專(zhuān)利名稱(chēng)：裂解多種血清型豬鏈球菌的裂解酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域的裂解酶的制備方法，具體是一種能夠裂解多種血清型豬 鏈球菌的裂解酶的制備方法。
背景技術(shù)：
豬鏈球菌病是一種人獸共患傳染病，能導(dǎo)致仔豬患腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎 、肺炎和人的腦膜炎。豬鏈球菌2型流行最廣，對(duì)豬的致病力也最強(qiáng)，對(duì)相關(guān)從業(yè)人員的生 命安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。裂解酶是由噬菌體基因組編碼，能夠水解細(xì)菌細(xì)胞壁的酶。噬菌體裂 解酶像噬菌體一樣僅攻擊細(xì)菌，而不影響動(dòng)物細(xì)胞，并具有較高的特異性，因此該酶不影響 無(wú)害或有益的動(dòng)物寄生菌。 一般認(rèn)為，裂解酶作用于細(xì)菌的速度極快，以致于細(xì)菌不會(huì)對(duì)該 酶產(chǎn)生抗性。噬菌體的裂解酶有比噬菌體更為廣泛的抗菌譜。所以，裂解酶作為新型抗菌藥 物具有一定的優(yōu)勢(shì)。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，王麗平、陸承平、唐家琪在《微生物學(xué)報(bào)》2004年第 44巻第6期第794 799頁(yè)發(fā)表了 "32種抗菌藥物對(duì)臨床分離豬源鏈球菌的體外抗菌活性"， 文中提及，從豬場(chǎng)分離的豬鏈球菌對(duì)32種抗菌藥物的耐藥性的研究結(jié)果顯示，臨床分離菌株 以耐藥菌為主，且大都呈多重耐藥，尤其對(duì)磺胺類(lèi)藥物、林可胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi) 、氨基甙類(lèi)藥物的耐藥性最為嚴(yán)重，耐藥不僅普遍，且多為高度耐藥，尋找另一種抗菌機(jī)制 或抗菌藥物顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種裂解多種血清型豬鏈球菌的裂解酶的 制備方法。本發(fā)明通過(guò)原核表達(dá)豬鏈球菌烈性噬菌體(SMP)的裂解基因，獲得純化的有活 性的裂解酶，它可在體外對(duì)多種豬鏈球菌有裂解作用；本發(fā)明的方法制得的裂解酶能裂解多 種血清型豬鏈球菌。
本發(fā)明是通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括如下步驟
步驟一，純化豬鏈球菌2型烈性噬菌體，提取噬菌體的DNA;
步驟二，以步驟一所得DNA為模板，PC財(cái)廣增裂解酶基因；
步驟三，原核表達(dá)步驟二擴(kuò)增所得DNA，得到融合蛋白；
步驟四，純化融合蛋白，復(fù)性，得到裂解酶。步驟三中，所述原核表達(dá)采用的質(zhì)粒是pET-28a ( + )。
步驟四中，所述裂解酶的使用條件具體為在裂解酶的反應(yīng)體系中加入e-巰基乙醇， 使得e -巰基乙醇的最終的體積分?jǐn)?shù)為o. 8%。
步驟四中，所述裂解酶的使用條件具體為在裂解酶的反應(yīng)體系中加入半胱氨酸，使得 半胱氨酸的最終濃度為10mM。
步驟四中，所述裂解酶使用的緩沖液為PH為5. 2醋酸鈉緩沖液。 步驟四中，所述裂解酶的作用溫度為37'C。
