shí)施例中，在此提供的反義化合物與靶核酸完全互補(bǔ)(即100%互補(bǔ))。例如，反義化合物可以完全與CTGF核酸互補(bǔ)，或者是它的一個(gè)靶部分，或者一個(gè)靶片段或靶序列互補(bǔ)。在此所說的“完全互補(bǔ)”指的是反義化合物的每個(gè)核堿基能與靶核酸相應(yīng)的核喊基精確喊基配對(duì)。
[0103]非互補(bǔ)的核堿基可以位于反義化合物的5’端或3’端。或者，非互補(bǔ)的一個(gè)或多個(gè)核堿基可以位于反義化合物里邊的位置。當(dāng)有兩個(gè)或更多個(gè)非互補(bǔ)的核堿基存在時(shí)，他們可以鄰接(即連接的)或者不鄰接的。在一個(gè)實(shí)施例中，一個(gè)非互補(bǔ)的核堿基位于gapmer反義寡核苷酸的翼段。
[0104]在一個(gè)實(shí)施例中，長度達(dá)20個(gè)核堿基的反義化合物包含不多于4個(gè)，不多于3個(gè)，不多于2個(gè)，不多于I個(gè)的相對(duì)于如CTGF核酸那樣的靶核酸的非互補(bǔ)核堿基。
[0105]在另外一個(gè)實(shí)施例中，長度達(dá)30個(gè)核堿基的反義化合物包含不多于6個(gè)，不多于5個(gè)，不多于4個(gè)，不多于3個(gè)，不多于2個(gè)，不多于I個(gè)的相對(duì)于如CTGF核酸那樣的靶核酸的非互補(bǔ)核堿基。
[0106]在此提供的反義化合物也包括那些與靶核酸的一部分互補(bǔ)的反義化合物。在此所說的“部分”指的是在靶核酸的一個(gè)區(qū)域或片段內(nèi)規(guī)定數(shù)量的鄰接的(即連接的)核堿基。一個(gè)“部分”也可以指一種反義化合物的定義數(shù)量的鄰接核堿基。在一個(gè)實(shí)施例中，該反義化合物與靶片段的一個(gè)至少有8個(gè)核堿基的部分互補(bǔ)。在另外一個(gè)實(shí)施例中，該反義化合物與祀片段的一個(gè)至少有12個(gè)核堿基的部分互補(bǔ)。在還有一個(gè)實(shí)施例中，該反義化合物與靶片段的一個(gè)至少有15個(gè)核堿基的部分互補(bǔ)。還注視到那些反義化合物，其與靶片段的一個(gè)至少有9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19,20個(gè)或更多個(gè)核堿基的部分，或者由任意兩個(gè)這些數(shù)值所規(guī)定的范圍互補(bǔ)。
[0107]一致性
[0108]在此提供的反義化合物也可以有一個(gè)明確表示的對(duì)于一個(gè)特定核苷酸序列，SEQID NO，或者用一個(gè)特定Isis號(hào)碼代表的化合物的百分一致性。如果一種反義化合物具有同樣的核堿基配對(duì)能力，在在此就說它與在此披露的系列一致。例如，一種RNA含有尿嘧啶代替了披露出的DNA序列中的 胸腺嘧啶脫氧核苷，該RNA則應(yīng)該被認(rèn)為與該DNA序列一致，因?yàn)槟蜞奏ず托叵汆奏っ撗鹾塑斩寂c腺嘌呤配對(duì)。也注視到在此描述的反義化合物截短的或伸長的版本，以及具有與在此提供的反義化合物不一致的堿基的化合物。不一致的堿基可以互相鄰接或者分散在整個(gè)反義化合物中。反義化合物的百分一致性是按照具有的同一堿基配對(duì)的堿基數(shù)目相對(duì)于與之相比較的序列來計(jì)算。
[0109]在一個(gè)實(shí)施例中，反義化合物至少70 %，75 %，80 %，85 %，90 %，95 %，96 %，97 %，98%，99%，或100%與在此披露的一個(gè)或更多個(gè)反義化合物，或者SEQ ID NOs，或者它們得一個(gè)部分一致。
[0110]修飾
[0111]在本發(fā)明的某實(shí)施例中，對(duì)于反義化合物的修飾包含取代或者對(duì)核苷之間的連接，糖組成部分，或核堿基的改變。
[0112]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，該化合物包含至少一項(xiàng)修飾，該修飾選自修飾的核苷間連接，修飾的糖，和修飾的核堿基組成的一組。
[0113]雖然可以采用含有各種各樣修飾核苷間連接的反義寡核苷酸，目前優(yōu)選的修飾核苷間連接是一種在一個(gè)或多個(gè)核苷之間的硫代磷酸酯(phosphothioate)連接,或者,其中所有的核苷間連接都是硫代磷酸酯核苷間連接。一般地，也優(yōu)選含有至少一個(gè)，而且典型地多于一個(gè)的修飾糖的反義寡核苷酸，其特征在于該糖是一種二環(huán)糖。盡管可以采用各種各樣的修飾糖，現(xiàn)在還是優(yōu)選采用2’ -O-甲氧基乙基糖。
[0114]更進(jìn)一步，包含在反義寡核苷酸中的至少一個(gè)，而且典型地多于一個(gè)的核堿基將是一種修飾的核苷酸，像5-甲基胞嘧啶。
