專利名稱：一種治療膽汁淤積、肝纖維化的藥物及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療膽汁淤積、肝纖維化的藥物；具體地說(shuō)是以中草藥為原料制備的中成藥；另外本發(fā)明還涉及該藥物的制備方法。
背景技術(shù)：
膽汁淤積是膽汁生成障礙以及流動(dòng)停滯或受抑，臨床上以黃疸、瘙癢和血清堿性磷酸酶增高為特征；在許多膽汁淤積相關(guān)的人類肝臟疾病中，有不同程度和方式的膽管上皮細(xì)胞增生。如1.原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是引起成人慢性淤膽最常見(jiàn)的疾病之一，其中期病理特征是匯管區(qū)膽管損害導(dǎo)致其周圍膽小管反應(yīng)性增生，并可向肝實(shí)質(zhì)延伸，增生的膽小管互相交叉吻合，管腔多發(fā)育不全，有的僅見(jiàn)一層扁平或柱狀上皮(Desmet VJ，Roskams T，Van Eyken P.Ductular reaction in the liver.Pathol ResPract，1995，191513-24.)。2.原發(fā)性硬化性膽管炎(Primary sclerosing Cholangitis)也是一種慢性膽汁淤積性疾病，其病變可累及肝外和/或肝內(nèi)膽管，表現(xiàn)為膽管壁的增厚和膽管狹窄，肝臟組織病理學(xué)特點(diǎn)為膽管的纖維化和炎癥及小膽管的增生。慢性肝炎、肝硬化及膽道梗阻患者肝組織活檢標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)肝小葉周圍、纖維隔、肝硬化小節(jié)節(jié)邊緣部常見(jiàn)增生的膽小管、小膽管樣上皮細(xì)胞及膽管樣排列的小肝細(xì)胞和肝細(xì)胞，這些細(xì)胞周圍總是伴隨基底膜增厚、膠原纖維增多，甚至完全纖維化(洪明理，黃向紅，李云生，等.實(shí)驗(yàn)?zāi)懼愿斡不纬蓹C(jī)制的病理研究.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，17(1)36-39.)。藥物性性膽汁淤積主要影響小膽管的上皮細(xì)胞。肝纖維化是多種慢性肝臟疾病共有的病理改變，是慢性肝炎發(fā)展之肝硬化的必經(jīng)病理過(guò)程。
熊去氧膽酸為治療膽汁淤積、尤其是原發(fā)性膽汁性肝硬化早期的有效藥物，對(duì)中后期病變的效果有限，對(duì)其他慢性肝炎、肝硬化的膽汁淤積并無(wú)明確的治療效果。以茵陳、梔子、大黃等為主的中藥制劑為傳統(tǒng)的治療藥物，但均有一定的局限性?；瘜W(xué)及生物藥物中尚無(wú)明確療效的抗肝纖維化治療藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提出一種能有效改善肝臟膽汁淤積、抗肝損傷、逆轉(zhuǎn)肝纖維化的藥物。
本發(fā)明的另一目的是提供該藥物的制備方法。
本發(fā)明的藥物(以下稱“芪甘通”)是由下列組分制成的(用量為重量份)黃芪300-900甘草100-300大棗100-300制備本發(fā)明藥物的配方優(yōu)先重量(份)配比范圍是黃芪400-800甘草150-250大棗150-250本發(fā)明藥物的最佳重量(份)配比是黃芪600甘草200大棗200將上述各組分制成本發(fā)明藥物的方法是將黃芪、甘草細(xì)碎，與大棗一起加水10倍量，浸泡2小時(shí)，煎煮30分鐘，濾過(guò)取汁；藥渣加水8倍量，煎煮1小時(shí)，濾過(guò)取汁，濃縮干燥成干膏，混合粉碎，壓片，即可得治療膽汁淤積、肝纖維化的膏劑藥品。
上述膏劑也可再加工成類似餅干大小的固體塊狀劑型，此時(shí)需要再添加適量的粘結(jié)劑，在負(fù)壓下壓制成型，干燥并以真空方式包裝，即可得到膨松的塊狀劑型。
我們綜合評(píng)價(jià)針對(duì)肝硬化證候病機(jī)的不同治法例方干預(yù)大鼠膽汁淤積性肝纖維化、四氯化碳大鼠肝纖維化以及二甲基亞硝胺大鼠肝纖維化的作用研究中發(fā)現(xiàn)，“芪甘通”對(duì)上述3種動(dòng)物模型均顯示出改善膽汁淤積及減輕肝組織纖維化的作用，對(duì)膽管上皮細(xì)胞增殖這—慢性肝病常見(jiàn)的病理變化具有顯著抑制作用。