本發(fā)明利用PC財(cái)廣增豬鏈球菌烈性噬菌體(SMP)的裂解基因，獲得目的片斷，再將目的 片斷與pET-28a ( + )載體連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，獲得一個(gè)分子 量為55kDa的融合蛋白，經(jīng)過(guò)Ni柱純化和加入還原劑復(fù)性，得到有活性的裂解酶，獲得的裂 解酶，在體外可對(duì)多株臨床分離的豬鏈球菌有裂解作用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明通過(guò)原核表達(dá)豬鏈球菌烈性噬菌 體(SMP)的裂解基因，獲得純化的有活性的裂解酶，它可在體外對(duì)多種豬鏈球菌有裂解作 用；比較噬菌體與裂解酶的裂解譜發(fā)現(xiàn)，豬鏈球菌烈性噬菌體(SMP)僅能裂解2株豬鏈球菌 2型，但裂解酶可裂解17株豬鏈球菌2型中的15株，此外，還能裂解豬鏈球菌7型SH040805、 9型SH040817，馬獸疫鏈球菌亞種ATCC35246以及金黃色葡萄球菌ATCC25923等。
本發(fā)明中所涉及的菌株大腸桿菌已在《汪玲玲，楊輯，黃誠(chéng)之，王海洪；大腸桿菌 holo-ACP的過(guò)表達(dá)、分離純化及長(zhǎng)鏈脂酰ACP的合成，微生物學(xué)報(bào)，2008,48(7) :963 969》 文獻(xiàn)中公開(kāi)。本發(fā)明涉及的菌株可通過(guò)公開(kāi)市售的商業(yè)渠道取得，如上海天根生物公司，公 司地址上海市漕溪路258弄27號(hào)航星商務(wù)樓1號(hào)樓606室。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，下列事實(shí)例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法、工作原理，通常按照 常規(guī)條件進(jìn)行，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例
一、噬菌體的提純、DNA的制備和裂解酶的表達(dá)
步驟一，取平板上長(zhǎng)成密集相連噬斑的噬菌體SMP (基因組序列已提交GenBank，登錄號(hào) EF116926)，每板加入5mL SM液(噬菌體稀釋液，每升稀釋液的組分為5. 8g NaCl， 2g MgS04 . 7H20， 50mL 1M Tris-Cl， 5mL 2%明膠，余量為水；pH 7.5) ， 4"C搖床晃動(dòng)3小時(shí)， 收集SM液放無(wú)菌離心管4000g離心10分鐘去除細(xì)胞碎片。上清液加入胰DNaseI和RNaseI至終濃度為lyg/mL， 37。C溫育30分鐘。加入NaCl至終濃度lmol/L，冰浴1小時(shí)后，4。C 11000g離 心10分鐘，收集上清。上清液加入PEG 8000至終濃度10%室溫?cái)嚢枞芙夂蟊?小時(shí)，使噬菌 體顆粒發(fā)生沉淀。4°C 12000g離心10分鐘，棄上清，沉淀的噬菌體顆粒用SM液過(guò)夜重懸。
步驟二，在重懸液中加入20mg/mL蛋白酶K至終濃度50y g/mL， 37。C溫育30分鐘，再加 10。/。SDS至終濃度為0. 5%，混勻后將消化混合物于56。C溫育1小時(shí)，冷卻至室溫。用等體積酚 /氯仿抽提，3000g離心5分鐘將兩相分開(kāi)，將親水相收集至另一個(gè)離心管中。在回收的親水 相中加入3mol/L乙酸鈉至終濃度0. 3mol/L，混勻后加兩倍體積的無(wú)水乙醇輕輕洗滌，13000g 離心2分鐘，棄上清，回收DNA沉淀。用適當(dāng)體積的TE(核酸溶解緩沖液)溶解噬菌體DNA。
步驟三，裂解基因的原核表達(dá)
(1) 豬鏈球菌烈性噬菌體SMP裂解基因的克隆 根據(jù)豬鏈球菌烈性噬菌體SMP的基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PC財(cái)廣增。連接到pMD-18 T載體(
Takara公司)上測(cè)序。所設(shè)計(jì)的引物上游包含EcoR I限制性酶切位點(diǎn)，下游包含Xho I限制 性酶切位點(diǎn)。
(2) 表達(dá)載體的構(gòu)建