[0115]核苷是一種堿-糖的結(jié)合物。核苷的核堿基(也稱之為堿基)部分通常是一個(gè)雜環(huán)堿基組成部分。核苷酸是進(jìn)一步還包括一個(gè)共價(jià)地鍵合在核苷的糖的部分的磷酸酯基的核苷。對(duì)于那些包括五元呋喃(pentofuranosyl)糖的核苷,該磷酸酯基可以連接在該糖的2’，3’或5’ -位羥基組成部分上。寡核苷酸是通過相鄰核苷互相共價(jià)連接以形成線性多聚的寡核苷酸來形成的。在寡核苷酸結(jié)構(gòu)內(nèi)，磷酸酯基通常被稱之為形成了寡核苷酸的核苷間的連接。
[0116]對(duì)反義化合物的修飾包含取代或者改變核苷之間的連接,糖組成部分,或核堿基。經(jīng)過修飾的反義化合物往往優(yōu)于原來的形態(tài)，這是因?yàn)榫哂泻虾趵硐氲男再|(zhì)，像增強(qiáng)的細(xì)胞攝入，與核酸靶 之間增強(qiáng)的親和力，以及核酸酶(nucleases)的存在下的穩(wěn)定性提高，或者抑制活性的提聞。
[0117]也可以采用化學(xué)修飾核苷來提高截短的或缺失的反義寡核苷酸對(duì)于其靶核酸的結(jié)合親和力。因此，經(jīng)常能獲得具有那樣的化學(xué)修飾核苷的較短的反義化合物的可比較的結(jié)果。
[0118]修飾的核苷酸間連接
[0119]天然存在的RNA和DNA的核苷間連接是一種3’到5’的磷酸二酯鍵。通常選擇具有一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的，即非天然存在的核苷間連接的反義化合物，而非選擇具有天然存在的核苷間連接的反義化合物，這是由于其合乎理想的性質(zhì)，像增強(qiáng)的細(xì)胞攝入，與核酸靶之間增強(qiáng)的親和力，以及核酸酶的存在下的穩(wěn)定性提高。
[0120]具有修飾的核苷間連接的寡核苷酸包括保留一個(gè)磷原子的核苷間連接以及沒有一個(gè)磷原子的核苷間連接。有代表性的含磷核苷間連接包括，但不限于磷酸二酯，磷酸三酯，甲基磷酸酯(methylphosphonates),氨基磷酸酯(phosphoramidate),和硫代磷酸酯。制備含磷和不含磷的連接的方法是大家熟知的。
[0121]在一個(gè)實(shí)施例中，靶向CTGF核酸的反義化合物包含一個(gè)或多個(gè)修飾核苷間連接。在一些實(shí)施例中，修飾核苷間連接是硫代磷酸酯鍵。在其他實(shí)施例中，反義化合物的每個(gè)核苷間連接是硫代磷酸酯鍵。
[0122]如業(yè)內(nèi)所知，核苷是一種堿-糖的結(jié)合物。核苷的堿基部分通常是一個(gè)雜環(huán)堿基。兩類最普通的這樣的雜環(huán)堿基是嘌呤類和嘧啶類。核苷酸是進(jìn)一步還包括一個(gè)共價(jià)地鍵合在核苷的糖的部分的磷酸酯基的核苷。對(duì)于那些包括五元呋喃糖的核苷，該磷酸酯基可以鍵合在該糖的2’，3’或5’ -位羥基組成部分上。在形成寡核苷酸時(shí)，磷酸酯基通過相鄰核苷互相共價(jià)連接以形成一種線型聚合物。隨后，該線型聚合物結(jié)構(gòu)的各端可以連接起來形成一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)，但是，一般優(yōu)選開放的線型結(jié)構(gòu)。在寡核苷酸結(jié)構(gòu)內(nèi)，該磷酸酯基常被稱之為形成了寡核苷酸的核苷間的骨架。RNA和DNA正常的連接或骨架是一種3’到5’的磷酸二酯鍵。
[0123]可用于本發(fā)明的優(yōu)選的反義化合物的特別的例子包括包含有修飾骨架或非天然核苷間連接的寡核苷酸。如在本說明書中所定義，具有修飾骨架的寡核苷酸包括那些骨架中保留有一個(gè)磷原子以及骨架中沒有一個(gè)磷原子的骨架。為了本說明書的目的，以及有時(shí)業(yè)內(nèi)所參考，在其核苷間骨架中沒有一個(gè)磷原子的修飾的寡核苷酸也被認(rèn)為是寡核苷。
[0124]優(yōu)選的修飾寡核苷酸骨架包括但不限于，例如硫代磷酸酯類，手性硫代磷酸酯類，二硫代磷酸酯類，磷酸三酯類，氨燒基磷酸三酯類(aminoalkylphosphotriesters),磷酸甲酯和其他的烷基酯類，包括3’ -亞烷基(alkylene)磷酸酯類，5’ -亞烷基磷酸酯類和手性磷酸酯類，次磷酸酯類(phosphinates)，氨基磷酸酯類，包括3’ -氨基氨基磷酸酯和氨基燒基氨基磷酸酯類(aminoalkylphosphoramidates),硫羰氨基磷酸酯類(thiono-phosphoramidates)，硫擬憐酸燒基酯類(thionoalkylphosphonates)，硫擬憐酸燒基三酯類(thionoalkylphospho-triesters),硒代憐酸酯類(selenophosphates)和硼代磷酸酯類(boranophosphates),上述這些酯類具有正常3’_5’連接,這些化合物的2’_5’結(jié)合類似物，以及那些具有反轉(zhuǎn)極性的化合物，其特征在于，一個(gè)或多個(gè)連接是3’ -3’，5’ -5’或者2’ -2’連接。優(yōu)選的具有反轉(zhuǎn)極性的寡核苷酸在3’ -most核苷酸間的連接上包含單一的3’-3’連接，即一個(gè)單一的反轉(zhuǎn)核苷殘基，它可能是脫堿基的(核堿基丟失或者用一個(gè)羥基來替代)。各種各樣的鹽類，混合的鹽類和游離酸形式也都包括在其中。