圖1是肝組織HE染色(上)及膠原染色(下)照片；圖2是肝組織LM免疫組織化學(xué)照片。
圖3是肝組織FN免疫組織化學(xué)照片。
圖4是肝組織Col I免疫組織化學(xué)照片。
圖5是肝組織Col VI免疫組織化學(xué)照片。
圖6是肝組織α-SMA免疫組織化學(xué)照片。
圖7是透射電鏡下大鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)的變化照片。
圖8是肝組織PCNA免疫組織化學(xué)照片。
圖9是肝組織天狼猩紅膠原染色照片。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
實(shí)施例1將黃芪600克、甘草200克細(xì)碎，與大棗200克一起加水10千克，浸泡2小時(shí)，煎煮30分鐘，濾過(guò)取汁；藥渣加水8千克，煎煮1小時(shí)，濾過(guò)取汁，濃縮干燥成干膏，混合粉碎，壓片，即制得“芪甘通”干浸膏309克。
實(shí)施例2黃芪300克、甘草300克、大棗300克，按照實(shí)施例1所述的方法制得“芪甘通”干浸膏280克。
實(shí)施例3黃芪500克、甘草300克、與大棗200克，按照實(shí)施例1所述的方法制得“芪甘通”干浸膏313克。
實(shí)施例4黃芪500克、甘草100克、大棗300克，按照實(shí)施例1所述的方法制得“芪甘通”干浸膏274克。
實(shí)施例5將黃芪400克、甘草150克、大棗250克，按照實(shí)施例1所述的方法制得“芪甘通”干浸膏240克。
實(shí)施例6黃芪800克、甘草150克、大棗250克，按照實(shí)施例1所述的方法制得“芪甘通”干浸膏371克。
實(shí)施例7黃芪600克、甘草300克、大棗100克，按照實(shí)施例1所述的方法制得“芪甘通”干浸膏301克。
實(shí)施例8黃芪700克、甘草200克、大棗300克，按照實(shí)施例1所述的方法制得“芪甘通”干浸膏352克。
實(shí)施例I(“芪甘通”防治膽汁性大鼠肝纖維化)1 實(shí)驗(yàn)藥物實(shí)施例1-8任一項(xiàng)制備獲得“芪甘通”干浸膏。
2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，雄性，清潔級(jí)，體重200±20g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
3 實(shí)驗(yàn)方法3.1 模型制備選用清潔級(jí)雄性SD大鼠(200±20g)，沿腹正中線切開(kāi)，暴露膽總管，逆行向肝門(mén)部注入硬化劑，遠(yuǎn)近端結(jié)扎膽總管，中間剪斷，關(guān)腹。假手術(shù)僅開(kāi)腹并游離膽總管后關(guān)腹。
3.2 給藥方法及劑量造模一周后隨機(jī)分為模型對(duì)照組和藥物干預(yù)組，藥物干預(yù)經(jīng)口灌胃(干浸膏加入蒸餾水溶解)，模型對(duì)照組給予等量生理鹽水。灌胃劑量1ml/100g(相當(dāng)于65kg體重成人每公斤劑量的8倍)。干預(yù)用藥4周后殺鼠取材。
3.3 樣品的采集和處理用藥4周結(jié)束后，大鼠用2％戊巴比妥鈉以2ml/kg體重劑量腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，打開(kāi)腹腔，觀察大體情況，肝脾的色、質(zhì)、形態(tài)、體積及腹水情況。經(jīng)下腔靜脈采血，摘取肝、脾，稱重后，獲取0.3-0.4cm厚肝組織，OTC液包埋，液氮迅速冷凍，-70℃保存，用于制備冰凍切片；于肝右側(cè)厚葉切取1.0×0.8×0.3cm大小肝組織2塊，10％中性福爾馬林固定，自動(dòng)脫水機(jī)逐級(jí)酒精脫水、二甲苯透明，包埋、切片4um厚，用于HE及膠原染色，觀察組織的病理變化，肝組織纖維化程度，并制定肝組織膠原纖維增生程度的半定量判斷標(biāo)準(zhǔn)及膠原沉積的圖像半定量分析。
3.4 肝功能檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase，ALT)活性，血清門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartateaminotransferase，AST)，賴氏法(Rriman-Frankel)；血清總膽紅素(Totalbilirubin，T-BIL)，J-P法；血清白蛋白(Albumin，Alb)含量溴甲酚綠法(BBG)；血清總蛋白(Total protein，TP)含量雙縮脲比色法；采用衛(wèi)生部上海生物制品研究所試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定；血清堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyltranspetidase，γGT，GGT)按照南京建成生物工程研究所試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定；總膽汁酸(TBA美國(guó)AEROSET公司，Abbott全自動(dòng)生化儀)。
3.5 肝組織羥脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)含量測(cè)定Jamall氏法(Jamall IS，F(xiàn)inelli VN，Que Hee SS.A simple method to determine nanogram levels of 4-hydroxyproline in biological tissues.AnalBiochem 1981；11270-75.)。
3.6 肝組織染色常規(guī)HE染色；天狼猩紅膠原纖維染色3.7 免疫組織化學(xué)染色(兩步法)PBS(pH7.4)作空白對(duì)照染色。
免疫組化圖像半定量分析采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)，免疫組化染色切片每組各取3張，隨機(jī)選擇5個(gè)不同視野，在20×10放大倍數(shù)下，測(cè)定計(jì)算陽(yáng)性區(qū)域與標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量窗口的面積比。
3.8 PCNA陽(yáng)性染色細(xì)胞計(jì)數(shù)PCNA判定以細(xì)胞核呈界限清楚的棕色反應(yīng)為陽(yáng)性。每組各取3張免疫組化片，低倍鏡(×100)下觀察并確定有代表性PCNA染色陽(yáng)性視野，后在高倍鏡(×400)每個(gè)視野分別計(jì)數(shù)PCNA陽(yáng)性膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞，每張組織片觀察5個(gè)視野，取其陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
3.9 膽管上皮細(xì)胞Procollα1(IV)、PDGF-B、CTGF、TGF-β1mRNA的檢測(cè)對(duì)冰凍切片進(jìn)行HE染色后采用LCM顯微切割儀切割膽管上皮細(xì)胞。每組取3只大鼠的肝組織片，切割膽管上皮細(xì)胞1,000個(gè)，計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)數(shù)，在eppendorf的帽子上加5-7μl的RLT溶液，將膽管上皮細(xì)胞收集到帽子上，加入RLT100μl混勻，低溫離心。
膽管上皮細(xì)胞mRNA表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)提取膽管上皮細(xì)胞的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR定量。
4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1 各組大鼠存活率、腹水出現(xiàn)率、體重、肝臟與脾臟重量、肝/體重比值、脾/體重比值及門(mén)靜脈直徑等一般狀況的變化如表1.1、表1.2所示。
自造模開(kāi)始觀察至5周末，模型對(duì)照組死亡率為41％，“芪甘通”組為56.3％；5周末假手術(shù)對(duì)照組大鼠均未見(jiàn)明顯腹水，腹水發(fā)生率模型對(duì)照組為90％，”芪甘通”組為29％(2只均為少量腹水)，顯著低于模型對(duì)照組(P＜0.05)；模型對(duì)照組大鼠的門(mén)靜脈直徑較假手術(shù)對(duì)照組顯著增加(P＜0.01)，“芪甘通”組有所減小，但與模型對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1.1所示。
表1.1 各組大鼠死亡率、腹水發(fā)生率及門(mén)脈直徑的變化(x±s)