EcoR I和Xho I分別酶切PCR產(chǎn)物和pET-28a ( + ) ， T4 DNA連接酶(Takara公司)10 16。C過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a中，37。C過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。用EcoR I和Xho I酶切鑒定。鑒定的陽(yáng)性重組質(zhì)粒測(cè)序。
(3) 融合蛋白的表達(dá)
篩選陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中。挑取l個(gè)菌落接種2ml卡那霉素LB培養(yǎng) 基過(guò)夜培養(yǎng)。取5mL過(guò)夜培養(yǎng)菌液接種lL卡那霉素LB培養(yǎng)基，37°C 200轉(zhuǎn)/分搖菌培養(yǎng)5h，至 OD6oo為0.4 1。加IPTG (異丙基硫代-e-D-半乳糖苷)至終濃度為lmM， 27。C搖菌培養(yǎng)4h后 ，收取菌液。
(4) SDS-PAGE電泳
配制12%的分離膠和5%的濃縮膠，樣品用上樣緩沖液沸水煮4min，濃縮膠電壓80V，分離 膠電壓136V，電泳4 5h，考馬斯亮蘭染色2h。脫色觀察，在55kDa處有明顯的條帶出現(xiàn)。 二、融合蛋白的純化
IPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌lL溶于25mL預(yù)冷的裂解緩沖液(含50mM磷酸鈉緩沖液，pH8.0)，超聲 破碎。8000g離心取上清。以8個(gè)柱體積的裂解緩沖液洗Ni柱，將樣品上至柱內(nèi)，再用預(yù)冷的 裂解緩沖液洗柱，直至0028()<0. 1。用預(yù)冷的清洗緩沖液A(裂解緩沖液加5mM咪唑)洗柱，直 至0028()<0. 1。用預(yù)冷的清洗緩沖液B(裂解緩沖液加20mM咪唑)洗柱，直至0028()<0. 1 。最后用溶出液(裂解緩沖液加250mM咪唑)洗柱，收集洗脫液，即為純化的裂解酶。
三、 裂解酶最佳裂解條件的確定
將豬鏈球菌SS-4 (臨床分離株)離心，重懸于pH5.2的醋酸鈉緩沖液，配成0D630為0.7 1.5的細(xì)菌懸液，加入96孔板中，每孔100yl。 20yg/ml純化的裂解酶中，分別加入O. 5% 、0.8%、 1.0%、 3. 0%和5. 0% (V/V) 6-巰基乙醇，各取100y l加入細(xì)菌混懸液中。每個(gè)濃 度各做3個(gè)重復(fù)，裂解緩沖液作為空白對(duì)照。室溫下反應(yīng)30min后，在600nm處讀取吸光度。
取吸光度減少最大的濃度作為e -巰基乙醇加入的最佳濃度。測(cè)定的最佳濃度為O. 8%。
將豬鏈球菌SS-4 (臨床分離株)離心，重懸于pH5.2的醋酸鈉緩沖液，配成0D6加為0. 7 1.5的細(xì)菌懸液，加入96孔板中，每孔100yl。 20yg/ml純化的裂解酶中，分別加入lmM、 2mM、 4mM、 5mM、 8mM、 10mM、 15mM半胱氨酸，各取IOO y l加入細(xì)菌混懸液中。每個(gè)濃度各做 3個(gè)重復(fù)，裂解緩沖液作為空白對(duì)照。25。C下反應(yīng)30min后，在600nm處讀取吸光度。取吸光 度減少最大的濃度作為半胱氨酸加入的最佳濃度，測(cè)定的最佳濃度為10mM。
分別用20mM pH5. 2醋酸鈉緩沖液、10mM p朋.8磷酸鹽緩沖液、10mM pH7. 2磷酸鹽緩沖液 、20mM pH8. 5 Tris-Cl緩沖液重懸鏈球菌，其余步驟與上面同，測(cè)定最佳反應(yīng)緩沖液為20mM pH5.2醋酸鈉緩沖液。分別在4。C、 18°C、 25°C、 37。C和42。C作用30min，其余步驟與上面同 ，測(cè)定裂解酶最佳反應(yīng)溫度為37'C。
四、 裂解酶對(duì)細(xì)菌的裂解作用測(cè)定
取豬鏈球菌制成OD6oo為1.0的細(xì)菌懸液，與純化的裂解酶混合，室溫下反應(yīng)30min，檢測(cè) OD60o，計(jì)算濁度遞減的百分比。所測(cè)臨床分離的豬鏈球菌菌株的濁度遞減試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)附表l (表l中的菌株均可通過(guò)公開(kāi)的市售渠道獲得)。裂解酶可使豬鏈球菌、馬獸疫鏈球菌亞種 、金黃色葡萄球菌的細(xì)菌濁度下降1.2 68%。表l裂解酶對(duì)各菌株的濁度遞減實(shí)驗(yàn)結(jié)果