[0125]講授上述含磷連接制備方法的有代表性的美國專利包括但不限于，U.S.Pat.Nos:3, 687，808 ;4，469，863 ;4，476，301 ;5，023，243 ;5，177，196 ;5，188，897 ;5，264，423 ；5，276，019 ;5，278，302 ;5，286，717 ;5，321，131 ;5，399，676 ;5，405, 939 ;5，453，496 ；5，455，233 ;5，466，677 ;5，476，925 ;5，519，126 ;5，536，821 ;5，541，306 ;5，550, 111 ；5，563，253 ;5，571，799 ;5，587，361 ;5，194，599 ;5，565，555 ;5，527，899 ;5，721，218 ；5，672，697和5，625，050，它們中的某一些本發(fā)明所共同，這些專利每篇都被結(jié)合于此作為參考。
[0126]優(yōu)選的其中不含磷原子的修飾寡核苷酸骨架具有由短鏈烷基或者環(huán)烷基核苷間連接，混合的雜原子和烷基或環(huán)烷基的核苷間連接，或者一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子或雜環(huán)核苷連接構(gòu)成的骨架。這些還包 括那些具有嗎啉代連接(部分地是由核苷的糖部分形成的)；娃氧燒骨架(siloxane);硫化物(sulfide),亞砜(sulfoxide)和砜(sulfone)骨架；formacetyl 和 thioformacetyl 骨架；亞甲基(methylene) formacetyl 和 thioformacetyl骨架；riboaCetyl骨架；含烯的骨架；氨基磺酸酯骨架；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；及其他具有混合的N，O, S和'CH2成分部分的骨架。
[0127]講授上述寡核苷制備方法的有代表性的美國專利包括但不限于，U.S.Pat.Nos:5，034，506 ;5，166，315 ;5，185，444 ;5，214，134 ;5，216，141 ;5，235，033 ;5，264，562 ；5，264，564 ;5，405，938 ;5，434，257 ;5，466，677 ;5，470，967 ;5，489，677 ;5，541，307 ；5，561，225 ;5，596，086 ;5，602，240 ;5，610，289 ;5，602，240 ;5，608，046 ;5，610，289 ；5，618，704 ;5，623，070 ;5，663，312 ;5，633，360 ;5，677，437 ;5，792，608 ;5，646，269 ；和5，677，439，它們中的某一些本發(fā)明所共有，每個(gè)這些專利都被結(jié)合于此作為參考。
[0128]在其他的優(yōu)選寡核苷酸模擬物中，核苷酸單位的糖和核苷間連接，即骨架，都用新穎的基團(tuán)替代掉。堿基單位保持下來與合適的核酸靶化合物雜交。一種這樣的寡聚化合物，一種已經(jīng)顯示出具有優(yōu)異的雜交性能的寡核苷酸模擬物被稱之為肽核酸(peptidenucleic acid，PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被一個(gè)含酰胺的骨架，特別是，被一個(gè)氨乙基甘氨酸(aminoethylglycine)骨架所替代。核堿基被保留下來，并直接或間接地與骨架酰胺部分的氮雜氮原子(aza nitrogen atoms)相連。講授PNA化合物制備方法的有代表性的美國專利包括但不限于，U.S.Pat.Nos:5，539，082 ;5，714，331 ;和5，719，262，這些專利每篇都被結(jié)合于此作為參考。還可以在Nielsen et al.，Science，1991，254，1497-1500中找到關(guān)于PNA化合物的講授。
[0129]大多數(shù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例是具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸類和具有雜原子骨架的寡核苷類，特別是，上述參考的美國專利U.S.Pat.N0.5，489，677的-CH2-NH-O-CH2-,-CH2-N (CH3)-O-CH2-[稱之為亞甲基(甲基亞氛基)或MMI 骨架]，-CH2-O-N (CH3)-CH2-,-CH2-N(CH3) -N (CH3) _012_和-O-N (CH3) -CH2-CH2-[其中，原本的磷酸酯骨架被表示為-0-P-0-CH2-]，以及上述參考的美國專利U.S.Pat.N0.5，602, 240的酰胺骨架。還優(yōu)選的是上述參考的美國專利U.S.Pat.N0.5，034，506的具有嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的寡核苷酸類。
[0130]修飾糖組成部分