注與模型對(duì)照組比較，*，P＜0.05與假手術(shù)對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠體重顯著減輕，肝、脾重量及肝/體重比值與脾/體重比值的顯著增加(P＜0.01)。與模型對(duì)照組比較，”芪甘通”組的肝重、脾重、肝/體重比值及脾/體重比值均顯著降低(P＜0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1.2。
表1.2.各組大鼠體重、肝重、脾重、肝/體重比及脾/體重比的變化(x±s)

注與模型對(duì)照組比較，*，P＜0.05；**，P＜0.014.2 各組大鼠肝功能的變化與假手術(shù)對(duì)照組比較，模型對(duì)照大鼠的血清TBiL含量(均值為假手術(shù)對(duì)照組大鼠的22倍)，TBA含量、ALP、GGT、AST、ALT活性均顯著增高(P＜0.01)；Alb含量顯著降低(P＜0.01)。與模型對(duì)照大鼠比較，“芪甘通”干預(yù)組大鼠的血清TBiL，TBA含量、ALP、GGT、AST、ALT活性均顯著降低(P＜0.05)，Alb含量、A/G比值顯著升高；結(jié)果見(jiàn)表1.3、表1.4所示。
表1.3.各組大鼠血清TBil、TBA含量及ALP、GGT活性的變化(x±s)

注與模型對(duì)照組比較，**，P＜0.01；*，P＜0.05表1.4 各組大鼠血清ALT、AST活性及Alb含量、A/G比值的變化(x±s)