細(xì)菌種類(lèi)菌株號(hào)血清型細(xì)菌濁度遞減百分?jǐn)?shù)(％)
豬鏈球菌SS2-3260. 9
ATCC43756252. 5
SS2-1240. 4
05-465237. 7
T15237. 1
19-2(A)235. 8
SS2-4235. 8
5-2229. 2
zy05719211. 3
,801225
HA9802222. 1
HA05729-1218. 4
29216. 8
SS2-H216. 2
ll-l215. 4
SH040805715. 3
SH040817968
馬獸疫鏈球菌亞種ATCC352469. 5
金黃色葡萄球菌ATCC2592310. 7
沙門(mén)氏菌NATSEL01141. 1
大腸桿菌MC10612. 權(quán)利要求
1.一種裂解多種血清型豬鏈球菌的裂解酶的制備方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，純化豬鏈球菌2型烈性噬菌體，提取噬菌體的DNA；步驟二，以步驟一所得DNA為模板，PCR擴(kuò)增裂解酶基因；步驟三，原核表達(dá)步驟二擴(kuò)增所得DNA，得到融合蛋白；步驟四，純化融合蛋白，復(fù)性，得到裂解酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的裂解多種血清型豬鏈球菌的裂解酶的制備方 法，其特征是，步驟三中，所述原核表達(dá)采用的質(zhì)粒是pET-28a ( + )。
3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的裂解多種血清型豬鏈球菌的裂解酶的制備方法，其特征是，步驟四中，所述裂解酶的使用條件具體為在裂解酶的反應(yīng)體系中加入e-巰基乙醇，使得e -巰基乙醇的最終的體積分?jǐn)?shù)為o. 8%。
4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的裂解多種血清型豬鏈球菌的裂解酶的制備方 法，其特征是，步驟四中，所述裂解酶的使用條件具體為在裂解酶的反應(yīng)體系中加入半胱 氨酸，使得半胱氨酸的最終濃度為10mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的裂解多種血清型豬鏈球菌的裂解酶的制備方 法，其特征是，步驟四中，所述裂解酶使用的緩沖液為pH為5.2醋酸鈉緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求l所述的裂解多種血清型豬鏈球菌的裂解酶的制備方 法，其特征是，步驟四中，所述裂解酶的作用溫度為37'C。
全文摘要
一種生物技術(shù)領(lǐng)域的能夠裂解多種血清型豬鏈球菌的裂解酶的制備方法，包括如下步驟步驟一，純化豬鏈球菌2型烈性噬菌體，提取噬菌體的DNA；步驟二，以步驟一所得DNA為模板，PCR擴(kuò)增裂解酶基因；步驟三，原核表達(dá)步驟二擴(kuò)增所得DNA，得到融合蛋白；步驟四，純化融合蛋白，復(fù)性，得到裂解酶。本發(fā)明通過(guò)原核表達(dá)豬鏈球菌烈性噬菌體SMP的裂解基因，獲得純化的有活性的裂解酶，它可在體外對(duì)多種豬鏈球菌有裂解作用；本發(fā)明的方法制得的裂解酶能裂解多種血清型豬鏈球菌。
文檔編號(hào)C12N9/88GK101671662SQ200910309089
公開(kāi)日2010年3月17日 申請(qǐng)日期2009年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日
發(fā)明者孫建和, 琰 王, 陸承平 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)