[0131]修飾寡核苷酸類也可以含有一個(gè)或多個(gè)取代的糖組成部分。例如，呋喃糖(furanosyl sugar)環(huán)可以利用多種方法來修飾,包括用取代基來取代,橋聯(lián)以形成一種二環(huán)核酸“BNA”(bicyclic nucleic acid),以及如頒授給Seth等的美國專利U.S.Pat.N0.:7，399, 845中描述的，并全部被結(jié)合于此作為參考的，利用像S或N(R)那樣的雜原子來取代4’-O。其他關(guān)于BNA的例子可見國際專利申請?zhí)朩O 2007/146511的出版物，全部被結(jié)合于此作為參考。
[0132]本發(fā)明的反義化合物可選地可以含有一個(gè)或多個(gè)具有修飾糖組成部分的核苷酸。糖修飾可以賦予反義化合物核酸酶穩(wěn)定性，結(jié)合親和力或者一些其他有益的生物特性。核苷的呋喃糖環(huán)可以利用多種方法來修飾，包`括單不限于:加入一個(gè)取代基，特別是在2’位置上；橋接兩個(gè)不成對(duì)(non-geminal)環(huán)的原子以形成一種二環(huán)核酸(BNA);利用一個(gè)原子或者像-S-，-N(R)_或-C(R1) (R2)那樣的基團(tuán)來取代環(huán)上4’位置的O。修飾糖包括但不限于:取代糖，尤其是具有2’ -F，2’ -OCH2 (2’ -OMe)或者2’ -O (CH2) 2_0CH3 (2’ -O-甲氧基乙基或2’ -Μ0Ε)取代基的2’ -取代糖；以及具有4’ - (CH2) n-0-2’橋接的二環(huán)糖類(BNAs)，其中η = I或η = 2。制備修飾糖的方法是業(yè)內(nèi)人士所熟知的。
[0133]在某些實(shí)施例中，2’ -修飾核苷具有一個(gè)二環(huán)糖組成部分。在某些這樣的實(shí)施例中，該二環(huán)糖組成部分是一種a-D-糖。在某些這樣的實(shí)施例中，該二環(huán)糖組成部分是一種β-D-糖。在某些這樣的實(shí)施例中，該二環(huán)糖組成部分是一種a-L-糖。在某些這樣的實(shí)施例中，該二環(huán)糖組成部分是一種β-L-糖。
[0134]在某些這樣的實(shí)施例中，該二環(huán)糖組成部分包含在2’ -C原子與4’ -C原子間的橋接基團(tuán)。在某些這樣的實(shí)施例中，該橋接基團(tuán)包含從I至8個(gè)連接的雙自由基(biradical)基團(tuán)。在某些實(shí)施例中，該橋接基團(tuán)包含從I至4個(gè)連接的雙自由基基團(tuán)。在某些實(shí)施例中，該橋接基團(tuán)包含2個(gè)或3個(gè)連接的雙自由基基團(tuán)。在某些實(shí)施例中，該橋接基團(tuán)包含2個(gè)連接的雙自由基基團(tuán)。在某些實(shí)施例中，一個(gè)連接的雙自由基基團(tuán)選自-O-, -S-, -N(R1)-, -C(R1) (R2)-, -C(R1) = C(R1)-, -C(R1) = N-, -C ( = NR1)-, -Si (R1)(R2) -，-S ( = 0) 2_，-S ( = 0) -, _C ( = 0)-和-C ( = S)-;式中，每個(gè) Rl 和 R2 是獨(dú)立的，H,羥基，C1-C12烷基，取代的C1-C12烷基，C2-C12鏈烯基，取代的C2-C12鏈烯基，C2-C12炔基，取代的C2-C12炔基，C5-C20芳基，取代的C5-C2tl芳基，雜環(huán)自由基(radical)，取代的雜環(huán)自由基，雜芳基(heteroaryl)，取代的雜芳基，C5-C7脂環(huán)自由基，取代的C5-C7脂環(huán)自由基，鹵素，取代的氧代(-O-)，氨基，取代的氨基，疊氮基(azido)，羧基，取代的羧基，?；〈孽；?，CN,硫輕(thiol),取代的硫輕,磺?；?S( = O)2-H),取代的磺酰基,砜基(sulfoxyl) (S(=O)-H)或取代的砜基(S( = O)-H);而且，每個(gè)取代基各自獨(dú)立的是鹵素，C1-C12烷基，取代的C1-C12燒基，C2-C12鏈烯基，取代的C2-C12鏈烯基，C2-C12炔基，取代的C2-C12炔基，氨基，取代的氨基，?；?，取代的?；珻1-C12氨烷基，C1-C12氨代烷氧基，取代的C1-C12氨烷基，取代的C1-C12氨代烷氧基或者一種保護(hù)基團(tuán)。
[0135]在某些實(shí)施例中，該二環(huán)糖組成部分利用一個(gè)雙自由基基團(tuán)被橋接在2’與4’位置之間，該雙自由基基團(tuán)選自-O-(CH2)P-, -O-CH2-, -O-CH2CH2-, -O-CH(alkyl)-, -NH-(CH2) P-? _N (alkyI) _ (CH2) p_，_0_CH (alkyl) _ (CH (alkyl)) _ (CH2) p-? -NH-O- (CH2)) p-?N(alkyl)-O-(CH2)P-,或者 _0_N(alky)-(CH2)p-，式中的 p 為 1，2，3，4 或者 5，每個(gè)烷基(alkyl)還可以被進(jìn)一步取代。在某些實(shí)施例中，P為1，2或者3。