注與模型對(duì)照組比較，**，P＜0.01；*，P＜0.054.3 肝組織病理學(xué)變化4.3.1 HE染色假手術(shù)對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰。模型對(duì)照組大鼠肝內(nèi)小膽管大量增生，增生的膽管呈花環(huán)樣，膽管上皮細(xì)胞周圍有較多的細(xì)胞外基質(zhì)沉積；炎癥及壞死均不明顯，肝組織內(nèi)肝細(xì)胞比例明顯減少，肝細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)尚正常。與模型對(duì)照組比較，“芪甘通”組膽小管增生顯著減少，肝細(xì)胞數(shù)量較多(圖1)。“芪甘通”組膽管增生程度顯著低于模型對(duì)照組(P＜0.05)，結(jié)果見(jiàn)表1.5所示。
表1.5 各組大鼠肝組織膽管增生程度變化

天狼猩紅染色假手術(shù)組僅在匯管區(qū)和中央靜脈壁見(jiàn)少量膠原纖維。模型對(duì)照組大鼠大量增生膽管上皮細(xì)胞周圍有密集的膠原纖維沉積；肝實(shí)質(zhì)內(nèi)有少量的細(xì)胞外基質(zhì)沉積。增生的膽管周圍有密集的膠原纖維形成間隔，與臨近增生的間隔互相連接、包繞、分割肝組織而形成假小葉。與模型對(duì)照組比較，“芪甘通”組大鼠的膠原纖維沉積顯著減少；肝組織纖維化程度計(jì)分評(píng)定結(jié)果顯示，“芪甘通”組肝組織纖維化程度顯著低于模型對(duì)照組比較(P＜0.05)，結(jié)果如圖1所示、表1.6所示。
表1.6.各組大鼠膽汁性肝纖維化程度評(píng)分變化(x±s)

注與模型對(duì)照組比較，#，P＜0.001；*，P＜0.054.4 大鼠肝組織Hyp含量的變化肝組織Hyp含量在模型對(duì)照組大鼠顯著增高(P＜0.01)，為假手術(shù)對(duì)照組大鼠的4倍；”芪甘通”組顯著低于模型對(duì)照組(P＜0.05)，結(jié)果見(jiàn)表1.7所示。
表1.7.各組大鼠肝組織Hyp含量的變化(x±s)

注與模型對(duì)照組比較，**，P＜0.01；*，P＜0.054.5 免疫組織化學(xué)觀察4.5.1 大鼠肝組織LM表達(dá)的變化假手術(shù)對(duì)照組大鼠肝組織內(nèi)LM僅見(jiàn)于血管和大膽管周圍，肝竇內(nèi)不明顯。模型對(duì)照組大鼠在增生的膽管周圍LM表達(dá)顯著增加?！败胃释ā苯M的LM陽(yáng)性染色顯著低于模型對(duì)照組(P＜0.05)，結(jié)果如圖2所示、表1.8所示。
表1.8 各組大鼠肝組織LM免疫組化圖像分析的變化(x±s)

注與模型對(duì)照組比較，*，P＜0.05；#，P＜0.0014.5.2 大鼠肝組織FN表達(dá)的變化假手術(shù)對(duì)照組大鼠肝組織中FN在肝竇內(nèi)呈連續(xù)表達(dá)，在血管周圍也有陽(yáng)性染色。模型對(duì)照組FN除在肝竇內(nèi)有陽(yáng)性染色外，強(qiáng)烈地表達(dá)于增生的膽管周圍。與模型對(duì)照組比較，“芪甘通”組陽(yáng)性染色面積顯著低于模型對(duì)照組(P＜0.05)，結(jié)果如圖3所示、表1.9所示。
表1-9 各組大鼠肝組織FN免疫組化圖像分析的變化(x±s)

注與模型對(duì)照組比較，#，p＜0.001，*，P＜0.05；4.5.3 大鼠肝組織I型膠原表達(dá)的變化假手術(shù)對(duì)照組Col I在血管壁有輕度陽(yáng)性染色。模型對(duì)照組大鼠肝組織實(shí)質(zhì)內(nèi)的Col I陽(yáng)性染色增強(qiáng)，增殖的膽管上皮細(xì)胞周圍未見(jiàn)明顯陽(yáng)性染色?！败胃释ā苯M染色面積顯著低于模型對(duì)照組(P＜0.05)。結(jié)果如圖4、表1.10所示。
表1-10.各組大鼠肝組織Col I免疫組化圖象分析的變化(x±s)

注與模型對(duì)照組比較，#，P＜0.001；*，P＜0.054.5.4 大鼠肝組織IV型膠原表達(dá)的變化假手術(shù)對(duì)照組大鼠肝臟Col IV主要存在于大血管壁和膽管壁，肝竇壁呈連續(xù)弱陽(yáng)性表達(dá)。與假手術(shù)對(duì)照組大鼠相比，模型對(duì)照組大鼠肝組織肝竇壁Col IV表達(dá)未見(jiàn)明顯變化，但強(qiáng)烈表達(dá)于增殖的膽管上皮細(xì)胞周圍?！败胃释ā苯M大鼠肝組織內(nèi)Col IV染色面積顯著低于模型對(duì)照組(P＜0.05)，結(jié)果如圖5所示、表1.11所示。
表1.11 各組大鼠肝組織Col IV免疫組化圖象分析的變化(x±s)