[0136]一方面，每個(gè)所說的橋接獨(dú)立地是-[C(R1) (R2)Un-, -[C(R1) (R2)]n-Ο-, -C(R1R2)-N(R1)-O-或者-C(R1R2)-O-N(R1)_。另一方面，每個(gè)所說的橋接獨(dú)立地是 4’ _ (CH2) 3_2，，4’ _ (CH2) 2_2，，4，_CH2_0_2，，4，_ (CH2) 2_0_2，，4，-CH2-O-N(R1) _2，和4’ -CH2-N(R1)-0-2’，式中，每個(gè)R1獨(dú)立地是H，一種保護(hù)基團(tuán)或者C1-C12烷基。
[0137]在具有修飾糖組成部分的核苷酸中，核堿基組成部分(天然的，修飾的或者它們二者的結(jié)合)保持與合適的核酸靶雜交。
[0138]在一個(gè)實(shí)施例中，靶向核酸的反義化合物包含一個(gè)或多個(gè)具有修飾糖組成部分的核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，修飾糖組成部分是2’-Μ0Ε。在另外一個(gè)實(shí)施例中，該2’ -MOE修飾核苷酸被配置在一個(gè)gapmer模體中。
[0139]目前優(yōu)選的寡核苷酸在2’位置上包含有以下基團(tuán)之一種:0H;F ；0-, S_,或N-燒基；0-，S-，或N-鏈烯基 ；0-，S-，或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，式中，烷基，鏈烯基和炔基可以是取代的或未取代的C1-Cltl烷基或者C2-Cltl鏈烯基和炔基。特別優(yōu)選的是0[ (CH2)n0] IiiCH3,0 (CH2) nOCH3,0 (CH2) nNH2，O (CH2) nCH3,0 (CH2) nONH2,和 0 (CH2) nON[ (CH2) nCH3] 2，式中的n和m為從I至10左右。其他優(yōu)選的寡核苷酸包含如下的在2’位置上的基團(tuán)之一種:C1-C5低碳烷基，取代的低碳烷基，鏈烯基，炔基，烷芳基，芳烷基，O-烷芳基或者O-芳烷基，SH, SCH3, 0CN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2,雜環(huán)烷基，雜環(huán)烷芳基，氨烷基氨基，多烷基氨基，取代的甲硅烷基，RNA切割基團(tuán)，報(bào)道基團(tuán)(reporter group)，嵌入劑，改善寡核苷酸藥物動(dòng)力學(xué)性能的基團(tuán)，或者改善寡核苷酸藥效學(xué)性能的基團(tuán)，以及其他具有相同性質(zhì)的取代基團(tuán)。一種優(yōu)選的修飾包括2’ -甲氧基乙氧基(2’ -O-CH2CH2OCH3,也稱為 2’ -0-(2-甲氧基乙基)或者 2’ -Μ0Ε) (Martin et al.，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504),即一種燒氧基燒氧基基團(tuán)(alkoxyalkoxy)。還有一種修飾包括2’-二甲氨基氧乙氧基，即一個(gè)O(CH2)2ON(CH3)2，也稱為2’-DMA0E，以及2’- 二甲氨基乙氧基乙氧基(業(yè)內(nèi)也稱之為2’ 二甲氛基乙氧基乙基，或者2’ -DMAE0E)，即2’ -O—CH2—O—CH2一N(CH2)2。還有一個(gè)優(yōu)選的修飾包括二環(huán)核酸(也稱之為鎖定的核酸類(locked nucleic acids,LNAs))，其中2’ -羥基連接在糖環(huán)3’或4’的碳原子上形成一個(gè)雙環(huán)的糖組成部分。鍵合優(yōu)選橋接2’氧原子與4’碳原子的亞甲基(一CH2--)n，其中η為I或2，包括α-L-亞甲基氧(a-L-MethyIeneoxy) (4，-CH2-0_2，)ΒΝΑ, β-D-亞甲基氧(4，-CH2-0_2，)BNA 和亞乙基氧(Ethyleneoxy) (4，-(CH2)2H )BNA。二環(huán)修飾糖也包括(6，S)_6’ 甲基 BNA，氨基氧(Aminooxy) (4，_CH2_0_N(R)_2’ )BNA,氧氣基(Oxyamino) (4，_CH2_N(R)_0_2’ )BNA,式中，R獨(dú)立地是H，一種保護(hù)基團(tuán)，或者C1-C12烷基。LNAs也與互補(bǔ)的DNA，RNA或LNA以高的熱親和力形成雙鏈體。圓二色性(Circular dichroism,⑶)光譜顯示涉及完全修飾的LNA (特別是LNA: RNA)的雙鏈體在結(jié)構(gòu)上類似一種A型的RNA: RNA雙鏈體。對(duì)一種LNA: DNA雙鏈體的核磁共振(Nuclear magnetic resonance,NMR)檢驗(yàn)肯定了 LNA單體的3’ -內(nèi)向(3’-endo)構(gòu)象。雙鏈DNA的識(shí)別也已經(jīng)證實(shí)了假定的LNA鏈入侵。關(guān)于錯(cuò)配序列的研究顯示LNAs遵循Watson-Crick堿基配對(duì)規(guī)則，與相應(yīng)的未修飾的參照鏈相比,它的選擇性一般較高。
[0140]LANs中的2’ -羥基與糖環(huán)的4’碳原子連接，形成2’ -C，4’ -C-氧亞甲基連接，如此形成了一個(gè)二環(huán)糖組成部分。反應(yīng)該連接可以是橋接2’氧原子與4’碳原子的亞甲基(-012-)11，其中11為1或2(51叩11 et al.，Chem.Commun.，1998，4，455-456)。LNA 和 LNA 類似物表現(xiàn)出非常高的與互補(bǔ)的DNA和RNA的雙鏈體熱穩(wěn)定性(Tm = +3-+10°C )，抗3’ -外切核苷酸(3' -exonucleolytic)降解的穩(wěn)定性以及良好的溶解性。其他優(yōu)選橋接集團(tuán)包括2’ -脫氧-2’ -CH20CH2-4’橋接。關(guān)于LNAs及其制備可見國際專利申請N0.WO 98/39353和TO99/14226的出版物。
[0141]其他優(yōu)選的修飾包括2’ -甲氧基(2’ -O-CH3)，2’ -氨丙氧基(2’ -OCH2CH2CH2NH2)，2’ -烯丙基(2’ -CH2-CH = CH2)，2’ -O-烯丙基(2’ -O-CH2-CH = CH2)和 2’ -氟(2’ -F)。2’-修飾可以在阿糖(arabino)(上邊)位置 或者在核糖(ribo)(下邊)位置。優(yōu)選的2’ -阿糖修飾是2’ -F。也可以在寡核苷酸的其他位置上進(jìn)行類似的修飾，尤其是在3’末端核苷酸上或者在2’ -5’連接的寡核苷酸中的糖的3’位上，以及5’末端核苷酸的5’位置上。寡核苷酸也可以具有糖模擬物或者替代物(有時(shí)指的是DNA類似物)，像環(huán)丁基組成部分來替代五元呋喃糖。講授這樣的修飾糖結(jié)構(gòu)制備方法的有代表性的美國專利包括但不限于，U.S.Pat.Nos:4，981，957 ;5，118，800 ;5，319，080 ;5，359，044 ;5，393，878 ;5，446，137 ；5，466，786 ;5，514，785 ;5，519，134 ;5，567，811 ;5，576，427 ;5，591，722 ;5，597，909 ；5，610，300 ;5，627，053 ;5，639，873 ;5，646，265 ;5，658，873 ;5，670，633 ;5，792，747 ；和5，700，920，它們中的某一些為本申請所共有，每個(gè)這些專利都被結(jié)合于此作為參考。在某些實(shí)施例中，核苷的修飾是把核糖基環(huán)用替代物環(huán)系統(tǒng)，像嗎啉代環(huán)，環(huán)己烯基環(huán)，環(huán)己基環(huán)或者四氫吡喃基環(huán)來代替，例如有如以下結(jié)構(gòu)式中的一種:
[0142]
HO--v^O^HO^s^O、

HO' ￡ Βχ ΗΟ'、.^^Βχ
FOCH3
[0143]業(yè)內(nèi)也知曉許多其他的二環(huán)和三環(huán)的糖替代物環(huán)系統(tǒng)可以用于修飾核苷，以結(jié)合到反義化合物中去(見綜述文章，例如:Leumann, Christian J.,)。這樣的環(huán)系統(tǒng)可以經(jīng)歷各種各樣另外的取代反應(yīng)來增強(qiáng)其活性。
[0144]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，該化合物包含至少一個(gè)四氫吡喃修飾核苷，其中，一個(gè)四氫吡喃環(huán)取代了呋喃糖環(huán)。[0145]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，其中至少一個(gè)四氫吡喃修飾核苷的每一個(gè)具有結(jié)
構(gòu):
[0146]
【權(quán)利要求】
1.一種化合物，它包含由12-30個(gè)連接的核苷所組成的修飾寡核苷酸，在選自SEQIDNO:9 的核苷酸 718-751，1388-1423，1457-1689，2040-2069，2120-2147，2728-2797，2267-2301,553-611,1394-1423，1469-1508，1559-1605，1659-1689，2100-2129 及1399-1423的區(qū)域內(nèi)至少存在它的一個(gè)12個(gè)核堿基序列的部分。
2.一種化合物，它包含由12-30個(gè)連接的核苷所組成的修飾寡核苷酸，在SEQ ID NO:28，30，39，40，43，44，45，50，51，52，56，78，125和166中提出的核堿基序列中至少存在它的一個(gè)具有12個(gè)核堿基序列的部分。
3.如權(quán)利要求第2項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，該修飾寡核苷酸由20個(gè)連接的核苷所組成。
4.一種化合物，它包含由至少12個(gè)連接的核苷所組成的修飾寡核苷酸，在SEQ ID NO:28，30，39，40，43，44，45，50，51，52，56，78，125和166中提出的核堿基序列中存在它的核堿基序列部分。