注與模型對(duì)照組比較，#，P＜0.001；*，P＜0.054.5.5 大鼠肝組織α-SMA表達(dá)的變化假手術(shù)對(duì)照組大鼠肝臟α-SMA陽(yáng)性染色僅見(jiàn)于血管壁，肝小葉內(nèi)未見(jiàn)陽(yáng)性灶。模型對(duì)照組大鼠α-SMA陽(yáng)性染色見(jiàn)于匯管區(qū)周圍的肌成纖維細(xì)胞上，且這些肌成纖維細(xì)胞圍繞在增生的膽管上皮細(xì)胞周圍?！败胃释ā苯M大鼠肝臟α-SMA染色陽(yáng)性灶顯著少于模型對(duì)照組(P＜0.05)，結(jié)果如圖6所示、表1.12。
表1.12 各組大鼠肝組織α-SMA免疫組化圖象分析的變化(x±s)

注與模型對(duì)照組比較，#，P＜0.001；*，P＜0.054.6 透射電鏡下大鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)的變化假手術(shù)對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞內(nèi)無(wú)淤膽，膽管上皮細(xì)胞周圍少有成纖維細(xì)胞，膽管腔內(nèi)微絨毛較多，無(wú)膽栓，膽管上皮細(xì)胞周圍有少許膠原纖維。模型對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞和增生的膽管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)淤膽，管腔內(nèi)有較多的膽栓形成，微絨毛減少，膽管上皮細(xì)胞周圍有大量的膠原沉積和成纖維細(xì)胞聚集?！败胃释ā苯M大鼠膽管上皮細(xì)胞周圍成纖維細(xì)胞的聚集較少，肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞內(nèi)淤膽輕，膽管上皮細(xì)胞周圍膠原纖維沉積較少(如圖7所示，圖中A正常膽管上皮細(xì)胞周圍有少量膠原沉積；B.模型對(duì)照組膽管周圍大量ECM沉積；C.芪甘通組膽管周圍ECM沉積較少)。
4.7 大鼠肝組織PCNA表達(dá)的變化增殖性細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)于新增生細(xì)胞的胞核內(nèi)，是新增生細(xì)胞的特異性標(biāo)記，以PCNA陽(yáng)性計(jì)數(shù)增生的BEC和肝細(xì)胞。
4.7.1 大鼠肝組織內(nèi)PCNA陽(yáng)性肝細(xì)胞數(shù)的變化與假手術(shù)對(duì)照組大鼠比較，模型對(duì)照組大鼠肝組織內(nèi)PCNA陽(yáng)性肝細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著減少(P＜0.001)，為假手術(shù)對(duì)照組的11.2％；與模型對(duì)照大鼠相比，“芪甘通”組大鼠PCNA陽(yáng)性肝細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著增多(P＜0.05)；如圖8所示、表1.13所示。
4.7.2 各組大鼠肝組織PCNA陽(yáng)性膽管上皮細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化與假手術(shù)對(duì)照組大鼠比較，模型對(duì)照組大鼠肝組織PCNA陽(yáng)性膽管上皮細(xì)胞數(shù)顯著增多(照片P＜0.001)；“芪甘通”組大鼠PCNA陽(yáng)性膽管上皮細(xì)胞數(shù)較模型對(duì)照組大鼠顯著減少(P＜0.05)；結(jié)果見(jiàn)表1.13。
表1.13 PCNA陽(yáng)性肝細(xì)胞計(jì)數(shù)變化分析(x±s)


注與模型對(duì)照組相比，*，P＜0.001；**，P＜0.054.8 膽管上皮細(xì)胞Procollagen α1(IV)、PDGF-B、CTGF及TGF-β1mRNA表達(dá)量的變化4.8.1 膽管上皮細(xì)胞Procollagen α1(IV)mRNA表達(dá)量的變化Procollagen α1(IV)mRNA在假手術(shù)對(duì)照組大鼠膽管上皮細(xì)胞有微量表達(dá)，而模型大鼠膽管上皮細(xì)胞的表達(dá)量顯著增高(P＜0.001)，為假手術(shù)對(duì)照大鼠的16倍；“芪甘通”組大鼠膽管上皮細(xì)胞的表達(dá)量顯著低于模型對(duì)照大鼠(P＜0.01)，降至模型對(duì)照大鼠的31％。各組大鼠膽管上皮細(xì)胞表達(dá)Procollagen α1(IV)mRNA量的結(jié)果見(jiàn)表1.14所示。
表1.14 各組大鼠膽管上皮細(xì)胞Procollagen α1(IV)mRNA表達(dá)量的變化(x±s)

注與模型對(duì)照組比較，*，P＜0.001；**，P＜0.014.8.2 各組大鼠膽管上皮細(xì)胞表達(dá)CTGFmRNA量的變化假手術(shù)對(duì)照組大鼠膽管上皮細(xì)胞有微量CTGF mRNA表達(dá)，模型對(duì)照組大鼠膽管上皮細(xì)胞表達(dá)CTGF mRNA的量顯著增高(P＜0.001)，為假手術(shù)對(duì)照大鼠的9倍；與模型對(duì)照組大鼠比較，“芪甘通”組大鼠膽管上皮細(xì)胞表達(dá)CTGF mRNA的量顯著降低(P＜0.01)，為模型對(duì)照大鼠的26％。各組大鼠膽管上皮細(xì)胞表達(dá)CTGF mRNA量的結(jié)果見(jiàn)表1.15所示。
表1.15.各組大鼠膽管上皮細(xì)胞表達(dá)CTGF mRNA量的變化(x±s)

注與模型對(duì)照組比較，*，P＜0.001；**，P＜0.01；
4.8.3 各組大鼠膽管上皮細(xì)胞表達(dá)TGF-β1mRNA量的變化假手術(shù)對(duì)照組大鼠膽管上皮細(xì)胞有少量TGF-β1mRNA表達(dá)，模型對(duì)照組大鼠膽管上皮細(xì)胞表達(dá)TGF-β1mRNA的量顯著增高(P＜0.001)，為假手術(shù)對(duì)照大鼠的4.3倍；與模型對(duì)照大鼠比較，“芪甘通”組大鼠膽管上皮細(xì)胞表達(dá)TGF-β1mRNA的量顯著降低(P＜0.01)，各組大鼠膽管上皮細(xì)胞表達(dá)TGF-β1mRNA量的結(jié)果見(jiàn)表1.16所示。
表1.16.各組大鼠膽管上皮細(xì)胞表達(dá)TGF-β1mRNA量的變化(x±s)

注與模型對(duì)照組比較，*，P＜0.001；*，P＜0.01；5 結(jié)論“芪甘通”能有效地抑制膽管阻塞性肝纖維化大鼠的膽管增生及增生膽管上皮細(xì)胞的病理變化，抑制肝纖維化的發(fā)展。
實(shí)施例II(“芪甘通”抑制四氯化碳大鼠肝纖維化進(jìn)展的作用)1 實(shí)驗(yàn)藥物實(shí)施例1-8任一項(xiàng)制備獲得“芪甘通”干浸膏。
2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑Wistar大鼠，雄性，44只，清潔級(jí)，體重170-230g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。四氯化碳(CCl4、批號(hào)20021219)、橄欖油均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司。
3 實(shí)驗(yàn)方法3.1 模型的制備以橄欖油稀釋CCl4為50％濃度，以2ml.kg-1劑量腹部皮下注射，每周2次，共12w。
3.2 模型的分組與給藥造模第8w后，隨機(jī)取6只模型組大鼠作用藥前觀察。并將其余大鼠按完全隨機(jī)的方法分為模型對(duì)照組14只、“芪甘通”組12只。于第9周第1天起，“芪甘通”組給于“芪甘通”浸膏溶液經(jīng)口灌胃，藥物用量同實(shí)驗(yàn)一，共計(jì)4周。正常對(duì)照組、模型對(duì)照組給于同量生理鹽水經(jīng)口灌胃。于造模第12周結(jié)束，用2％戊巴比妥鈉以2ml/kg體重劑量腹腔注射麻醉，下腔靜脈采血，觀察大體形態(tài)，摘取肝、脾并稱重．3.3 肝功能、肝組織Hyp含量測(cè)定及肝組織學(xué)觀察方法同實(shí)施例I。
4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1 各組大鼠肝功能的變化與同期正常對(duì)照組大鼠比較，造模8w、12w的大鼠肝功能顯著異常，表現(xiàn)為血清ALT、AST、GGT、ALP活性及血清Tbil含量顯著增高；與12w模型對(duì)照組大鼠比較，“芪甘通”用藥組的血清ALT、AST、ALP活性有所降低，但無(wú)顯著性差異；血清GGT活性及Tbil含量顯著降低(P＜0.05)，結(jié)果見(jiàn)表2.1所示。
表2.1 CCl4肝纖維化各組大鼠肝功能的變化(x±s)