5.如權(quán)利要求第4項(xiàng)所述的化合物,其特征在于,該修飾寡核苷酸由至少14個(gè)連接的核苷所組成。
6.如權(quán)利要求第1-5項(xiàng)的任意一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，該修飾寡核苷酸為單鏈寡核苷酸。
7.如權(quán)利要求第1-5項(xiàng)的任意一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，該修飾寡核苷酸為雙鏈寡核苷酸。
8.如權(quán)利要求第1-7項(xiàng)的任意一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，該修飾寡核苷酸具有一個(gè)序列，在其整個(gè)長度上，它與 SEQ ID NO:28，30，39，40，43，44，45，50，51，52，56，78，125和166中提出的序列之一的一個(gè) 部分100%完全一致。
9.如權(quán)利要求第1-8項(xiàng)的任意一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，該修飾寡核苷酸至少包含一個(gè)修飾的核苷間的連接。
10.如權(quán)利要求第9項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，至少一個(gè)修飾的核苷間的連接為硫代磷酸酯核苷間的連接。
11.如權(quán)利要求第10項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，所有修飾的核苷間的連接為硫代磷酸酯核苷間的連接。
12.如權(quán)利要求第1-7項(xiàng)的任意一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，至少一個(gè)核苷包含修飾的糖。
13.如權(quán)利要求第12項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，該修飾的糖為一種二環(huán)糖。
14.如權(quán)利要求第12項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，至少一種該修飾的糖包含2’-0_甲氧基乙基。
15.如權(quán)利要求第1-7項(xiàng)的任意一項(xiàng)所述的化合物，包含至少一個(gè)四氫吡喃修飾的核苷，其特征在于，一個(gè)四氫吡喃環(huán)替代了呋喃糖環(huán)。
16.如權(quán)利要求第15項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，每一個(gè)所述化合物的至少一個(gè)四h°^°^氫吡喃修飾的核苷具有結(jié)構(gòu):
VO: Bx
F 其特征在于，Bx為可選的被保護(hù)的雜環(huán)堿基部分。
17.如權(quán)利要求第1-7項(xiàng)的任意一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，至少一個(gè)核苷包含修飾的核堿基。
18.如權(quán)利要求第17項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，該修飾的核堿基為5’-甲基胞嘧啶。
19.如權(quán)利要求第1-7項(xiàng)的任意一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，該修飾的寡核苷酸包含: (a)由連接的脫氧核苷組成的缺口片段； (b)由連接的修飾的核苷組成的5’翼片段； (c)由連接的修飾的核苷組成的3’翼片段； 其特征在于，該缺口片段位于該5’翼片段和該3’翼片段之間，其特征還在于每個(gè)翼片段之中的每個(gè)修飾的核苷包含修飾糖。
20.如權(quán)利要求第19項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，該修飾的寡核苷酸包含: (a)由13個(gè)連接的脫氧核苷組成的缺口片段； (b)由2個(gè)連接的修飾的核苷組成的5’翼片段； (c)由5個(gè)連接的修飾的核苷組成的3’翼片段； 其特征在于，該缺口片段位于該5’翼片段和該3’翼片段之間，其特征在于每個(gè)翼片段之中的每個(gè)修飾的核苷包含2’ -O-甲氧基乙基糖；其特征還在于，每個(gè)核苷間的連接為硫代磷酸酯連接。
21.如權(quán)利要求第1-20項(xiàng)的任意一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，該修飾的寡核苷酸由20個(gè)連接的核苷組成。
22.如權(quán)利要求第1-21項(xiàng)的任意一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，該核堿基序列為SEQID NO:39所提出的序列。