注與12w模型對(duì)照組比較，*，p＜0.01；**，p＜0.054.2 各組大鼠肝組織Hyp含量的變化與正常對(duì)照大鼠比較，12w模型對(duì)照大鼠肝組織Hyp含量顯著增加(P＜0.01)，而“芪甘通”干預(yù)治療組大鼠不但顯著低于12w模型對(duì)照組(P＜0.05)，較用藥干預(yù)治療前的8w模型對(duì)照組亦有降低的趨勢(shì)。結(jié)果見(jiàn)表2.2所示。
表2.2 各組大鼠肝組織Hyp含量的變化(x±s)

注與12w模型對(duì)照組比較，*，p＜0.01；**，p＜0.054.3 肝組織學(xué)變化8w時(shí)模型組主要表現(xiàn)出中央靜脈周區(qū)肝細(xì)胞的大面積氣球樣變、脂肪變和點(diǎn)狀壞死，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；有較細(xì)的膠原纖維自匯管區(qū)向小葉內(nèi)伸展，匯管區(qū)有明顯的小膽管增生。12周時(shí)模型組除上述病理表現(xiàn)進(jìn)一步加重，沉積的膠原纖維進(jìn)一步向小葉內(nèi)伸展，形成不完全假小葉；“芪甘通”肝內(nèi)膠原纖維化沉積較12w模型組為輕，基本上停留在8周模型組的水平，結(jié)果如圖9所示。
5 結(jié)論在造模刺激因子持續(xù)作用的情況下，“芪甘通”可以有效地改善膽汁淤積、阻止肝纖維化的進(jìn)展。
實(shí)施例III(“芪甘通”治療二甲基亞硝胺大鼠肝纖維化的作用)1 實(shí)驗(yàn)藥物實(shí)施例1-8任一項(xiàng)制備獲得“芪甘通”干浸膏。
2 動(dòng)物與試劑Wistar大鼠，雄性，44只，清潔級(jí)，體重160±15g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。二甲基亞硝胺(dimethylinittrosamine，DMN)，東京化成工業(yè)株式會(huì)社產(chǎn)品，批號(hào)MAL05。
3 實(shí)驗(yàn)方法3.1 模型制備參考Jenkins方法(Jenkins SA，Grandison A，Baxter JN，et al.Adimethylnitrosamine-induced model of cirrhosis and portal hypertension in the rat.J Hepatol 1985；1489-99.)，生理鹽水稀釋DMN為0.5％(1199生理鹽水)濃度，以2ml.kg-1劑量給大鼠作腹腔注射，每周連續(xù)3d，每天1次，共4w。
3.2 模型的分組與給藥造模結(jié)束后，取6只模型組大鼠處死取材，作用藥前觀察。并將其余大鼠完全隨機(jī)分為模型對(duì)照組16只、“芪甘通”治療組12只；“芪甘通”治療組按65kg成人體重臨床1日用量等公斤體重劑量的8倍量，10ml/kg大鼠體重的劑量灌胃，共計(jì)2w，無(wú)間斷。正常對(duì)照組與模型對(duì)照組大鼠以同體積生理鹽水行相應(yīng)處理。用藥2w后，用2％戊巴比妥鈉以2ml/kg體重劑量腹腔注射麻醉，下腔靜脈采血，觀察大體形態(tài)，摘取肝、脾并稱重.
3.3 肝功能、肝組織Hyp含量測(cè)定及肝組織學(xué)觀察方法同實(shí)施例I。
4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
4.1 DMN肝硬化大鼠體重、肝脾、腹水及死亡情況與同期正常大鼠比較，造模第2周體重開(kāi)始下降，各組體重變化同模型組。各組體重、肝體、脾體指數(shù)參見(jiàn)表3.1所示。
表3.1 各組大鼠體重、肝/體比、脾/體比的變化(x±s)

注與同期正常大鼠對(duì)照組比較，*，p＜0.01造模4w后，8只模型大鼠中有4只大鼠出現(xiàn)不同程度的腹水；6w模型對(duì)照組17只大鼠有9只出現(xiàn)大量腹水。黃芪湯組12只大鼠中出現(xiàn)腹水4只(33.3％)，P＜0.05。
4.2 各組大鼠肝功能的變化與正常大鼠比較，DMN造模4w后大鼠血清AST、ALT活性及Tbil含量均顯著增高、白蛋白含量顯著降低(P＜0.01)；終止造模2w后的第6w較4w時(shí)均有改善，但仍顯著異常；于6w模型對(duì)照組比較，“芪甘通”治療組血清AST、ALT活性有所下降，但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；而血清Tbil含量則顯著降低、白蛋白含量顯著增加(P＜0.05)。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表3.2所示。
表3.2 DMN肝纖維化各組大鼠血清肝功能的變化(x±s)

注與DMN-6w模型對(duì)照組比較，*，P＜0.01；**，P＜0.054.3 肝組織病理學(xué)變化正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰。造模4周時(shí)可見(jiàn)出血，并見(jiàn)大量腫脹肝細(xì)胞，表現(xiàn)為濁脹，胞漿疏松，匯管區(qū)明顯增寬，廣泛增生的纖維組織將原來(lái)的肝小葉分割包繞成大小不等的結(jié)節(jié)，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肝竇壁細(xì)胞增生明顯，有大量的長(zhǎng)梭形細(xì)胞附著在竇壁，竇壁增厚，甚至肝竇扭曲。6w時(shí)，纖維間隔較4w時(shí)變細(xì)而致密，肝細(xì)胞腫脹，炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肝竇內(nèi)見(jiàn)成纖維細(xì)胞附著?！败胃释ā敝委熃M對(duì)肝細(xì)胞變性、纖維增生均顯著減輕(照片)。
正常組僅在匯管區(qū)和中央靜脈壁見(jiàn)少量膠原纖維。造模4w時(shí)膠原增生明顯，纖維組織彌漫性增生并向肝小葉組織內(nèi)伸展，分割包繞肝組織，大多數(shù)形成較厚的完全間隔，正常肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂形成假小葉。6w時(shí)大鼠纖維組織增生程度減輕，纖維間隔變窄?！败胃释ā敝委熃M大鼠纖維組織增生程度減輕，纖維間隔變窄，著色淺，多為不完全間隔，肝竇內(nèi)連續(xù)性環(huán)狀膠原減少或斷續(xù)(照片)。各組大鼠膠原纖維增生程度見(jiàn)表3.3所示。
表3.2 DMN造模4周、6周大鼠及各用藥組肝臟膠原沉積半定量Riddit分析

注與DMN-6w模型對(duì)照組比較，*，P＜0.054.4 肝組織Hyp含量的變化與正常對(duì)照大鼠比較，DMN造模4w的模型大鼠肝組織Hyp含量較顯著升高(p＜0.01)，終止造模2w后的6w模型大鼠肝組織Hyp含量仍顯著高于正常組(p＜0.01)?！败胃释ā敝委熃M大鼠肝組織Hyp含量顯著低于同期模型對(duì)照組(p＜0.05)。見(jiàn)表3.3所示。
表3.3 DMN肝纖維化各組大鼠肝組織Hyp含量變化(x±s)

注與DMN-6w模型對(duì)照組比較，*，P＜0.01；**，P＜0.055 結(jié)論“芪甘通”可以有效地逆轉(zhuǎn)已經(jīng)形成的肝纖維化，促進(jìn)血清膽紅素的清除，改善肝內(nèi)膽汁淤積。
權(quán)利要求
1.一種治療膽汁淤積、肝纖維化的藥物，其特征是它是由下述重量配比的原料制成的藥劑黃芪300-900；甘草100-300；大棗100-300。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療膽汁淤積、肝纖維化的藥物，其中各原料的重量配比是黃芪400-800；甘草150-250；大棗150-250。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療膽汁淤積、肝纖維化的藥物，其中各原料的重量配比是黃芪600；甘草200；大棗200。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的治療膽汁淤積、肝纖維化的藥物，其特征是所說(shuō)的藥劑是任何一種藥劑學(xué)上所說(shuō)的劑型。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的治療膽汁淤積、肝纖維化的藥物，其特征是所說(shuō)的藥劑是膏劑或塊劑。
6.制備權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)所述治療膽汁淤積、肝纖維化的藥物的方法，其特征在于先將黃芪、甘草細(xì)碎，與大棗一起加水10倍量，浸泡2小時(shí)，煎煮30分鐘，濾過(guò)取汁；藥渣加水8倍量，煎煮1小時(shí)，濾過(guò)取汁，濃縮干燥成干膏，混合粉碎，壓片，制得膏劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療膽汁淤積、肝纖維化的藥物；具體地說(shuō)是以中草藥為原料制備的中成藥。該藥物由下述重量配比的原料制成的藥劑黃芪300－900；甘草100－300；大棗100－300。該藥物對(duì)大鼠膽汁淤積性肝纖維化、四氯化碳大鼠肝纖維化以及二甲基亞硝胺大鼠肝纖維化均顯示出改善膽汁淤積及減輕肝組織纖維化的作用，對(duì)膽管上皮細(xì)胞增殖這一慢性肝病常見(jiàn)的病理變化具有顯著抑制作用。本發(fā)明還涉及該藥物的制備方法。
文檔編號(hào)A61P1/16GK1827132SQ20051002416
公開(kāi)日2006年9月6日 申請(qǐng)日期2005年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月2日
發(fā)明者劉平, 王兵, 慕永平, 王磊, 龍愛(ài)華, 李風(fēng)華 申請(qǐng)人:上海中醫(yī)藥大學(xué)