23.如權(quán)利要求第1-21項(xiàng)的任意一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，該核堿基序列為SEQID NO:40所提出的序列。
24.如權(quán)利要求第1-21項(xiàng)的任意一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，該核堿基序列為SEQID NO:45所提出的序列。
25.如權(quán)利要求第1-21項(xiàng)的任意一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，該核堿基序列為SEQID NO:52所提出的序列。
26.如權(quán)利要求第1-21項(xiàng)的任意一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，該核堿基序列為SEQID NO:166所提出的序列。
27.一種組合物，它含有包含連接的核苷的修飾寡核苷酸，它的核堿基序列為SEQIDNO:28，30，39，40，43，44，45，50，51，52，56，78，125 和 166 中所提出的序列，或者是其鹽，還含有藥用可接受的載體或稀釋劑。
28.如權(quán)利要求第1-21項(xiàng)的任意一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，該核堿基序列在SEQID N0:9的核苷酸范圍內(nèi)(例如，1388-1423，A-B，C-D，及E-F) 100%互補(bǔ)，只要先前設(shè)計(jì)的寡核苷酸不在該范圍內(nèi)。
29.如權(quán)利要求第28項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，該修飾寡核苷酸為單鏈寡核苷酸。
30.如權(quán)利要求第28項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，該修飾寡核苷酸為雙鏈寡核苷酸。
31.如權(quán)利要求第28-30項(xiàng)的任意一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，該修飾寡核苷酸由20個(gè)連接的核苷組成。
32.—種抑制結(jié)締組織生長因子在細(xì)胞或組織中表達(dá)的方法，它包括使該細(xì)胞或組織在結(jié)締組織生長因子的表達(dá)被抑制的條件下與如權(quán)利要求第1-31項(xiàng)的任意一項(xiàng)所述的化合物接觸。
33.一種治療患有與結(jié)締組織生長因子的表達(dá)有關(guān)的疾病或狀況的動(dòng)物的方法，它包括給該動(dòng)物施加 一定量的如權(quán)利要求第1-31項(xiàng)的任意一項(xiàng)所述的化合物，有效地抑制結(jié)締組織生長因子的表達(dá)，以治療該動(dòng)物。
34.如權(quán)利要求第33項(xiàng)所述的方法，其特征在于，該疾病或狀況為過度增生病癥。
35.如權(quán)利要求第34項(xiàng)所述的方法，其特征在于，該過度增生病癥為癌癥。
36.如權(quán)利要求第33項(xiàng)所述的方法，其特征在于，該疾病或失調(diào)為纖維變性病。
37.如權(quán)利要求第36項(xiàng)所述的方法，其特征在于，該纖維變性病為瘢痕肥大，瘢痕疙瘩，皮膚瘢痕，肝纖維化，肺纖維化，腎纖維化，心纖維化，或者再狹窄。
38.如權(quán)利要求第33項(xiàng)所述的方法，其特征在于，該疾病或失調(diào)為關(guān)節(jié)纖維化(包括凍結(jié)肩綜合癥，腱和外周神經(jīng)損傷)，脊髓損傷，冠狀動(dòng)脈搭橋，腹部和腹膜粘連(包括子宮內(nèi)膜異位癥，子宮平滑肌瘤和纖維瘤)，角膜放射狀切開術(shù)和角膜光反射狀切開術(shù)，視網(wǎng)膜再附著手術(shù)，器械介導(dǎo)的纖維變性(例如在糖尿病中)，腱粘連，掌攣縮病，或者硬皮病。
39.一種在需要時(shí)減少受試者因傷口愈合引起的瘢痕的方法，它包括給該受試者施加一定量的如權(quán)利要求第1-32項(xiàng)的任意一項(xiàng)所述的化合物，有效地抑制結(jié)締組織生長因子的表達(dá)以減少受試者因傷口愈合引起的瘢痕。
40.如權(quán)利要求第39項(xiàng)所述的方法，其特征在于，傷口愈合為選自由皮膚破損，手術(shù)切口，和燒傷組成的這一組的傷口的愈合。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK103429270SQ200980133819
【公開日】2013年12月4日 申請日期:2009年8月25日 優(yōu)先權(quán)日:2008年8月25日
【發(fā)明者】尼古拉斯·M·迪恩, J·戈登·?？怂? 尼爾·歐唐奈, C·弗蘭克·本尼特, 蘇珊·M·弗賴爾 申請人:?？怂估椎轮扑幱邢薰? Isis制藥有限公司